The project was supported by Award AAES 461Hatch/Multistate Grants ALA08-045 and ALA015-1-10026 to N.L.

1. Preparazione degli strumenti, stimoli Solutions, e Bed Bugs <ol><li> Preparare una soluzione al 50% KNO 2 (w / v) in un flacone da 20 ml. </li><li> Affilare due microelettrodi di tungsteno in soluzione KNO 2 a 5 V ripetutamente immergendo gli elettrodi di tungsteno in e fuori della soluzione. <ol><li> Circa affilare il filo di tungsteno mediante immersione di circa 10 mm di filo di tungsteno in e fuori della soluzione KNO 2 alla velocità di 2 salse / sec per circa 5 minuti, che può notevolmente consumare l&#39;estremità anteriore del filo di tungsteno. </li><li> Delicatamente affinare l&#39;elettrodo immergendo circa 1 mm della punta del filo e dalla soluzione alla velocità di 2 salse / sec per almeno 1 minuto in modo da rendere un punto dell&#39;elettrodo fine e tagliente. Verificare il diametro punta dell&#39;elettrodo sotto il microscopio spesso fino a raggiungere 0.2-0.5 micron, che dovrebbe essere abbastanza bene per forare la cuticola di bug letto sensillum olfattiva. Nota: Durante manualmente taglientezare l&#39;elettrodo, la velocità di immersione del filo di tungsteno nella soluzione KNO 2 non è costante per tutto il tempo. Con più pratica, è molto più facile da mantenere una velocità relativamente costante affilatura dell&#39;elettrodo. Il tempo di affilatura è anche incerta a seconda di quanto bene l&#39;elettrodo dovrebbe essere. Qui, un elettrodo con il diametro di ~ 0,2 micron è sufficiente per perforare attraverso il sensillum olfattiva. </li></ol></li><li> Diluire ciascun stimoli chimici in dimetilsolfossido (DMSO) dal composto pulito per una concentrazione iniziale di 1:10 v / v in soluzione madre. Creare una serie di diluizioni decadici seconda di quanti dosi necessarie nell&#39;esperimento, sempre con DMSO, da ciascuna delle soluzioni madre per ogni sostanza chimica. Qui, utilizzare 10% (+) - β-pinene e eucaliptolo. </li><li> Posizionare i giorni digiuni o sette post-alimentazione cimici adulto (maschio o femmina) dal Ft. Dix colonia (un dono del Dr. Haynes in Università del Kentucky) da utilizzare in tegli sperimentare in una capsula di Petri. Nota: Non esiste un numero esatto di cimici collocate nella scatola di Petri. Può essere pochi o molti. </li></ol> 2. Bed Bug Antenne Preparazione <ol><li> Anestetizzare le cimici in ghiaccio (2-3 minuti). </li><li> Fissare sia le antenne e il corpo degli insetti su un vetrino da microscopio con nastro biadesivo e rimuovere le gambe con le forbici sottili. </li><li> Utilizzare un piccolo spillo per toccare delicatamente le antenne in modo tale da attaccarli sul nastro continuo. </li><li> Posizionare il vetrino contro una piccola sfera (~ 1 cm di diametro) di cera dentale per facilitare la manipolazione e regolare a un angolo appropriato (~ 90 °) per l&#39;elettrodo di registrazione (Figura 1). </li><li> Una volta assicurato, posizionare il bug del letto al microscopio stereo, accendere la sorgente di luce fredda e regolare l&#39;intensità della luce fino a quando l&#39;antenna è chiaramente presentato, e mettere a fuoco il microscopio sul secondo flagellum dell&#39;antenna bed bug ad alto ingrandimento (720x) . Nota: L&#39;intensità di illuminazione usato nell&#39;esperimento non viene quantificata, che dipende molto da come occhi dello sperimentatore sentire l&#39;intensità di illuminazione. </li></ol> 3. Sensillum singolo Recording <ol><li> Collegare il preamplificatore (10X) con il controller di acquisizione del segnale, che è collegata al computer per la registrazione del segnale e visualizzazione. Accendere il computer e avviare il software, ad esempio, AutoSpike32 e cliccare la modalità &quot;Record&quot; dalla barra dei menu. Quindi scegliere la &quot;onda&quot;, in modo da avviare la registrazione dei segnali ad onda. Nota: Una linea piatta che va da sinistra a destra del monitor ripetutamente dovrebbe essere visibile. Qui, la finestra di registrazione dura 40 sec. Registrazione Max onda è 10 sec. Frequenza di campionamento selezionata è 96000 e frequenza di campionamento digitale è 240. C&#39;è 0% di offset e nessuna filtrazione, nessuna rettifica per i segnali di registrazione. Tutte queste impostazioni dei parametri nel software possono essere modificati in base alle esigenze. </li> &lt;li&gt; Accendere l&#39;altoparlante collegato al preamplificatore, che viene utilizzato per presentare la modalità tonificazione per le risposte neuronali da sensillum antenne. </li><li> Inserire l&#39;elettrodo di riferimento nell&#39;addome del letto bug stabilizzato. Nota: L&#39;elettrodo di riferimento è stato tenuto da un basamento del metallo fissata magneticamente al-tavolo dell&#39;aria. </li><li> Dopo l&#39;elettrodo di riferimento è stato collegato addome dell&#39;insetto letto, spostare l&#39;elettrodo di registrazione, che è collegato al preamplificatore e manipolata da un micromanipolatore, verso l&#39;estremità posteriore dell&#39;antenna dell&#39;insetto letto. </li><li> Quando l&#39;elettrodo di registrazione è in contatto con la giusta punta dell&#39;antenna, accendere il microscopio e localizzare l&#39;elettrodo a basso ingrandimento. </li><li> Regolare l&#39;elettrodo di registrazione aumentando gradualmente l&#39;ingrandimento fino sia l&#39;elettrodo e il sensillum antennale sono nello stesso piano e chiaramente visibili al microscopio. Nota: A questo punto, il microscopio è usualemente al massimo ingrandimento. </li><li> Inserire l&#39;elettrodo di registrazione nel pozzo del sensillum utilizzando il micromanipolatore e andare un po &#39;più in profondità, se il rumore di fondo è alto rispetto al potenziale d&#39;azione. </li><li> Una volta che i potenziali d&#39;azione chiari sono osservate dal sensillum registrato, riempire una micropipetta con il 10% (+) - β-pinene. Utilizzare la micropipetta depositare 10 microlitri aliquota del 10% (+) - β-pinene su una striscia di carta filtro (~ 3 x 15 mm) posta all&#39;interno di una pipetta Pasteur di vetro. <ol><li> Collegare la pipetta caricata alla presa del tubo di flusso di impulso del regolatore stimolo e posizionare la punta della pipetta nel piccolo foro nel tubo orientato verso l&#39;antenna. </li></ol></li><li> Quando tutte queste connessioni sono stabilizzati, premere il pedale del controller stimolo per fornire 0,5 sec soffio di stimolo (0,5 L / min) nel flusso d&#39;aria umidificata continuo. Sarà avviata la registrazione dei potenziali d&#39;azione simultaneamente quando l&#39;footswitch è depresso. Il processo di registrazione sarà l&#39;ultimo per 10 secondi a partire dal 1 sec prima della stimolazione. </li><li> Contare le potenziali d&#39;azione off-line per due periodi 500 msec, uno prima e uno dopo la stimolazione. Sottrarre qualsiasi cambiamento del tasso di picco durante il 500 msec dopo stimolazione dalla attività spontanea registrata durante i precedenti 500 msec e convertire i conteggi nella scala convenzionale di picchi / s moltiplicandoli per 2. </li></ol> 4. stimolo sostituzione nel SSR <ol><li> Una volta che il pedale è stato attivato, consegnare il 10% (+) - β-pinene nella pipetta sul baco antenne letto e registrare la risposta a questo specifico odorizzante per 10 secondi, dopo di che la pipetta viene rimosso. </li><li> Etichetta un&#39;altra nuova pipetta con l&#39;eucaliptolo 0,001% da testare. Mettere un piccolo pezzo di carta da filtro su cui 10 ml di stimolo è stato applicato, nel nuovo pipetta. </li><li> Attendere 2-5 minuti fino a quando lo stimolo è completamente vaporized nella pipetta di vetro. Fissare la pipetta sul uscita del tubo di flusso di impulsi. </li><li> Inserire la punta della pipetta nel piccolo foro del tubo orientato verso l&#39;antenna. Premere il pedale e avviare la registrazione 10 sec. </li><li> Scollegare la pipetta e preparare un altro pipetta con 0,01% eucaliptolo. </li><li> Prova tutto il resto delle dosi di eucaliptolo (dal 0,001% al 10%) sul sensilli antennali di osservare le risposte dose dipendenti. Prova dal più diluito ai minimi diluire dosi. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

La tecnica Sensillum singolo di registrazione è stato ampiamente utilizzato nel testare le risposte neurali di insetti come moscerini della frutta, zanzare e cimici dei letti a diversi stimoli chimici nell&#39;ambiente. Questi stimoli chimici sono spesso sciolti e diluiti in un solvente comune per preparare differenti dosi di trattamenti. Tuttavia, i solventi possono produrre differenti tassi di rilascio ben diversi per gli stimoli. Precedenti studi su alcuni insetti ampiamente studiate, come Drosophila melanogaster, Anopheles gambiae, quinquefasciatus Culex e Aedes aegypti hanno solitamente utilizzato olio di paraffina come solvente per sciogliere gli stimoli, come questi insetti sono relativamente insensibili alla paraffina petrolio 17-20. L&#39;olio di paraffina è stato utilizzato anche in precedenti studi di registrazione sensillum singoli di cimici, per la stessa ragione 14. Tuttavia, il solvente più utilizzato può non essere la migliore per ogni specie di insetti. Nella case di cimici, sia olio di paraffina e DMSO, cui cimici anche mostrano insensibilità, sono stati utilizzati per sciogliere gli stimoli in diversi studi 14,15, ma le stesse dosi di stimoli diluito in DMSO sembrano suscitare risposte neurali molto più forti sul la sensilli di cimici. Ad esempio, DMSO-disciolto R - (+) - limonene e S - (-) - limonene risposte neurali ha generato ≥70 picchi / sec da Dγ sensilli sul letto bug antenne, mentre il limonene-dissolto olio di paraffina suscitato risposte neurali di soli ≤25 picchi / sec da Dγ sensilli. Questa diminuzione nelle risposte neurali è abbastanza comune in stimoli che sono stati diluiti con olio di paraffina, probabilmente a causa della velocità di rilascio lento di olio di paraffina rispetto DMSO. Questo tasso rilascio più lento riduce la quantità di stimoli erogata sulla superficie del sensillum e può comportare una conclusione fuorviante quanto riguarda la sensibilità degli insetti a determinati semiochimici. Due ste criticheps per condurre la registrazione singolo sensillum sono di preparazione 1) del campione e 2) registrazione del segnale. Per la preparazione dei campioni, dal momento che le cimici hanno le gambe molto forti e in movimento attivamente le antenne, è molto importante per rimuovere tutte le gambe e attaccare le antenne saldamente il nastro biadesivo. Nel processo di registrazione del segnale, a volte, è impossibile per posizionalmente l&#39;elettrodo a punto nel pozzo sensillum. Se questo è il caso, l&#39;elettrodo può forare l&#39;estremità posteriore del sensillum, che dà sempre un segnale molto pulito e chiaro con molto rumore di fondo. Poiché ci sono più neuroni alloggiate nello D e C tipo sensilla, è spesso difficile distinguere tra singoli neuroni basati sulle ampiezze e forme dei potenziali di azione prodotti durante SSR. Tuttavia, è ancora possibile vedere differenze nelle risposte dell&#39;insetto letto a differenti stimoli basati sulla frequenza di emissione combinata di tutti i neuroni nella stessa sensillum. Teoricamente, cimici dei letti sono sensibili a determinati stimoli con forte stimolazione mentre insensibile ad altri stimoli con stimolazione debole alla stessa dose. Ulteriori studi che integrano i test di comportamento e le informazioni di loro risposta neurale a questi stimoli sarebbero quindi fornire informazioni significative sui semiochimici ecologicamente correlati per cimici. In questo studio abbiamo utilizzato anche la tecnica SSR per testare le risposte neurali di sensilla olfattivo diverse dosi di stimoli. Abbiamo osservato un modello dose-dipendente risposte neurali del bug letto per diverse sostanze chimiche. Tuttavia, considerando l&#39;ambiente complesso cimici vivono, la dose effettiva di volatili incontrate dalle cimici nei loro normali ambiente sarà molto basso. Come risultato, i semiochimici che suscitano forte risposta neurale a basse dosi fino a 01:10 5 v / v e 01:10 4 v / v sono più probabilità di essere biologicamente significativa per cimici rispetto ad altri prodotti chimici tcappello funzionare solo a dosi elevate. Pertanto, tali semiochimici che agiscono a basse dosi probabilmente svolgono un ruolo importante nella chemorecezione di cimici, aiutandoli a trovare un host o evitare fattori avversi, e sarà quindi fornire indicazioni utili a screening per promettenti attrattivi cimici o repellenti per l&#39;uso in sia in laboratorio e test sul campo.

Il letto bug comune Cimex lectularius L (Hemiptera: Cimicidae), come un ectoparassita temporanea, è un insetto succhia-sangue obbligato, il che significa che la loro sopravvivenza, lo sviluppo e la riproduzione richiedono fonti di sangue da padroni di casa, compresi gli esseri umani e gli animali 1,2. Anche se la trasmissione del virus è stato raramente segnalato a causa di C. lectularius, il fastidio generato da mordere una infestazione incide gravemente padroni di casa sia fisicamente che psicologicamente 3. L&#39;introduzione e l&#39;uso diffuso di insetticidi chimici, soprattutto DDT, abbassato il rischio di infestazioni e per la fine delle infestazioni 1950 erano ad un livello così basso che non erano più un serio interesse pubblico. Tuttavia, una serie di possibili fattori hanno portato ad rinascita delle popolazioni delle cimici dei letti in tutto il mondo, come l&#39;uso ridotto di insetticidi, un calo di sensibilizzazione del pubblico, aumentato viaggiare attività, e lo sviluppo della resistenza agli insetticidi 4-9. &lt;/ p&gt; Segnali chimici nell&#39;ambiente vengono rilevati e riconosciuti dagli insetti attraverso organi olfattivi, quali antenne e palpi mascellari. La sensilla olfattiva sulle antenne degli insetti svolgono un ruolo cruciale nel rilevare questi segnali chimici. Le molecole chimiche entrano nella cuticola antennale attraverso i pori sulla superficie cuticola. Odorizzante proteine ​​leganti nella linfa legano antennale a queste molecole chimiche e trasportarli sui recettori olfattivi 10. I recettori olfattivi e la loro co-recettore dal canale ionico cationico non selettivo sulla membrana neuronale, che sarà depolarizzata volta queste molecole chimiche sono riconosciuti dai recettori olfattivi 11. Singola registrazione sensillum (SSR) è stato sviluppato per rilevare la modifica extracellulare del potenziale d&#39;azione provocata dall&#39;applicazione di entrambi stimoli chimici o non chimici. Inserendo un elettrodo di registrazione nella linfa sensillum ed un elettrodo di riferimentoin qualche altra parte del corpo dell&#39;insetto (di solito o gli occhi composti o dell&#39;addome), la frequenza di scarica dei neuroni in risposta a stimoli possibile registrare 12. Le variazioni del numero di picchi rappresentano la sensibilità dell&#39;insetto a stimoli specifici. Stimoli chimici di diverse identità e concentrazione saranno suscitare diverse risposte neurali, con diversi tassi di cottura e strutture temporali, e possono quindi essere utilizzati per studiare il processo di codifica degli insetti ai prodotti chimici specifici. Per il bug letto comune, entrambe le forme sessuali condividono lo stesso modello di sensilli olfattivi sulle antenne: nove scanalato sensilli perno C, 29 capelli come E (E1 ed E2) sensilli, e un paio ciascuno di Dα, Dβ, Dγ peg liscio sensilli 13,14. Come multipli neuroni sono stati identificati in ogni tipo di sensillum, non è facile distinguere i potenziali di azione di diversi neuroni sistemati nella stessa sensillum, quindi per questo esperimento la totanumeri l di potenziali d&#39;azione sono stati contati off-line per un periodo di 500 msec prima e dopo la stimolazione. Il numero di potenziali d&#39;azione dopo la stimolazione è stata poi sottratto il numero dei potenziali d&#39;azione prima della stimolazione e moltiplicato per due per quantificare le variazioni del tasso di fuoco in ogni singolo sensillum in spighe al secondo 15.

<table><tbody><tr><td>Tungsten wire</td><td>A-M SYSTEMS</td><td>#716500</td><td>Used for preparing the electrode</td></tr><tr><td>KNO2</td><td>Sigma</td><td>#310484</td><td>Used for sharpening the tungsten wire</td></tr><tr><td>AC Power Supply</td><td>BK Precision</td><td>1653A</td><td>Providing the voltage in sharpening the tungsten wire</td></tr><tr><td>Leica Z6 APO Microscope</td><td>Leica</td><td>10447424</td><td>Used for observing the sensilla on antennae</td></tr><tr><td>Simulus controller</td><td>Syntech</td><td>CS-55</td><td>Used for controlling the stimulus application</td></tr><tr><td>4-Channel USB Acquisition Controller</td><td>Syntech</td><td>IDAC-4</td><td>Real-time on screen display of all signals before and during recording</td></tr><tr><td>Light Source</td><td>SCHOTT</td><td>A20500</td><td>Providing light sources for observation</td></tr><tr><td>Micromanupulator</td><td>Leica</td><td>115378</td><td>Used for minor movement of electrode</td></tr><tr><td>Speaker</td><td>Juster</td><td>95a</td><td>Connected with Acquisition Controller IDAC-4 and providing sound for the signal</td></tr><tr><td>Magnetic stand</td><td>Narishige</td><td>GJ-1</td><td>Used to hold the reference electrode, stablized bed bug and stimulus delivery tube</td></tr><tr><td>TMC Vibration Isolation Table</td><td>TMC</td><td>63-500</td><td>Used for isolating the vibration from the equipments</td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>Tedpella</td><td>2225-1</td><td>Used for holding the bed bug</td></tr><tr><td>Double-sided Tape</td><td>3M</td><td>XT6110</td><td>Used for stablizing the bed bug on the coverclip</td></tr><tr><td>Dental Wax</td><td>Dentakit</td><td>DK-R012</td><td>Used for supporting the coverclip where bed bug is stablized&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

using single sensillum recording to detect olfactory neuron responses of bed bugs to semiochemicals

Il sistema olfattivo insetto svolge un ruolo importante nella rilevazione semiochimici nell&#39;ambiente. In particolare, il sensilla antennale che ospitano neuroni singoli o multipli all&#39;interno, sono considerati per rendere l&#39;importante contributo nel rispondere agli stimoli chimici. Con la registrazione direttamente potenziale d&#39;azione nel sensillum olfattiva dopo l&#39;esposizione a stimoli, la registrazione singola sensillum (SSR) tecnica fornisce un approccio potente per studiare le risposte neurali di insetti agli stimoli chimici. Per il bug letto, che è un parassita umano noto, sono state caratterizzate più tipi di sensillum olfattiva. In questo studio, abbiamo dimostrato risposte neurali di bug letto sensilli olfattivi a due stimoli chimici e le risposte di dose-dipendente di uno di loro utilizzando il metodo SSR. Questo approccio consente ai ricercatori di condurre screening precoce per i singoli stimoli chimici sul olfattiva sensilla cimici, che forniscono informazioni preziose per lo sviluppo di nuovi attrattivi cimici dei letti o repellenti e benefici il letto sforzi di controllo bug.

Registrazione sensillum singolo è una potente tecnica investigativa utilizzata negli studi di insetti ecologia chimica e fisiologia neurale. Indagare le risposte neurali di insetti a composti volatili diversi, in particolare quelli pensato per essere ecologicamente legata alla sopravvivenza e lo sviluppo degli insetti, non solo ci dà preziose intuizioni nel processo olfatto insetto, ma apre anche nuove e promettenti strade che potrebbero provocare allo sviluppo di nuovi reagenti utili per il controllo dei parassiti. Il bug letto comune, come un parassita urbano noto, ha certamente attirato l&#39;attenzione di molti ricercatori. Tra le varie aree di studio legate alla cimici, il loro meccanismo olfatto è della massima importanza per l&#39;ecologia chimica di cimici. Studi precedenti hanno descritto esplicitamente la quantità e la distribuzione di diversi tipi di sensillum olfattiva sul lettoantenne bug. Come mostrato in Figura 2A, letto antenne insetto possiedono quattro segmenti (SC, PE, F1 e F2). La maggior parte dei sensilli olfattivi sono rappresentati sul lato posteriore della seconda flagello (F2), ma la loro distribuzione è nettamente diverso per ciascun tipo: il sensilla D, cioè Dα, Dβ e Dγ, si trovano solo lungo il lato interno della antenne (Figura 2C), mentre il C ed E (E1 ed E2) sensilla si trovano su entrambi i lati delle antenne (Figura 2B). Pertanto, al fine di garantire che registriamo la risposta neurale del sensilli D, attento posizionamento dell&#39;antenna è essenziale. Poiché entrambe le forme sessuali di quota cimici lo stesso modello di tipi sensilli e il lato interno della loro antenne contiene tutti i tipi di sensilli, il targeting questa zona rende molto più facile per registrare le risposte chimiche di tutti i diversi tipi di sensilli separatamente sull&#39;antennae (Figura 3A). Nella registrazione singola sensillum, diverso olfattivo sensilla esporre segnali neurali con nettamente diversi potenziali tipi e ampiezze (Figura 3B) azione. Ad esempio, E sensilla sono noti per avere uno o due neuroni all&#39;interno, mentre il tipo D casa sensilli più neuroni di E o C sensilli, producendo potenziali d&#39;azione più complesse rispetto agli altri di conseguenza. Le ampiezze delle risposte neurali da C sensilla sono molto più piccoli di quelli degli altri tipi Sensillum. Una volta che le connessioni degli elettrodi sono stati allestiti, le risposte neurali di ogni tipo di sensillum ad ogni stimolo possono essere registrate in base alla loro identità e intensità. Per alcuni stimoli a cui le cimici dei letti sono estremamente sensibili, la risposta neurale può essere molto forti e durare diversi secondi dopo la cessazione della stimolazione. Ad esempio, in risposta al 10% (+) - β-pinene, cimici mostratouna forte reazione con un enorme gittata (≥200 picchi / sec) e dinamiche temporali super-sostenuta rispetto al controllo con solo solvente come stimolo (Figura 4A e B). Diversi stimoli possono suscitare totalmente diverse risposte neurali dalla stessa sensillum e diverse concentrazioni di stesso stimolo sono suscettibili di generare abbastanza diverse frequenze di cottura. Come mostrato in figura 5, aumentando la concentrazione di eucaliptolo sollevato le frequenze di cottura da 30 picchi / sec a 0,001% a 240 picchi / sec a 10% in modo dose-dipendente. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53337/53337fig1.jpg" /> Figura 1. Un diagramma schematico che illustra la procedura di fissazione per cimici. L&#39;insetto letto è stabilizzato sul vetrino con le antenne fisse sul nastro. Il campione assemblato viene quindi posto su un palco magnetica. L&#39;orientamento e l&#39;altezza del campione cun essere regolato a un angolo appropriato tra le antenne cimici e l&#39;elettrodo di registrazione. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53337/53337fig1large.jpg" target="_blank">Fate clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53337/53337fig2.jpg" /> Figura 2. Distribuzione dei sensilli olfattivi sulle antenne bug letto. Immagine (A) Un scansione elettrodo Microscope (SEM) di una antenna bug letto. L&#39;antenna ha quattro segmenti, il Sculpus (SC), Pedecel (PE), il primo flagello (F1) e il secondo flagello (F2). La maggior parte dei sensilli olfattivi si trovano in F2, anche se un paio di sensilli olfattivi sono stati trovati anche in Formula 1, che si ritiene essere correlato alla loro funzione di rilevazione aggregazione feromone per il letto bug 16. (B) Una immagine SEM del lato esterno della F2, che ospita il olfac C ed Esensilli tory. (C) Un&#39;immagine SEM del lato interno della F2, che è stato trovato per ospitare tutti i diversi tipi di sensilli olfattivi: D (Dα, Dβ, Dγ), C ed E. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53337/53337fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura .</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/53337/53337fig3.jpg" /> Figura 3. segnali neurali tipiche di diversi tipi di sensilli olfattivi sul letto bug antenne. Immagini (A) ad alta risoluzione SEM di ogni tipo di sensillum olfattiva sulle antenne bug letto. (B) segnali tipici neurali del diverso sensilla olfattiva prima dell&#39;esposizione ad uno stimolo. Dα, Dβ, Dγ e C sensilli, che ospitano più neuroni sensoriali olfattivi (OSN), presentano potenziali d&#39;azione più complicato di E1 ed E2 sensilli, che contain solo uno o due OSNs. Le ampiezze dei potenziali d&#39;azione da C sensilli sono molto più piccoli di quelli in altri tipi Sensillum. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53337/53337fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/53337/53337fig4.jpg" /> Figura 4. Rappresentante risposta neurale a stimoli che cimici sono sensibili. Trace (A) del segnale che mostra la tipica risposta neurale di sensillum olfattiva (Dγ) al solvente, che viene utilizzato come controllo nella registrazione singola sensillum. Le tracce vengono impostati per avviare 1 secondo prima della 0.5 secondi soffio di stimolo. Le tracce dei segnali continuano la registrazione per 10 secondi dopo l&#39;inizio del soffio stimolo. Trace (B) Segnale che mostra la fortissima risposta neurale di un olfattivasensillum (Dγ) ad uno stimolo botanico, 10% (+) - β-pinene. Dopo il soffio di (+) - β-pinene viene consegnato al sensillum Dγ, OSNs alloggiati all&#39;interno di questo sensillum vengono alimentate con alta frequenza e una lunga dinamica temporale. La barra bianca sopra la traccia del segnale indica l&#39;intervallo di 1 sec prima dell&#39;esposizione stimolo, la barra rossa sopra la traccia corrisponde alla consegna del soffio di stimolo sul sensillum olfattiva, e la barra nera sopra la traccia indica il segnale registrato dopo la cessazione del stimolo soffio. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53337/53337fig4large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/53337/53337fig5.jpg" /> Figura 5. risposte rappresentativi dose-dipendenti delle OSNs agli stimoli. Utilizzo di un altro stimolo botanico, eucaliptolo come example, il sensilla Dγ visualizzata una risposta dose-dipendente a diverse concentrazioni di eucaliptolo. Mentre le concentrazioni sono passati da 0,001% al 10%, le frequenze di cottura è passato da 30 picchi / sec a 240 picchi / sec. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53337/53337fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Using Single Sensillum Recording to Detect Olfactory Neuron Responses of Bed Bugs to Semiochemicals

Bed bugs rely on olfactory receptor neurons housed in their antennal olfactory sensilla to detect semiochemicals in the environment. Utilizing single sensillum recording, we demonstrate a method to evaluate bed bug response to semiochemicals and explore the coding process involved.

Utilizzando Sensillum singolo controllo per rilevare olfattiva Neuron Risposte di cimici a semiochimici

The insect olfactory system plays an important role in detecting semiochemicals in the environment. In particular, the antennal sensilla which house ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.8K Views.  Auburn University. Bed bugs rely on olfactory receptor neurons housed in their antennal olfactory sensilla to detect semiochemicals in the environment. Utilizing single sensillum recording, we demonstrate a method to evaluate bed bug response to semiochemicals and explore the coding process involved.

Video: Using Single Sensillum Recording to Detect Olfactory Neuron Responses of Bed Bugs to Semiochemicals

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed in sensory hairs called sensilla, which cover the surface of olfactory organs. The surface of each sensillum is covered with tiny pores, through which odorants pass and dissolve in a fluid called sensillum lymph, which bathes the sensory dendrites of the OSNs housed in a given sensillum. The OSN dendrites express odorant receptor (OR) proteins, which in insects function as odor-gated ion channels4, 5. The interaction of odorants with ORs either increases or decreases the basal firing rate of the OSN. This neuronal activity in the form of action potentials embodies the first representation of the quality, intensity, and temporal characteristics of the odorant6, 7.
Given the easy access to these sensory hairs, it is possible to perform extracellular recordings from single OSNs by introducing a recording electrode into the sensillum lymph, while the reference electrode is placed in the lymph of the eye or body of the insect. In Drosophila, sensilla house between one and four OSNs, but each OSN typically displays a characteristic spike amplitude. Spike sorting techniques make it possible to assign spiking responses to individual OSNs. This single sensillum recording (SSR) technique monitors the difference in potential between the sensillum lymph and the reference electrode as electrical spikes that are generated by the receptor activity on OSNs1, 2, 8. Changes in the number of spikes in response to the odorant represent the cellular basis of odor coding in insects. Here, we describe the preparation method currently used in our lab to perform SSR on Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae, and show representative traces induced by the odorants in a sensillum-specific manner.

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

Electrophysiological responses of olfactory sensory neurons to odorants can be measured in insects using single sensillum recordings. In this video article we will demonstrate how to perform single sensillum recordings in the antennae of the vinegar fly (Drosophila melanogaster) and the maxillary palps of the malaria mosquito (Anopheles gambiae).

Registrazioni Sensillum singolo in Insetti Drosophila melanogaster E Anopheles gambiae</em

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed ...

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Neuroscienze

Electrophysiological Measurements from a Moth Olfactory System

Insect olfactory systems provide unique opportunities for recording odorant-induced responses in the forms of electroantennograms (EAG) and single sensillum recordings (SSR), which are summed responses from all odorant receptor neurons (ORNs) located on the antenna and from those housed in individual sensilla, respectively. These approaches have been exploited for getting a better understanding of insect chemical communication. The identified stimuli can then be used as either attractants or repellents in management strategies for insect pests.

Insect olfactory systems provide unique opportunities for recording odorant-induced responses in the forms of electroantennograms (EAG) and single sensillum recordings (SSR), which are summed responses from all odorant receptor neurons (ORNs) located on the antenna and from those housed in individual sensilla, respectively.

Le misurazioni elettrofisiologiche da un sistema olfattivo Moth

Insect olfactory systems provide unique opportunities for recording odorant-induced responses in the forms of electroantennograms (EAG) and single ...

Electrophysiology of Scorpion Peg Sensilla

We describe a modification of an existing tip-recording technique1,2 for electrophysiologically investigating short, peg-like sensory sensilla3,4. On the mid-ventral surface of all scorpions are two appendages called pectines, which have dense fields of mechano- and chemosensory peg sensilla5,6. One method for assessing chemoresponsiveness of these sensilla uses a tungsten electrode for extracellularly recording neural activity within a sensillum as a volatile odorant is introduced to the sensory field5,7. The limitations of this method include slow data collection and uncontrolled stimulant introduction to, and removal from, the peg field. To overcome these limitations, we developed a new tip-recording technique that uses nonpolar mineral oil as a medium through which to deliver water-based tastants to individual peg sensilla8,9. We have successfully applied this method to obtain sensillar chemoresponses to citric acid, ethanol, and salt. Here we describe the experimental protocol for such a study9. We think this new method may be useful for studying the response properties of other arthropod chemosensory systems, including those of insects10, 11 and crustaceans12.

This article describes an electrophysiological method for isolating chemical stimulation to individual sensilla via extracellular, tip-recordings under mineral oil.

Elettrofisiologia di Scorpion Peg sensilli

We describe a modification of an existing tip-recording technique1,2 for electrophysiologically investigating short, peg-like sensory sensilla3,4. On the ...

Odorant-induced Responses Recorded from Olfactory Receptor Neurons using the Suction Pipette Technique

Animals sample the odorous environment around them through the chemosensory systems located in the nasal cavity. Chemosensory signals affect complex behaviors such as food choice, predator, conspecific and mate recognition and other socially relevant cues. Olfactory receptor neurons (ORNs) are located in the dorsal part of the nasal cavity embedded in the olfactory epithelium. These bipolar neurons send an axon to the olfactory bulb (see Fig. 1, Reisert &amp; Zhao1, originally published in the Journal of General Physiology) and extend a single dendrite to the epithelial border from where cilia radiate into the mucus that covers the olfactory epithelium. The cilia contain the signal transduction machinery that ultimately leads to excitatory current influx through the ciliary transduction channels, a cyclic nucleotide-gated (CNG) channel and a Ca2+-activated Cl- channel (Fig. 1). The ensuing depolarization triggers action potential generation at the cell body2-4.
In this video we describe the use of the "suction pipette technique" to record odorant-induced responses from ORNs. This method was originally developed to record from rod photoreceptors5 and a variant of this method can be found at jove.com modified to record from mouse cone photoreceptors6. The suction pipette technique was later adapted to also record from ORNs7,8. Briefly, following dissociation of the olfactory epithelium and cell isolation, the entire cell body of an ORN is sucked into the tip of a recording pipette. The dendrite and the cilia remain exposed to the bath solution and thus accessible to solution changes to enable e.g. odorant or pharmacological blocker application. In this configuration, no access to the intracellular environment is gained (no whole-cell voltage clamp) and the intracellular voltage remains free to vary. This allows the simultaneous recording of the slow receptor current that originates at the cilia and fast action potentials fired by the cell body9. The difference in kinetics between these two signals allows them to be separated using different filter settings. This technique can be used on any wild type or knockout mouse or to record selectively from ORNs that also express GFP to label specific subsets of ORNs, e.g. expressing a given odorant receptor or ion channel.

Olfactory receptor neurons (ORNs) convert odor signals first into a receptor current that in turn triggers action potentials that are conveyed to second order neurons in the olfactory bulb. Here we describe the suction pipette technique to record simultaneously the odorant-induced receptor current and action potentials from mouse ORNs.

Odorizzante indotte risposte registrate da neuroni recettori olfattivi con la tecnica della pipetta di aspirazione

Animals sample the odorous environment around them through the chemosensory systems located in the nasal cavity. Chemosensory signals affect complex ...

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar olfactory systems suggesting that the biological approach to chemical sensing has been optimized over evolutionary time1. In the insect olfactory system, odorants are transduced by olfactory receptor neurons (ORN) in the antenna, which convert chemical stimuli into trains of action potentials. Sensory input from the ORNs is then relayed to the antennal lobe (AL; a structure analogous to the vertebrate olfactory bulb). In the AL, neural representations for odors take the form of spatiotemporal firing patterns distributed across ensembles of principal neurons (PNs; also referred to as projection neurons)2,3. The AL output is subsequently processed by Kenyon cells (KCs) in the downstream mushroom body (MB), a structure associated with olfactory memory and learning4,5. Here, we present electrophysiological recording techniques to monitor odor-evoked neural responses in these olfactory circuits.
First, we present a single sensillum recording method to study odor-evoked responses at the level of populations of ORNs6,7. We discuss the use of saline filled sharpened glass pipettes as electrodes to extracellularly monitor ORN responses. Next, we present a method to extracellularly monitor PN responses using a commercial 16-channel electrode3. A similar approach using a custom-made 8-channel twisted wire tetrode is demonstrated for Kenyon cell recordings8. We provide details of our experimental setup and present representative recording traces for each of these techniques.

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust Schistocerca Americana Olfactory Circuits

We demonstrate variations of the extracellular multi-unit recording technique to characterize odor-evoked responses in the first three stages of the invertebrate olfactory pathway. These techniques can easily be adapted to examine ensemble activity in other neural systems as well.

Multi-unit Metodi di registrazione per caratterizzare l&#39;attività neurale nel Locust (<em&gt; Schistocerca Americana</em&gt;) Circuiti olfattive

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival  of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar ...

Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of olfactory-driven behaviors and their modulation. These coding properties depend heavily on the initial interaction between odor molecules and the olfactory receptor (OR) expressed in the OSNs. The identity, specificity and ligand spectrum of the expressed OR are critical. The probability to find the ligand of the OR expressed in an OSN chosen randomly within the epithelium is very low. To address this challenge, this protocol uses genetically tagged mice expressing the fluorescent protein GFP under the control of the promoter of defined ORs. OSNs are located in a tight and organized epithelium lining the nasal cavity, with neighboring cells influencing their maturation and function. Here we describe a method to isolate an intact olfactory epithelium and record through patch-clamp recordings the properties of OSNs expressing defined odorant receptors. The protocol allows one to characterize OSN membrane properties while keeping the influence of the neighboring tissue. Analysis of patch-clamp results yields&#160;a precise quantification of ligand/OR interactions, transduction pathways and pharmacology, OSNs&#39; coding properties and their modulation at the membrane level.&#160;

Analyzing the physiological properties of olfactory sensory neurons still faces technical limitations. Here we record them through perforated patch-clamp in an intact preparation of the olfactory epithelium in gene-targeted mice. This technique allows the characterization of membrane properties and responses to specific ligands of neurons expressing defined olfactory receptors.

Perforato Patch-clamp registrazione di topo neuroni sensoriali olfattivi In neuroepithelium intatto: Analisi funzionale di neuroni Esprimendo un Identificato odorizzante Receptor

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of ...

Using an Adapted Microfluidic Olfactory Chip for the Imaging of Neuronal Activity in Response to Pheromones in Male C. Elegans Head Neurons

The use of calcium indicators has greatly enhanced our understanding of neural dynamics and regulation. The nematode Caenorhabditis elegans, with its completely mapped nervous system and transparent anatomy, presents an ideal model for understanding real-time neural dynamics using calcium indicators. In combination with microfluidic technologies and experimental designs, calcium-imaging studies using these indicators are performed in both free-moving and trapped animals. However, most previous studies utilizing trapping devices, such as the olfactory chip described in Chronis et al., have devices designed for use in the more common hermaphrodite, as the less common male is both morphologically and structurally dissimilar. An adapted olfactory chip was designed and fabricated for increased efficiency in male neuronal imaging with using young adult animals. A turn was incorporated into the worm loading port to rotate the animals and to allow for the separation of the individual neurons within a bilateral pair in 2D imaging. Worms are exposed to a controlled flow of odorant within the microfluidic device, as described in previous hermaphrodite studies. Calcium transients are then analyzed using the open-source software ImageJ. The procedure described herein should allow for an increased amount of male-based C. elegans calcium imaging studies, deepening our understanding of the mechanisms of sex-specific neuronal signaling.

Using an Adapted Microfluidic Olfactory Chip for the Imaging of Neuronal Activity in Response to Pheromones in Male C. Elegans Head Neurons

The use of an adapted &#34;olfactory chip&#34; for the efficient calcium imaging of C. elegans males is described here. Studies of male exposure to glycerol and a pheromone are also shown.

Tramite un Chip olfattiva di microfluidica adattato per l'Imaging dell'attività neuronale in risposta ai feromoni in neuroni di testa maschio C. Elegans

The use of calcium indicators has greatly enhanced our understanding of neural dynamics and regulation. The nematode Caenorhabditis elegans, with its ...

Electrophysiological Recording from Drosophila Trichoid Sensilla in Response to Odorants of Low Volatility

Insects rely on their sense of smell to guide a wide range of behaviors that are critical for their survival, such as food-seeking, predator avoidance, oviposition, and mating. Myriad chemicals of varying volatilities have been identified as natural odorants that activate insect Olfactory Receptor Neurons (ORNs). However, studying the olfactory responses to low-volatility odorants has been hampered by an inability to effectively present such stimuli using conventional odor-delivery methods. Here, we describe a procedure that permits the effective presentation of low-volatility odorants for in vivo Single-Sensillum Recording (SSR). By minimizing the distance between the odor source and the target tissue, this method allows for the application of biologically salient but hitherto inaccessible odorants, including palmitoleic acid, a stimulatory pheromone with a demonstrated effect on ORNs involved in courtship and mating behavior1. Our procedure thus affords a new avenue to assay a host of low-volatility odorants for the study of insect olfaction and pheromone communication.

Electrophysiological Recording from Drosophila Trichoid Sensilla in Response to Odorants of Low Volatility

The overall goal of this protocol is to demonstrate how to present odorants of low volatility for single-sensillum recording from Drosophila olfactory receptor neurons that respond to long-chain cuticular pheromones.

Registrazione elettrofisiologica da<em&gt; Drosophila</em&gt; Senso Trichoide in risposta a Odoranti di bassa volatilità

Insects rely on their sense of smell to guide a wide range of behaviors that are critical for their survival, such as food-seeking, predator avoidance, ...

Single Sensillum Recordings for Locust Palp Sensilla Basiconica

The palps of locust mouthparts are considered to be conventional gustatory organs that play an important role in a locust&#39;s food selection, especially for the detection of non-volatile chemical cues through sensilla chaetica (previously named terminal sensilla or crested sensilla). There is now increasing evidence that these palps also have an olfactory function. An odorant receptor (LmigOR2) and an odorant-binding protein (LmigOBP1) have been localized in the neurons and accessory cells, respectively, in the sensilla basiconica of the palps. Single sensillum recording (SSR) is used for recording the responses of odorant receptor neurons, which is an effective method for screening active ligands on specific odorant receptors. SSR is used in functional studies of odorant receptors in palp sensilla. The structure of the sensilla basiconica located on the dome of the palps differs somewhat from the structure of those on the antennae. Therefore, when performing an SSR elicited by odorants, some specific advice may be helpful for obtaining optimum results. In this paper, a detailed and highly effective protocol for an SSR from insect palp sensilla basiconica is introduced.

This paper describes a detailed and highly effective protocol for single sensillum recordings from the sensilla basiconica on the palps of insect mouthparts.

Sensillum singole registrazioni per Locust Palp sensilli Basiconica

The palps of locust mouthparts are considered to be conventional gustatory organs that play an important role in a locust&#39;s food selection, especially ...

Un nuovo metodo per una migliore analisi dell'attività dei neuroni del gusto degli insetti

Base Recording: A Technique for Analyzing Responses of Taste Neurons in Drosophila

Insects taste the external world through taste hairs, or sensilla, that have pores at their tips. When a sensillum comes into contact with a potential food source, compounds from the food source enter through the pore and activate neurons within. For over 50 years, these responses have been recorded using a technique called tip recording. However, this method has major limitations, including the inability to measure neural activity before or after stimulus contact and the requirement for tastants to be soluble in aqueous solutions. We describe here a technique that we call base recording, which overcomes these limitations. Base recording allows the measurement of taste neuron activity before, during, and after the stimulus. Thus, it allows extensive analysis of OFF responses that occur after a taste stimulus. It can be used to study hydrophobic compounds such as long-chain pheromones that have very low solubility in water. In summary, base recording offers the advantages of single-sensillum electrophysiology as a means of measuring neuronal activity - high spatial and temporal resolution, without the need for genetic tools - and overcomes key limitations of the traditional tip recording technique.

Autore in primo piano: Progressi nella chemiorecezione: dai recettori degli odori degli insetti agli RNA non codificanti

A rarely used method of electrophysiological recording, base recording, allows analysis of features of taste coding that cannot be examined by conventional recording methods. Base recording also allows the analysis of taste responses to hydrophobic stimuli that cannot be studied using traditional electrophysiological methods.

Registrazione di base: una tecnica per analizzare le risposte dei neuroni del gusto in Drosophila

Insects taste the external world through taste hairs, or sensilla, that have pores at their tips. When a sensillum comes into contact with a potential ...

Utilizzando Sensillum singolo controllo per rilevare olfattiva Neuron Risposte di cimici a semiochimici

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