Esta investigación fue apoyada por el Centro de Investigación Médica de la Marina, la unidad de trabajo de investigación 6000.RAD1.J.A0310. Las opiniones expresadas en este artículo son las de los autores y no reflejan necesariamente la política oficial o la posición del Departamento de la Marina, el Departamento de Defensa, o el gobierno de Estados Unidos. Wei Mei-Ching es un empleado del gobierno de Estados Unidos. Este trabajo fue preparado como parte de sus funciones oficiales. Título 17 USC §105 establece que &quot;La protección de copyright bajo este título no está disponible para toda la obra del Gobierno de los Estados Unidos. &#39; Título 17 USC § 101 define una obra gobierno de Estados Unidos como un trabajo preparado por miembro del servicio militar o empleado del gobierno de Estados Unidos como parte de las funciones oficiales de esa persona.

1. Preparar diluciones de ADN plásmido como estándar para la reacción LAMP <ol><li> Use un espectrofotómetro para medir la densidad óptica (DO) a 260 nm para determinar el plásmido (que contiene IS1111a gen diana de C. burnetii RSA 493) la concentración de ADN. Un OD 260 de 1 equivale a 50 g / l de ADN. </li><li> Convertir la cantidad de ADN plásmido en el número de copias. Dado que el tamaño del plásmido es 6330 pb, el peso molecular de este plásmido es 4,1 x 10 6 g (6.330 pb x 649 g / bp). La concentración de ADN del plásmido es 34,2 ng / l (como se determina a partir del paso 1.1). 1 l de esta muestra de ADN contiene 34,2 ng de ADN plásmido, lo que equivale a 5 x 10 9 copias (34,2 x 10 -9 g / 4,1 x 10 6 gx 6,02 x 10 23) de ADN. </li><li> Añadir 10 l de ADN plásmido (5 x 10 9 copias / l) a 90 l de agua para una dilución de 10 veces para hacer una muestra de ADN de 5 x 10 8 copias / l. </li><li> Repita el paso 1.3 para preparar muestras de ADN de 5 x 10 7, 5 x 10 6, 5 x 10 5, 5 x 10 4, 5 x 10 3, 5 x 10 2, 5 x 10 1, y 5 x 10 0 copias / l. </li></ol> 2. Prepare la plantilla de ADN de muestras para la reacción LAMP <ol><li> Extraer ADN de muestras de plasma humano usando un kit Mini comercial de ADN de acuerdo con el protocolo del fabricante. Use un total de 200 muestras l para la extracción y eluir el ADN extraído en un volumen de 20 l. </li></ol> 3. Preparar 2x tampón de reacción LAMP se <ol><li> Mezclar 200 l de 10x tampón de Pol, 320 l de 5 M trimetilglicina, 12 l de 1 M MgSO 4, 280 l de mezcla de dNTP (10 mM cada uno) y 188 l de agua para hacer 1 ml de tampón 2x LAMP. Mezcle en un vórtex durante 10 s. </li></ol> 4. Realizar la lámpara estándar de Reacción <ol><li> Mezclar 12,5 l de 2x LATampón MP (tal como se preparó en el paso 3; 40 mM Tris-HCl (pH 8,8), KCl 20 mM, 16 mM MgSO4, 20 mM (NH 4) 2 SO 4, 0,2% de Triton X-100, trimetilglicina 1,6 M, 1,4 mM mezcla dNTP), 1,2 l de mezcla de cebador, 1 l de ADN polimerasa Bst (8 U / l), y 5,3 l de agua para hacer la mezcla de reacción (20 l) en un tubo de PCR de 0,2 ml. </li><li> Añadir 5 l de ADN (del paso 1 o 2) a la mezcla de reacción de 20 l y mezclar bien. </li><li> Cerrar el tubo e incubar a 60 ° C durante 60 minutos en un baño de agua o bloque de calentamiento. Esta es la temperatura óptima de reacción previamente determinada. </li><li> Añadir 5 l de 10x tampón de carga de gel para terminar la reacción. </li><li> Cargar 5 l de productos de reacción en un gel de agarosa al 2% teñido con intercalantes colorante de ácidos nucleicos. </li><li> gel a 100 V correr durante 35 minutos en tampón 1x TBE. </li><li> Visualizar los resultados por la luz UV. </li></ol> 5. Realizar reacción LAMP con reconstituidoreactivos <ol><li> Mezclar 125 l de 10x tampón, Pol 200 l de 5 M trimetilglicina, 7,5 l de 1 M MgSO 4, 667,5 l de agua para hacer 1 ml de tampón de reconstitución. Mezcle en un vórtex durante 10 s. </li><li> Retire los tubos que contienen los reactivos liofilizados de la bolsa de papel de aluminio sellado. No utilizar los tubos si la bolsa de papel de aluminio no está cerrado o si está dañado. </li><li> Añadir 20 l de tampón de reconstitución en cada tubo para resuspender los reactivos liofilizados. </li><li> Mezclar pipeteando arriba y abajo de tampón 5 veces. Echar un vistazo para asegurarse de que los reactivos liofilizados están completamente re-suspendido. El polvo blanco debe desaparecer en el tubo. </li><li> Añadir 5 l de molde de ADN (de la etapa 1 o 2) a los reactivos reconstituidos y mezclar bien. </li><li> Cerrar el tubo e incubar a 60 ° C durante 60 minutos en un baño de agua o bloque de calentamiento. </li><li> Añadir 5 l de 10x tampón de carga de gel para terminar la reacción. </li><li> De carga 5 l de reacciónproductos a un gel de agarosa al 2% teñido con intercalantes colorante de ácidos nucleicos. </li><li> gel a 100 V correr durante 35 minutos en tampón 1x TBE. </li><li> Visualizar los resultados por la luz UV. </li></ol> 6. Realizar LAMP reacción con tampón de reconstitución que contiene HNB fluorescente o colorante intercalante <ol><li> Mezclar 125 l de 10x de Pol Buffer, 200 l de 5 M trimetilglicina, 7,5 l de 1 M MgSO 4, 7,5 l de HNB 20 mM (o 12,5 l de 100x colorante fluorescente de intercalación) y 660 l (o 655 l) de agua a hacer 1 ml de tampón de reconstitución. Mezcle en un vórtex durante 10 s. </li><li> Utilice el tampón reconstituido preparado en la sección 6 para repetir los pasos 5.2 - 5.6. </li><li> Visualizar los resultados por el ojo desnudo (de reacción que contiene HNB) o una luz UV (de reacción que contiene el colorante intercalante fluorescente). </li></ol> 7. Realizar reacción LAMP en tiempo real con escáner Tubo <ol><li> Añadir 5 l de ADN para la reconstituted reactivos que contienen colorante intercalante fluorescente, cerca del tubo y la inserta en el escáner de tubo. </li><li> Ajuste la temperatura de incubación a 60 ° C. Medir la fluorescencia a 520 nm durante 60 min. </li></ol>

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	<li>Anderson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+and+management+of+Q+fever+United+States,+2013:+recommendations+from+CDC+and+the+Q+Fever+Working+Group.">Diagnosis and management of Q fever United States, 2013: recommendations from CDC and the Q Fever Working Group.</a> MMWR Recomm. Rep. 62 (3), 1-30 (2013).</li><li>Rolain, J. M., Boulos, A., Mallet, M. N., Raoult, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+between+ratio+of+serum+doxycycline+concentration+to+MIC+and+rapid+decline+of+antibody+levels+during+treatment+of+Q+fever+endocarditis.">Correlation between ratio of serum doxycycline concentration to MIC and rapid decline of antibody levels during treatment of Q fever endocarditis.</a> Antimicrob. Agents and Chemother. 49 (7), 2673-2676 (2005).</li><li>Fournier, P. E., Raoult, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+PCR+and+serology+assays+for+early+diagnosis+of+acute+Q+fever.">Comparison of PCR and serology assays for early diagnosis of acute Q fever.</a> J. Clin. Microbiol. 41 (11), 5094-5098 (2003).</li><li>Schneeberger, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+PCR+with+serum+samples+is+indispensable+for+early+diagnosis+of+acute+Q+fever.">Real-time PCR with serum samples is indispensable for early diagnosis of acute Q fever.</a> Clin. Vaccine Immunol. 17 (2), 286-290 (2010).</li><li>Turra, M., Chang, G., Whybrow, D., Higgins, G., Qiao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+of+acute+Q+fever+by+PCR+on+sera+during+a+recent+outbreak+in+rural+South+Australia.">Diagnosis of acute Q fever by PCR on sera during a recent outbreak in rural South Australia.</a> Ann. N Y Acad. Sci. 1078, 566-569 (2006).</li><li>Notomi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification+of+DNA.">Loop-mediated isothermal amplification of DNA.</a> Nucleic Acids Res. 28 (12), (2000).</li><li>Paris, D. H., Blacksell, S. D., Newton, P. N., Day, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple,+rapid+and+sensitive+detection+of+Orientia+tsutsugamushi.+by+loo-isothermal+DNA+amplification.">Simple, rapid and sensitive detection of Orientia tsutsugamushi. by loo-isothermal DNA amplification.</a> Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 102 (12), 1239-1246 (2008).</li><li>Huber, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification+assay+targeting+the+47-kDa+gene+of+Orientia+tsutsugamushi.:+A+rapid+and+sensitive+alternative+to+real-time+PCR.">Loop-mediated isothermal amplification assay targeting the 47-kDa gene of Orientia tsutsugamushi.: A rapid and sensitive alternative to real-time PCR.</a> J. Med. Microb. Diagn. 1 (112), (2012).</li><li>Pan, L., Zhang, L., Wang, G., Liu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid,+sensitive+detection+of+the+ompB+gene+of+spotted+fever+group+rickettsiae+by+loop-mediated+isothermal+amplification.">Rapid, sensitive detection of the ompB gene of spotted fever group rickettsiae by loop-mediated isothermal amplification.</a> BMC Infect. Dis. 12 (254), (2012).</li><li>Mori, Y., Nagamine, K., Tomita, N., Notomi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+loop-mediated+isothermal+amplification+reaction+by+turbidity+derived+from+magnesium+pyrophosphate+formation.">Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 289 (1), 150-154 (2001).</li><li>Qiao, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification+for+rapid+detection+of+Bacillus+anthracis.spores.">Loop-mediated isothermal amplification for rapid detection of Bacillus anthracis.spores.</a> Biotechnol. Lett. 29 (12), 1939-1946 (2007).</li><li>Tomita, N., Mori, Y., Kanda, H., Notomi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification+(LAMP)+of+gene+sequences+and+simple+visual+detection+of+products.">Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products.</a> Nat. Protoc. 3 (5), 877-882 (2008).</li><li>Thekisoe, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+of+Loop-Mediated+Isothermal+Amplification+(LAMP)+reagents+and+its+amplification+efficiency+on+crude+trypanosome+DNA+templates.">Stability of Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) reagents and its amplification efficiency on crude trypanosome DNA templates.</a> J. Vet. Med. Sci. 71 (4), 471-475 (2009).</li><li>Chen, H. W., Ching, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+loop-mediated+isothermal+amplification+assays+for+rapid+and+easy+detection+of+Coxiella+Burnetii.">Development of loop-mediated isothermal amplification assays for rapid and easy detection of Coxiella Burnetii.</a> J. Microbiol Methods. 107, 176-181 (2014).</li><li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparison+of+In-House+Real-Time+LAMP+Assays+with+a+Commercial+Assay+for+the+Detection+of+Pathogenic+Bacteria.">A Comparison of In-House Real-Time LAMP Assays with a Commercial Assay for the Detection of Pathogenic Bacteria.</a> Molecules. 20 (6), 9487-9495 (2015).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Anteriormente, hemos desarrollado un ensayo de lámpara sensible y específico de orientación del elemento de inserción 14 IS1111a. El elemento IS1111 fue seleccionado porque es muy conservadas entre las diferentes cepas de C. burnetii y su alto número de copias (7-110) en la bacteria (Klee 2006). Nuestros resultados muestran que la lámpara puede detectar aproximadamente 25 copias del elemento IS1111, que puede correlacionarse con tan poco como una copia cromosómica del ADN Coxiella. En este estudio, el ADN polimerasa Bst, cebadores de la lámpara y dNTPs fueron liofilizados y envasados ​​en una bolsa de papel de aluminio con cremallera. La sensibilidad de estos reactivos liofilizados se mantiene en 25 copias; similar a los reactivos recién preparados para al menos un mes cuando se almacena a temperatura ambiente. Es muy importante asegurarse de que la bolsa de papel de aluminio está sellado correctamente antes de abrirlo. No utilizar los tubos si la bolsa de papel de aluminio no está cerrado o si está dañado. Esto puede causar la rehidratación of los reactivos liofilizados que conduce a la pérdida de su reactividad. El otro paso crítico es la resuspensión de los reactivos liofilizados con tampón de reconstitución. La reacción LAMP no funcionará correctamente con reactivos que no están totalmente re-suspendidas. Debido a las altas concentraciones de sal del tampón de reacción y de alta viscosidad de la solución trimetilglicina, no pueden ser liofilizadas con éxito con ADN polimerasa Bst, los cebadores de LAMP, y dNTPs. Un paso especial se requiere para preparar el tampón de reconstitución con esos componentes. Potencialmente la reacción LAMP se puede probar a bajas concentraciones de sal de baja o nula trimetilglicina. Si hay una condición de reacción que tiene la misma sensibilidad de detección pero con baja sal y baja concentración trimetilglicina, el reactivo liofilizado sólo necesita ser reconstituido con agua. Esto simplificará aún más las etapas de reacción. Recientemente, Wang et al. 15 en comparación doce enLos ensayos de LAMP -house con el kit comercializado isotérmica Master Mix y ha encontrado los ensayos in-house tienen resultados positivos falsos. En nuestro laboratorio, hemos desarrollado varios ensayos lámpara para la detección de bacterias diferentes y nunca hemos encontrado resultados falsos positivos en estos ensayos in-house. Por otra parte, en las etapas iniciales del desarrollo del método LAMP, los ensayos fueron probados con tanto internamente mezcla maestra preparada y comercializada mezcla maestra y no se observó ninguna diferencia en la sensibilidad y especificidad de los ensayos. Nuestro estudio también presenta varios métodos que no sólo pueden detectar los productos de LAMP sin necesidad de abrir los tubos de reacción para disminuir la probabilidad de contaminación cruzada de laboratorio, pero también tienen un tiempo de proceso más corto para leer resultados se comparan con el método de electroforesis en gel. La ventaja de utilizar estos métodos de detección mejorará en gran medida nuestra capacidad para realizar rápidamente el ensayo y el diagnóstico de un individuo con C. burnetii </em&gt; infección en las áreas de recursos limitados. Esto permitirá un tratamiento rápido y adecuado de la fiebre Q aguda y reducir la posibilidad de infección crónica futuro. A diferencia de los métodos basados ​​en la PCR que se necesita un termociclador, un bloque de calentamiento, baño maría o incubadora se mantiene una temperatura constante alrededor de 60 ° C es todo lo que se requiere para el ensayo de LAMP. Esto hace que el ensayo particularmente adecuado en entorno de recursos limitados. A diferencia del ensayo original de LAMP, Bst ADN polimerasa, cebadores de LAMP, y dNTPs necesitar ser almacenados a -20 ° C. Estos reactivos liofilizados pueden almacenarse a temperatura ambiente que hace que sea aún más útil para un entorno de recursos limitados donde la fiebre Q es endémica. El estudio de estabilidad a largo plazo de los reactivos liofilizados a 4 ° C, 25 ° C y 37 ° C se encuentra actualmente en curso. En el futuro, nos gustaría demostrar que este ensayo LAMP utilizando reactivos liofilizados puede detectar C. burnetii con sensibilidad similar a lade PCR en un lugar remoto.

La pequeña bacteria Gram-negativa Coxiella burnetii es el agente causante de la fiebre Q, que es una zoonosis en todo el mundo. Debido a la distribución mundial de la fiebre Q y la alta infectividad de C. burnetii, personal militar y civil de Estados Unidos desplegadas en el extranjero están en riesgo de ser infectados en las áreas endémicas. La fiebre Q se manifiesta en dos formas: infecciones agudas y crónicas. La fiebre Q aguda se presenta con síntomas similares a la gripe, hepatitis, o la neumonía, y suele ser una enfermedad autolimitada con una baja tasa de mortalidad. Q-fiebre crónica, mientras que menos frecuente, a menudo resulta en endocarditis, que tiene una tasa de mortalidad mucho más alta si se deja sin tratamiento 1,2. Por lo tanto, el diagnóstico precoz para guiar un tratamiento adecuado es fundamental para el cuidado del paciente. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) se han desarrollado ensayos para la detección de C. ADN burnetii en cultivos celulares y muestras clínicas 3-5 &lt;/ Sup&gt;. Tanto PCR y qPCR son costosos ya menudo no es fácilmente disponible en las zonas con recursos limitados para el trabajo de rutina. Originalmente descrito por Notomi 6, amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) ofrece un método de amplificación de ADN alternativo. Lámpara utiliza ADN polimerasa Bst para la síntesis de ADN de desplazamiento de cadena junto con conjuntos de cebadores especialmente diseñados que reconocen al menos seis regiones independientes del gen diana. La ventaja más significativa de LAMP es que la amplificación se produce en condiciones isotérmicas. Por lo tanto, sólo se requiere un baño de agua, calentador o una incubadora. Este método ha sido utilizado para detectar varios patógenos rickettsias 7-9. La visualización de los productos de ADN amplificados por electroforesis en gel es el método más preciso que puede diferenciar verdaderos positivos de falsos positivos debido a la amplificación no específica. Sin embargo, los procedimientos involucrados en la electroforesis en gel no son prácticos para ar de recursos limitadosEAS. Varios métodos alternativos han sido desarrollados para detectar los productos de reacción. Estos alternativa, como turbidez derivado de la formación de pirofosfato de magnesio 10 o el uso de un colorante intercalante fluorescente para ser visualizado con luz UV 11,12 son más favorables que la ejecución de un gel. Los reactivos de LAMP fueron estables durante un mes cuando se almacenaron a 25 ° C y 37 ° C, que son las temperaturas ambiente en los países tropicales y subtropicales donde la fiebre Q es endémica 13. Un ensayo de lámpara fue desarrollado en nuestro laboratorio para detectar la presencia de C. burnetii en muestras de plasma 14. Aquí se describe un protocolo sencillo para la preparación de la mezcla de reacción LAMP a partir de los reactivos liofilizados. Los reactivos liofilizados son estables durante un mes cuando se almacena a temperatura ambiente. Cuando se combina con un método de visualización fácil, esto es un método ideal para usar para la detección de C. burnetii en un entorno de recursos limitados.

<table><tbody><tr><td>LAMP primers</td><td>Eurofins MWG operon</td><td>10 nmol, salt free</td><td>Sequence designed by customer</td></tr><tr><td>Bst DNA polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0275L</td><td>8 units/ml</td></tr><tr><td>10x Thermo pol buffer</td><td>New England Biolabs</td><td>B9004S</td><td></td></tr><tr><td>dNTP mixture</td><td>New England Biolabs</td><td>N0447L</td><td>10 mM each</td></tr><tr><td>Betaine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0300</td><td>5 M, Trimethylglycine</td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3409-1ML</td><td>1 M</td></tr><tr><td>10x Bluejuice</td><td>Invitrogen</td><td>10816-015</td><td>gel loading buffer</td></tr><tr><td>SYBR green</td><td>Invitrogen</td><td>S7585</td><td>10,000x, visualize products in tubes</td></tr><tr><td>GelRed</td><td>Phenix Research Products</td><td>RGB-4103</td><td>10,000x, visualize products in gels</td></tr><tr><td>Lyophilized reagents</td><td>Gene Reach</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hydroxynaphthol blue</td><td>Fluka</td><td>33936-10G</td><td></td></tr><tr><td>ESEQuant tube scanner</td><td>Qiagen</td><td></td><td>real-time detection</td></tr></tbody></table>

the development of lyophilized loop-mediated isothermal amplification reagents for the detection of coxiella burnetii

Coxiella burnetii, el agente que causa la fiebre Q, es una bacteria intracelular obligado. Ensayos de diagnóstico basado en la PCR se han desarrollado para la detección de C. ADN burnetii en cultivos celulares y muestras clínicas. PCR requiere un equipo especializado y una amplia formación de usuario final, y por lo tanto, no es adecuado para el trabajo de rutina especialmente en un área de recursos limitados. Hemos desarrollado un ensayo de amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) para detectar la presencia de C. burnetii en muestras de pacientes. Este método se realiza a una única temperatura de alrededor de 60 ° C en un baño de agua o un bloque de calentamiento. La sensibilidad de este ensayo LAMP es muy similar a la PCR con un límite de detección de aproximadamente 25 copias por reacción. Este informe describe la preparación de la reacción usando reactivos liofilizados y visualización de los resultados utilizando azul de hidroxinaftol (HNB) o una lámpara de UV con colorante intercalante fluorescente en la reacción. Los reactivos de LAMP fueron lyophilizeta y se almacena a temperatura ambiente (RT) durante un mes, sin pérdida de sensibilidad de detección. Este ensayo LAMP es particularmente robusto porque la preparación de la mezcla de reacción no implica pasos complejos. Este método es ideal para su uso en entornos con recursos limitados donde la fiebre Q es endémica.

Los reactivos liofilizados de LAMP en el interior del tubo de 0,2 ml contiene ADN polimerasa Bst, cebadores y dNTPs. 20 l de tampón de reconstitución se utiliza para volver a suspender los reactivos liofilizados. La figura 1 muestra los resultados de la reacción de lámpara en geles de agarosa con reactivos recién preparados y reactivos liofilizados. El reactivo liofilizado no reduce su actividad. LAMP reacciones preparados por ambos reactivos puede detectar 25 copias de plantilla de ADN. La Figura 2 muestra la detección de los productos de reacción con HNB o colorante intercalante fluorescente presente en la reacción. La adición de HNB a la reacción produce un cambio de color visual de púrpura a azul con 25, 50 y 100 copias de molde de ADN presentes en las reacciones. La inclusión de colorante intercalante fluorescente en la reacción muestra una señal de fluorescencia fuerte con la luz UV cuando 25, 50 y 100 copias de moldes de ADN están presentes. Se utilizó un escáner de tuboen este estudio para la detección en tiempo real. Esta máquina puede realizar 8 reacciones simultáneamente. La Figura 3 muestra utilizando el escáner de tubo para controlar las señales de fluorescencia en tiempo real, con presencia colorante intercalante fluorescente. Las señales de fluorescencia están por encima de la línea de base después de 14, 18, ​​21, y 23 min con 10 6, 10 4, 10 3, y 100 copias de molde de ADN en las reacciones. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53839/53839fig1.jpg" /> Figura 1. Resultados de LAMP en gel de agarosa con reactivos recién preparados (A) y los reactivos liofilizados (B). Las mezclas de reacción se incubaron a 60 ° C durante 60 minutos. (A) Carril 1, 100 pb escalera; Carril 2 - 3, 4 - 5, 6 - 7 y 8 - 9 son reacciones con 2,5 x 10 3, 2,5 x 10 2, 2.5 x 10, y no hay copias de ADN plásmido. (B) Carril 10 - 11, 12 - 13, 14 - 15, y 16 - 17 son reacciones con 2,5 x 10 x 3, 2.5 10 2, 2.5 x 10, y 0 copias de ADN plásmido. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53839/53839fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53839/53839fig2.jpg" /> Figura 2. Métodos para detectar productos de la lámpara. HNB (A) o colorante intercalante fluorescente (B) se utiliza para detectar productos de la lámpara. Las reacciones se llevaron a cabo a 60 ° C durante 60 min. Carril 1 a 5, reacciones con 0, 10, 25, 50 y 100 copias del plásmido. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53839/53839fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/53839/53839fig3.jpg" /> Figura 3. </strong&gt; Detección en tiempo real de la lámpara de los productos. Las reacciones se llevaron a cabo a 60 ° C durante 60 minutos. Las reacciones con 10 6 copias de plásmido (negro), 10 4 (rojo), 10 3 (verde), 100 (amarillo), 10 (azul), 1 (naranja) y 0 (marrón y marrón claro). Tres detecciones se realizaron de forma independiente. Ellos fueron altamente reproducible. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53839/53839fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

El desarrollo de la mediación de la Loop liofilizada amplificación isotérmica reactivos para la detección de<em&gt; Coxiella burnetii</em

We described here a simple loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method using lyophilized reagents for the detection of C. burnetii in patient samples.

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

10.4K vistas.  Naval Medical Research Center. We described here a simple loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method using lyophilized reagents for the detection of C. burnetii in patient samples.

Video: The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

A Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assay for Rapid Identification of Bemisia tabaci

The whitefly Bemisia tabaci (Gennadius) is an invasive pest of considerable importance, affecting the production of vegetable and ornamental crops in many countries around the world. Severe yield losses are caused by direct feeding, and even more importantly, also by the transmission of more than 100 harmful plant pathogenic viruses. As for other invasive pests, increased international trade facilitates the dispersal of B. tabaci to areas beyond its native range. Inspections of plant import products at points of entry such as seaports and airports are, therefore, seen as an important prevention measure. However, this last line of defense against pest invasions is only effective if rapid identification methods for suspicious insect specimens are readily available. Because the morphological differentiation between the regulated B. tabaci and close relatives without quarantine status is difficult for non-taxonomists, a rapid molecular identification assay based on the loop-mediated isothermal amplification (LAMP) technology has been developed. This publication reports the detailed protocol of the novel assay describing rapid DNA extraction, set-up of the LAMP reaction, as well as interpretation of its read-out, which allows identifying B. tabaci specimens within one hour. Compared to existing protocols for the detection of specific B. tabaci biotypes, the developed method targets the whole B. tabaci species complex in one assay. Moreover the assay is designed to be applied on-site by plant health inspectors with minimal laboratory training directly at points of entry. Thorough validation performed under laboratory and on-site conditions demonstrates that the reported LAMP assay is a rapid and reliable identification tool, improving the management of B. tabaci.

A Loop-mediated Isothermal Amplification LAMP Assay for Rapid Identification of Bemisia tabaci

This paper reports the protocol for a rapid identification assay for Bemisia tabaci based on loop-mediated isothermal amplification (LAMP) technology. The protocol requires minimal laboratory training and can, therefore, be implemented on-site at points of entry for plant imports such as seaports and airports.

Un ensayo de amplificación isotérmica (lámpara) mediada por el lazo para identificación rápida de Bemisia tabaci

The whitefly Bemisia tabaci (Gennadius) is an invasive pest of considerable importance, affecting the production of vegetable and ornamental crops in many ...

Investigación

Medio ambiente

Detection of Phytophthora capsici in Irrigation Water using Loop-Mediated Isothermal Amplification

Phytophthora capsici is a devastating oomycete pathogen that affects many important solanaceous and cucurbit crops causing significant economic losses in vegetable production annually. Phytophthora capsici is soil-borne and a persistent problem in vegetable fields due to its long-lived survival structures (oospores and chlamydospores) that resist weathering and degradation. The main method of dispersal is through the production of zoospores, which are single-celled, flagellated spores that can swim through thin films of water present on surfaces or in water-filled soil pores and can accumulate in puddles and ponds. Therefore, irrigation ponds can be a source of the pathogen and initial points of disease outbreaks. Detection of P. capsici in irrigation water is difficult using traditional culture-based methods because other microorganisms present in the environment, such as Pythium spp., usually overgrow P. capsici making it undetectable. To determine the presence of P. capsici spores in water sources (irrigation water, runoff, etc.), we developed a hand pump-based filter paper (8-10 &#181;m) method that captures the pathogen&#8217;s spores (zoospores) and is later used to amplify the pathogen&#8217;s DNA through a novel loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay designed for the specific amplification of P. capsici. This method can amplify and detect DNA from a concentration as low as 1.2 x 102 zoospores/mL, which is 40 times more sensitive than conventional PCR. No cross-amplification was obtained when testing closely related species. LAMP was also performed using a colorimetric LAMP master mix dye, displaying results that could be read with the naked eye for on-site rapid detection. This protocol could be adapted to other pathogens that reside, accumulate, or are dispersed via contaminated irrigation systems.

Detection of Phytophthora capsici in Irrigation Water using Loop-Mediated Isothermal Amplification

We developed a method to detect Phytophthora capsici zoospores in water sources using a filter paper DNA extraction method coupled with a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay that can be analyzed in the field or in the lab.

Detección de Phytophthora capsici en agua de riego mediante amplificación isotérmica mediada por bucle

Phytophthora capsici is a devastating oomycete pathogen that affects many important solanaceous and cucurbit crops causing significant economic losses in ...

Antibody Profiling by Luciferase Immunoprecipitation Systems (LIPS)

Technologies for comprehensively understanding and quantifying antibody profiles to autoantigens and infectious agents may yield new insights into disease mechanisms and may elucidate new markers to substratify disease with different clinical features and better understand pathogenesis. We have developed a highly quantitative method called Luciferase Immunoprecipitation Systems (LIPS) for profiling patient sera antibody responses to autoantigens and pathogen antigens associated with infection. Unlike ELISAs, the highly sensitive LIPS is easily implemented to survey humoral serological response profiles to different antigens in a universal format and produces dynamic antibody titer ranges up to 6 log10 for some antigens. In these studies, quantitative profiling by LIPS of patient humoral responses against panels of antigens or even the entire proteome of some pathogens (i.e. HIV), is typically more informative than testing a single antigen by ELISA. In addition, LIPS also eliminates time and effort needed to produce highly purified antigens as well as the labor-intensive assay optimization steps needed for standard ELISAs. Here we provide a detailed protocol describing the technical aspects of performing LIPS assays for readily profiling antibody responses to single or multiple antigens.

Antibody Profiling by Luciferase Immunoprecipitation Systems LIPS

The technical aspects of performing LIPS (Luciferase Immunoprecipitation Systems) are described. The overall approach involves expressing chimeric genes encoding antigens fused to Renilla luciferase (Ruc) in mammalian cells. Crude Ruc-antigen extracts are then prepared and, without purification, employed in immunoprecipitation assays to quantify antibodies.

Perfiles de anticuerpos por los sistemas de inmunoprecipitación luciferasa (LIPS)

Technologies for comprehensively understanding and quantifying antibody profiles to autoantigens and infectious agents may yield new insights into disease ...

Biología

Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the absence of effective control clinical coccidiosis can be devastating. Resistance to the chemoprophylactics frequently used to control Eimeria is common and sub-clinical infection is widespread, influencing feed conversion ratios and susceptibility to other pathogens such as Clostridium perfringens. Despite the availability of polymerase chain reaction (PCR)-based tools, diagnosis of Eimeria infection still relies almost entirely on traditional approaches such as lesion scoring and oocyst morphology, but neither is straightforward. Limitations of the existing molecular tools include the requirement for specialist equipment and difficulties accessing DNA as template. In response a simple field DNA preparation protocol and a panel of species-specific loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assays have been developed for the seven Eimeria recognised to infect the chicken. We now provide a detailed protocol describing the preparation of genomic DNA from intestinal tissue collected post-mortem, followed by setup and readout of the LAMP assays. Eimeria species-specific LAMP can be used to monitor parasite occurrence, assessing the efficacy of a farm&#8217;s anticoccidial strategy, and to diagnose sub-clinical infection or clinical disease with particular value when expert surveillance is unavailable.

Loop-mediated Isothermal Amplification LAMP Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Diagnosis of Eimeria infection in chickens remains demanding. Parasite morphology- and host pathology-led approaches are commonly inconclusive, while molecular approaches based on PCR have proven demanding in cost and expertise. The aim of this protocol is to establish loop-mediated isothermal amplification (LAMP) as a straightforward molecular diagnostic for eimerian infection.

Isotérmico de amplificación (LAMP) Ensayos Loop mediada para la detección específica de las especies de<em&gt; Eimeria</em&gt; Que infectan pollos

Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the ...

Inmunología e Infección

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence factors, which can subvert and manipulate key host functions. The study of host/pathogen interactions is therefore extremely important to understand bacterial infections and develop alternative strategies to counter infectious diseases. This approach however, requires the development of new high-throughput assays for the unbiased, automated identification and characterization of bacterial virulence determinants. Here, we describe a method for the generation of a GFP-tagged mutant library by transposon mutagenesis and the development of high-content screening approaches for the simultaneous identification of multiple transposon-associated phenotypes. Our working model is the intracellular bacterial pathogen Coxiellaburnetii, the etiological agent of the zoonosis Q fever, which is associated with severe outbreaks with a consequent health and economic burden. The obligate intracellular nature of this pathogen has, until recently, severely hampered the identification of bacterial factors involved in host pathogen interactions, making of Coxiella the ideal model for the implementation of high-throughput/high-content approaches.

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii is an obligate intracellular Gram-negative bacterium responsible for the zoonotic disease Q fever. Here we describe methods for the generation of Coxiella fluorescent transposon mutants as well as the automated identification and analysis of the resulting internalization, replication and cytotoxic phenotypes.

Generación y multi-fenotípicos cribado de alto contenido de<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; transposón mutantes

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a replicative niche. A cohort of effectors are translocated through this system into the host cell to manipulate host processes and allow the establishment of a unique lysosome-derived vacuole for replication. The method presented here involves the combination of two well-established techniques: specific gene silencing using siRNA and measurement of effector translocation using a FRET-based substrate that relies on &#946;-lactamase activity. Applying these two approaches, we can begin to understand the role of host factors in bacterial secretion system function and effector translocation. In this study we examined the role of Rab5A and Rab7A, both important regulators of the endocytic trafficking pathway. We demonstrate that silencing the expression of either protein results in a decrease in effector translocation efficiency. These methods can be easily modified to examine other intracellular and extracellular pathogens that also utilize secretion systems. In this way, a global picture of host factors involved in bacterial effector translocation may be revealed.

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Investigating the interactions between bacterial pathogens and their hosts is an important area of biological research. Here, we describe the necessary techniques to measure effector translocation by Coxiella burnetii during siRNA gene silencing using BlaM substrate.

La aplicación de fluorescencia la transferencia de energía de resonancia (FRET) para examinar la eficiencia de efector por translocación<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Durante siRNA silenciamiento

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a ...

Visual Detection of Multiple Nucleic Acids in a Capillary Array

Multi-target, short time, and resource-affordable methodologies for the detection of multiple nucleic acids in a single, easy to operate test are urgently needed in disease diagnosis, microbial monitoring, genetically modified organism (GMO) detection, and forensic analysis. We have previously described the platform called CALM (Capillary Array-based Loop-mediated isothermal amplification for Multiplex visual detection of nucleic acids). Herein, we describe improved fabrication and performance processes for this platform. Here, we apply a small, ready-to-use cassette assembled by capillary array for multiplex visual detection of nucleic acids. The capillary array is pre-treated into a hydrophobic and hydrophilic pattern before fixing loop-mediated isothermal amplification (LAMP) primer sets in capillaries. After assembly of the loading adaptor, LAMP reaction mixture is loaded and isolated into each capillary, due to capillary force by a single pipetting step. The LAMP reactions are performed in parallel in the capillaries. The results are visually read out by illumination with a hand-held UV flashlight. Using this platform, we demonstrate monitoring of 8 frequently appearing elements and genes in GMO samples with high specificity and sensitivity. In summary, the platform described herein is intended to facilitate the detection of multiple nucleic acids. We believe it will be widely applicable in fields where high-throughput nucleic acid analysis is required.

This protocol describes the fabrication of a small, ready-to-use cassette that can be applied for visual detection of multiple nucleic acids in a single, test that is easy to operate. In this approach, a capillary array was used for multiplex and highly efficient detection of GMO targets.

Detección visual de los ácidos nucleicos múltiples en un arreglo de capilares

Multi-target, short time, and resource-affordable methodologies for the detection of multiple nucleic acids in a single, easy to operate test are urgently ...

Bioingeniería

Optimized PCR-based Detection of Mycoplasma

The maintenance of contamination-free cell lines is essential to cell-based research. Among the biggest contaminant concerns are mycoplasma contamination. Although mycoplasma do not usually kill contaminated cells, they are difficult to detect and can cause a variety of effects on cultured cells, including altered metabolism, slowed proliferation and chromosomal aberrations. In short, mycoplasma contamination compromises the value of those cell lines in providing accurate data for life science research.
The sources of mycoplasma contamination in the laboratory are very challenging to completely control. As certain mycoplasma species are found on human skin, they can be introduced through poor aseptic technique. Additionally, they can come from contaminated supplements such as fetal bovine serum, and most importantly from other contaminated cell cultures. Once mycoplasma contaminates a culture, it can quickly spread to contaminate other areas of the lab. Strict adherence to good laboratory practices such as good aseptic technique are key, and routine testing for mycoplasma is highly recommended for successful control of mycoplasma contamination.
PCR-based detection of mycoplasma has become a very popular method for routine cell line maintenance. PCR-based detection methods are highly sensitive and can provide rapid results, which allows researchers to respond quickly to isolate and eliminate contamination once it is detected in comparison to the time required using microbiological techniques. The LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit is highly sensitive, with a detection limit of only 2 genomes per &mu;l. Taking advantage of the highly specific JumpStart Taq DNA Polymerase and a proprietary primer design, false positives are greatly reduced. The convenient 8-tube format, strips pre-coated with dNTPs, and associated primers helps increase the throughput to meet the needs of customers with larger collections of cell lines.
Given the extreme sensitivity of the kit, great care must be taken to prevent inadvertent contamination of samples and reagents. The step-by-step protocol we demonstrate highlights the precautions and practices required for reliable mycoplasma detection. We also show and discuss typical results and their interpretation. Our goal is to ensure the success of researchers using the LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit.

The LookOut Mycoplasma PCR Detection Kit utilizes the polymerase chain reaction (PCR), which is established as the method of choice for highest sensitivity in the detection of Mycoplasma, Acholeplasma, and Ureaplasma contamination in cell cultures and other cell culture derived biologicals.

PCR optimizado basado en la detección de Mycoplasma

The maintenance of contamination-free cell lines is essential to cell-based research. Among the biggest contaminant concerns are mycoplasma contamination. ...

Diagnóstico de la infección bacteriana respiratoria humana mediante amplificación isotérmica

Rapid Detection of Bacterial Pathogens Causing Lower Respiratory Tract Infections via Microfluidic-Chip-Based Loop-Mediated Isothermal Amplification

Respiratory tract infections (RTIs) are among the most common problems in clinical settings. Rapid and accurate identification of bacterial pathogens will provide practical guidelines for managing and treating RTIs. This study describes a method for rapidly detecting bacterial pathogens that cause respiratory tract infections via multi-channel loop-mediated isothermal amplification (LAMP). LAMP is a sensitive and specific diagnostic tool that rapidly detects bacterial nucleic acids with high accuracy and reliability. The proposed method offers a significant advantage over traditional bacterial culturing methods, which are time-consuming and often require greater sensitivity for detecting low levels of bacterial nucleic acids. This article presents representative results of K. pneumoniae infection and its multiple co-infections using LAMP to detect samples (sputum, bronchial lavage fluid, and alveolar lavage fluid) from the lower respiratory tract. In summary, the multi-channel LAMP method provides a rapid and efficient means of identifying single and multiple bacterial pathogens in clinical samples, which can help prevent the spread of bacterial pathogens and aid in the appropriate treatment of RTIs.

Autor destacado: Avance en la detección rápida de patógenos respiratorios mediante chip microfluídico 

Various bacterial pathogens can cause respiratory tract infections and lead to serious health issues if not detected accurately and treated promptly. Rapid and accurate detection of these pathogens via&#160;loop-mediated isothermal amplification provides effective management and control of respiratory tract infections in clinical settings.

Detección rápida de patógenos bacterianos que causan infecciones del tracto respiratorio inferior a través de la amplificación isotérmica mediada por bucle basada en chips microfluídicos

Respiratory tract infections (RTIs) are among the most common problems in clinical settings. Rapid and accurate identification of bacterial pathogens will ...

El desarrollo de la mediación de la Loop liofilizada amplificación isotérmica reactivos para la detección de

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Un ensayo de amplificación isotérmica (lámpara) mediada por el lazo para identificación rápida de Bemisia tabaci

Detección de Phytophthora capsici en agua de riego mediante amplificación isotérmica mediada por bucle

Perfiles de anticuerpos por los sistemas de inmunoprecipitación luciferasa (LIPS)

Isotérmico de amplificación (LAMP) Ensayos Loop mediada para la detección específica de las especies de

Generación y multi-fenotípicos cribado de alto contenido de

La aplicación de fluorescencia la transferencia de energía de resonancia (FRET) para examinar la eficiencia de efector por translocación

Detección visual de los ácidos nucleicos múltiples en un arreglo de capilares

PCR optimizado basado en la detección de Mycoplasma

Detección rápida de patógenos bacterianos que causan infecciones del tracto respiratorio inferior a través de la amplificación isotérmica mediada por bucle basada en chips microfluídicos

Detección rápida de patógenos bacterianos que causan infecciones del tracto respiratorio inferior a través de la amplificación isotérmica mediada por bucle basada en chips microfluídicos