We thank James Maeda and Aaron Cooke for assistance with the filming and editing of this video. Funding was provided by the National Science Foundation (OCE-0550468, 1029515).

NOTA: Fase 3 del presente protocollo coinvolge soggetti animali vertebrati. La procedura è stata progettata in modo che gli animali ricevano il trattamento più umano possibile ed è stato approvato dalla cura e l&#39;uso Comitato Istituzionale Animal (IACUC) presso la University of North Carolina Wilmington. 1) Estrazione del tessuto <ol><li> Utilizzare tessuto che è nel suo stato naturale di idratazione e non spremuto, secchi-out o eccessivamente umido come questo altera la concentrazione volumetrica di metaboliti secondari. Tagliare o tagliare il tessuto in pezzi o fette che possono essere inseriti in un tubo da centrifuga da 50 ml. Nota: tessuto fresco può essere utilizzato in alcuni casi, ma spesso è meglio tagliare o tritare tessuti congelati, che non è soggetta a spremitura al taglio. </li><li> Aggiungere pezzi di tessuto a 30 ml di una miscela 1: 1 di diclorometano (DCM) e metanolo (MeOH) in una provetta da centrifuga graduata fino ad un volume finale di 40 ml è raggiunto. Assicurarsi di eseguire tutti i passaggi che comportano il trasferimento disolvente in una cappa aspirante con ventilazione adeguata. </li><li> Tappare la provetta e capovolgerla più volte, poi agitare più volte nel corso di un periodo di estrazione 4 ore. Nota: Durante questo periodo, l&#39;acqua si combina con il MeOH e il risultante MeOH: fase acquosa si separa dalla fase DCM. Il tessuto è alternativamente esposto al DCM e MeOH: acqua come emulsione come i tubi sono agitati. </li><li> Trasferire l&#39;estratto DCM in un pallone a fondo rotondo ed evaporare a secchezza su un evaporatore rotante utilizzando basse temperature (&lt;40 ° C). Utilizzando solventi minimal, trasferire l&#39;estratto secco di 20 ml di scintillazione flacone. Montare la fiala con un adattatore evaporatore rotante e di nuovo evaporare a secco in un evaporatore rotante con fuoco basso (&lt;40 ° C). Nota: Il passo successivo richiede l&#39;uso di uno strumento di compressione casalingo che possono essere assemblati avvitando i seguenti elementi in ordine sequenziale sull&#39;estremità di un&#39;asta filettata: (1) il dado (2) Rondella, e (3) dado cieco. La rondella deve o essere perforato omontata in modo che sia inferiore al diametro interno di un tubo da centrifuga da 50 ml. </li><li> Tornando al tubo da centrifuga graduato contenente tessuti e MeOH: estratto dall&#39;acqua, premere il mezzo di estrazione di tessuto attraverso la compressione. Trasferire il MeOH: estratto acquoso allo stesso pallone a fondo tondo e memorizzare refrigerati (&lt;10 ° C). </li><li> Aggiungere MeOH al tubo da centrifuga graduata finché il tessuto ora disidratato è sommerso per una seconda estrazione di 2 a 6 durata ore, poi trasferire la nuova MeOH estratto nel pallone a fondo tondo refrigerati contenente la MeOH: estratto acquoso. Se non vi è alcuna preoccupazione che il tessuto non è stato completamente estratto, ripetere l&#39;estrazione MeOH 2 a 6 ore. </li><li> Asciugare la MeOH su un evaporatore rotante con fuoco basso (&lt;40 ° C). Trasferire l&#39;estratto acquoso rimanente dal pallone a fondo tondo nella fiala di scintillazione contenente l&#39;estratto secco non polare, con un volume minimo di MeOH per risciacquare il pallone a fondo tondo. </li><li> Evaporate l&#39;estratto acquoso di essiccazione, a fuoco basso (&lt;40 ° C) su un concentratore a vuoto. La fiala di scintillazione ora contiene l&#39;estratto grezzo organico secco totale di 10 ml di tessuto. Evacuare spazio di testa del flaconcino con N 2 gas per prevenire l&#39;ossidazione, sigillare ermeticamente e conservare congelato (-20 ° C). </li></ol> 2) Preparazione alimentare <ol><li> Preparare calamari polvere manto liofilizzata. Nota: mantello Squid fornisce una fonte di alimentazione che è paragonabile a quella di altri invertebrati bentonici, e verrà utilizzato come ingrediente nelle sottofasi di 2.2. <ol><li> Anelli surgelati Scongelare del mantello calamari a deionizzata calda (DI) di acqua, poi purea in un frullatore ad alta velocità. </li><li> Versate un sottile strato di purè calamari mantello su una teglia bassa e congelamento (-20 ° C), quindi rompere il foglio di congelato purea calamari a pezzetti per essere liofilizzato. </li><li> Lyophilize la calamari congelati manto purea seguendo le modalità di funzionamento del freeze-essiccatore. </li><li> Polverizzare i pezzi liofilizzate di calamari mantello purea in un frullatore ad alta velocità per formare una polvere. </li><li> In una cappa aspirante, versare il mantello calamaro in polvere in una farina setaccio rotante e vagliare separare grossi pezzi di tessuto dalla polvere fine. </li><li> Trasferire la multa in polvere manto calamari in un contenitore sigillato. Evacuare spazio di testa del contenitore con N 2 gas per prevenire l&#39;ossidazione e memorizzare congelati (-20 ° C). </li></ol></li><li> Preparare l&#39;impasto alimentare. Nota: Durante l&#39;esecuzione di più test consecutivi, è pratico di preparare ~ 100 ml di miscela di cibo, ma questa ricetta può essere scalata a volumi più piccoli, se necessario. <ol><li> Combinare una miscela di 3 g di acido alginico e 5 g liofilizzata mantello polvere calamari con 100 ml di acqua deionizzata in un bicchiere da 150 ml. Mescolare energicamente con una microspatula per qualche minuto fino a quando la polvere è completamente idratata e la miscela è omogenea. Nota: Se si desidera, colorante alimentare può essere aggiunto a questo step: è facile aggiungere alla miscela colorante alimentare che genererà entrambe le miscele trattate e di controllo (mascherare il pigmento naturale dell&#39;estratto nella miscela estratto trattati) anziché cercare di abbinare il colore della miscela dell&#39;estratto trattati aggiungendo tingere alla miscela di controllo. Colorante alimentare verde o marrone è spesso desiderabile per mascherare eventuali pigmenti nell&#39;estratto greggio. </li><li> Caricare esattamente 10 ml di miscela di cibo in una siringa graduata. Fare attenzione ad evitare l&#39;inclusione di bolle d&#39;aria nel corso di questo processo. </li><li> Rimuovere l&#39;20 ml scintillazione flacone con estratto biologico greggio asciutto dal freezer. Aggiungere una o due gocce di MeOH, quindi mescolare l&#39;estratto in una miscela omogenea con un microspatula. </li><li> Espellere il caricata siringa da 10 ml di matrice alimentare in 20 ml di scintillazione fiala e mescolare con una microspatula per omogeneizzare la miscela alimentare estratto trattati. Nota: Può essere utile per espellere la siringa in incrementi più piccoli (cioè, espellere 2 ml e omogeneizzare, poi r.EPEAT fino tutti i 10 ml sono stati omogeneizzati). </li></ol></li><li> Preparare il pellet di analisi. <ol><li> Caricare un volume molto piccolo della miscela dell&#39;estratto (~ 1 ml) in una siringa, e immergere la punta della siringa in una soluzione di 0,25 M CaCl 2. Estrarre il contenuto della siringa per formare un lungo spaghetto-like. </li><li> Dopo pochi minuti, togliere il filo indurito, tritarlo in 4 mm di lunghezza pellet su un tagliere di vetro con una lama di rasoio, poi sciacquare in acqua di mare. </li><li> Ripetere i punti 2.3.1 e 2.3.2 senza includere l&#39;estratto di tessuto per fare pellet di controllo. Assicurarsi di trattamento pellets di controllo con un volume equivalente di solvente (vedi aggiunta di MeOH al composto trattata nel passaggio 2.2.3) per controllare per aggiunta di solventi. Se un controllo negativo è desiderato per confermare che il pesce saggio può essere indotta a rinunciare alimentazione, aggiungere denatonium benzoato ad una concentrazione di 2 mg ml -1 al cibo miscela grezza 27. </li></ol></li></ol> 3) AppetibilitàBioassays <ol><li> Eseguire test di alimentazione con il giallo-fase wrasse bluehead catturati, Thalassoma bifasciatum, tenuti in gruppi di tre in compartimenti opaco facciate di acquari di laboratorio. </li><li> Invia pellets alimentari da un bicchiere di acqua di mare con una pipetta di vetro con un bulbo di gomma. Nota: Potrebbero essere necessari alcuni giorni per addestrare i pesci per ricevere il cibo in questo modo. Uno stimolo condizionata (es pochi tocchi della pipetta sul vetro dell&#39;acquario) che precede la consegna di cibo può essere utile per addestrare il pesce aspettarsi l&#39;aggiunta di pellets alimentari. </li><li> Punteggio pellet. Si consideri un pellet accettato se prontamente consumato dai pesci. Si consideri un pellet respinta se non mangiato, dopo un minimo di tre tentativi da parte di uno o più pesci di prenderlo nella loro cavità orale, o se il pellet si avvicina e ignorato dopo un tentativo del genere. </li><li> Campioni di punteggio. Nota: La procedura di test è raffigurato come un diagramma di flusso in Figura 1 Gruppi di pesci che si rifiutano di mangiare.pellets di controllo in qualsiasi fase del protocollo non sono considerati ulteriormente. Ci sono due possibili risultati di una singola esecuzione del test: il campione viene accettato o respinto. <ol><li> Inizia con un pellet di controllo per confermare che il gruppo di pesci è cooperativa. Offrire un pellet trattata. Se i pesci accettano il pellet trattata, segnare il campione accettata. Se i pesci rifiutano il pellet trattato, offrire una successiva pellet di controllo per determinare se i pesci hanno cessato l&#39;alimentazione. Se i pesci accettano la successiva pellet di controllo, segnare il campione respinta. </li></ol></li><li> Replica. Ripetere la procedura di test con dieci gruppi indipendenti di pesce per ogni estratto. </li></ol> 4) Significato Valutazione <ol><li> Valutare la significatività delle differenze di consumo di controllo vs pellet trattate con una versione modificata del test esatto di Fisher 26. Modificare il test in modo che siano fissati i totali marginali per il controllo e pellet trattati, Trattandoli due campioni casuali. Nota: Questo fornisce p = 0,057 quando 7 pellet sono mangiati; quindi, ogni estratto è considerato deterrente se 6 o meno pellet sono mangiati, e appetibile se 7 o più pellet sono mangiati. </li><li> Per confrontare l&#39;appetibilità relativa tra i gruppi di estratti, calcolare un numero medio di pellet consumato all&#39;interno di ogni gruppo. Mantenere la soglia a 6 pellet così un gruppo di estratti repliche sono considerati deterrente se il numero medio di pellet consumato + errore standard (SE) ≤6. Nota: Nei risultati rappresentativi, l&#39;assegnazione del gruppo è di specie, così replicano estratti provengono da individui distinti e la relativa appetibilità possono essere confrontati tra le specie. </li></ol>

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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+defense+of+the+Caribbean+reef+sponge+Axinella+corrugata+against+predatory+fishes.">Chemical defense of the Caribbean reef sponge Axinella corrugata against predatory fishes.</a> Journal of Chemical Ecology. 25 (12), 2811-2823 (1999).</li><li>Chanas, B., Pawlik, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defenses+of+Caribbean+sponges+against+predatory+reef+fish+II.+Spicules,+tissue+toughness,+and+nutritional+quality.">Defenses of Caribbean sponges against predatory reef fish II. Spicules, tissue toughness, and nutritional quality.</a> Marine Ecology Progress Series. 127 (1), 195-211 (1995).</li><li>Albrizio, S., Ciminiello, P., Fattorusso, E., Magno, S., Pawlik, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphitoxin,+a+new+high+molecular+weight+antifeedant+pyridinium+salt+from+the+Caribbean+sponge+Amphimedon+compressa.">Amphitoxin, a new high molecular weight antifeedant pyridinium salt from the Caribbean sponge Amphimedon compressa.</a> Journal of Natural Products. 58 (5), 647-652 (1995).</li><li>Assmann, M., Lichte, E., Pawlik, J. R., K&#246;ck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Chemical defenses of the Caribbean sponges Agelas wiedenmayeri and Agelas conifera. Marine Ecology Progress Series. 207, 255-262 (2000).</li><li>Kubanek, J., Fenical, W., Pawlik, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+antifeedant+triterpene+glycosides+from+the+Caribbean+sponge+Erylus+Formosus.">New antifeedant triterpene glycosides from the Caribbean sponge Erylus Formosus.</a> Natural Product Letters. 15 (4), 275-285 (2001).</li><li>Pawlik, J. R., McFall, G., Zea, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Does+the+odor+from+sponges+of+the+genus+Ircinia+protect+them+from+fish+predators.">Does the odor from sponges of the genus Ircinia protect them from fish predators.</a> Journal of Chemical Ecology. 28 (6), 1103-1115 (2002).</li><li>Waddell, B., Pawlik, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defenses+of+Caribbean+sponges+against+invertebrate+predators.+I.+Assays+with+hermit+crabs.">Defenses of Caribbean sponges against invertebrate predators. I. Assays with hermit crabs.</a> Marine Ecology Progress Series. 195, 125-132 (2000).</li><li>Waddell, B., Pawlik, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defense+of+Caribbean+sponges+against+invertebrate+predators.+II.+Assays+with+sea+stars.">Defense of Caribbean sponges against invertebrate predators. II. Assays with sea stars.</a> Marine Ecology Progress Series. 195, 133-144 (2000).</li><li>Burns, E., Ifrach, I., Carmeli, S., Pawlik, J. R., Ilan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+anti-predatory+defenses+of+Red+Sea+and+Caribbean+sponges.+I.+Chemical+defense.">Comparison of anti-predatory defenses of Red Sea and Caribbean sponges. I. Chemical defense.</a> Marine Ecology Progress Series. 252, 105-114 (2003).</li><li>Jones, A. C., Blum, J. E., Pawlik, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testing+for+defensive+synergy+in+Caribbean+sponges:+Bad+taste+or+glass+spicules.">Testing for defensive synergy in Caribbean sponges: Bad taste or glass spicules.</a> Journal of Experimental Marine Biology and Ecology. 322 (1), 67 (2005).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

La procedura qui descritta prevede un protocollo di laboratorio relativamente semplice, ecologicamente rilevanti per valutare le difese chimiche antipredatory negli organismi marini. Qui passiamo in rassegna i criteri importanti che sono soddisfatte da questo insieme di metodi: (1) appropriata predatore. Questa analisi alimentare impiega il wrasse bluehead, Thalassoma bifasciatum, uno dei pesci più abbondanti sulle barriere coralline in tutti i Caraibi. Il bluehead è un c...

Ecologia chimica sviluppata attraverso la collaborazione di chimici ed ecologisti. Mentre la sotto-disciplina di terrestre ecologia chimica è stato intorno per qualche tempo, quello di ecologia chimica marina è solo pochi decenni vecchio, ma ha fornito importanti conoscenze sulla ecologia e comunità la struttura evolutiva degli organismi marini 1-8. Sfruttando le tecnologie emergenti di immersioni subacquee e di spettroscopia NMR, i chimici organici rapidamente generato un gran numero di pubblicazioni che descrivono nuovi metaboliti bentoniche invertebrati e alghe marine negli anni 1970 e 1980 9. Supponendo che metaboliti secondari devono servire a qualcosa, molte di queste pubblicazioni ascritti ecologicamente importanti proprietà a nuovi composti senza prove empiriche. Nello stesso tempo, gli ecologisti sono stati anche approfittando dell&#39;avvento di immersioni subacquee e descrivere le distribuzioni e abbondanze di animali bentonici e piante precedentemente noti from metodi di campionamento relativamente inefficaci come il dragaggio. L&#39;assunzione di questi ricercatori è che qualsiasi cosa sessili e corpo molle devono essere difesi chimicamente per evitare il consumo da parte di predatori 10. Nel tentativo di introdurre l&#39;empirismo a quello che era il lavoro altrimenti descrittivo sulle specie abbondanze, alcuni ecologisti hanno cominciato estrapolando difese chimiche da saggi di tossicità 11. La maggior parte dei test di tossicità l&#39;esposizione di pesci interi o di altri organismi a sospensioni acquose di estratti organici grezzi di tessuti invertebrati, con successiva determinazione delle concentrazioni in massa a secco di estratti responsabili dell&#39;uccisione metà gli organismi di analisi. Tuttavia, i saggi di tossicità non emulare il modo in cui i potenziali predatori percepiscono preda in condizioni naturali, e gli studi successivi hanno trovato alcuna relazione tra la tossicità e l&#39;appetibilità 12-13. E &#39;sorprendente che le pubblicazioni su riviste prestigiose utilizzate tecniche minimo o nullo ecological rilevanza 14-15 e oggi che questi studi sono ancora ampiamente citati. E &#39;ancora più allarmante notare che gli studi basati su dati di tossicità continuano ad essere pubblicati 16-18. Il metodo di analisi biologico descritto è stato sviluppato alla fine del 1980 per fornire un approccio ecologicamente rilevante per gli ecologi marini chimiche per valutare le difese chimiche antipredatory. Il metodo richiede un modello predatore di assaggiare un estratto organico greggio da parte dell&#39;organismo bersaglio ad una concentrazione naturale in un punto di vista nutrizionale analoga matrice alimentare, fornendo dati appetibilità che sono più ecologicamente significativo di dati sulla tossicità. L&#39;approccio generale per valutare l&#39;attività antipredatory dei tessuti di organismi marini comprende quattro criteri importanti: (1) un appropriato predatore generalista deve essere utilizzato in saggi di alimentazione, (2) metaboliti organici di tutte le polarità devono essere esaustivo estratte dal tessuto del bersaglio organismo, (3) i metaboliti devono be mescolato in un alimento nutrizionalmente sperimentale appropriata alla stessa concentrazione volumetrica come trovato nell&#39;organismo da cui sono stati estratti, e (4) il disegno sperimentale e approccio statistico devono fornire una metrica significativa per indicare relativa distastefulness. La procedura descritta di seguito è stato progettato specificamente per valutare le difese chimiche antipredatory in Caraibi invertebrati marini. Impieghiamo il wrasse bluehead, Thalassoma bifasciatum, come un modello di pesce predatore, perché questa specie è comune in barriere coralline dei Caraibi ed è noto per degustare un vasto assortimento di invertebrati bentonici 19. Tissue da parte dell&#39;organismo bersaglio viene dapprima estratta, poi combinata con una miscela di cibo, e infine offerto ai gruppi di T. bifasciatum osservare se rifiutano i cibi estratto trattati. Dati del dosaggio con questo metodo hanno fornito importanti conoscenze sulla chimica di difesa degli organismi marini 12,20-21, lstoria ife compromessi 22-24, e la comunità ecologia 25-26.

<table><tbody><tr><td>Dichloromethane</td><td>Fisher Scientific</td><td>D37-20</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A41220</td><td></td></tr><tr><td>Anhydrous Calcium Chloride</td><td>Fisher Scientific</td><td>C614-500</td><td></td></tr><tr><td>Cryocool Heat Transfer Fluid</td><td>Fisher Scientific</td><td>20-548-146</td><td>For vacuum concentrator</td></tr><tr><td>Alginic Acid Sodium Salt High Viscosity</td><td>MP Biomedicals</td><td>154723</td><td></td></tr><tr><td>Squid mantle rings</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Can be purchased at grocery store</td></tr><tr><td>Denatonium benzoate</td><td>Aldrich</td><td>D5765</td><td></td></tr><tr><td>50 ml graduated centrifuge tube</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>20 ml scintillation vial</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-337-7</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Pasteur pipets</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20D</td><td></td></tr><tr><td>Rubber bulbs for Pasteur pipets</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-448-24</td><td></td></tr><tr><td>Red bulbs for pellet delivery</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-448-27</td><td></td></tr><tr><td>250 ml round-bottom flask</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-067E</td><td></td></tr><tr><td>Scintillation vial adapter for rotavap</td><td>Fisher Scientific</td><td>K747130-1324</td><td></td></tr><tr><td>Weightboats</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-202B</td><td></td></tr><tr><td>Microspatula</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-401-10</td><td></td></tr><tr><td>5 ml graduated syringe</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-817-53</td><td></td></tr><tr><td>10 ml graduated syringe</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-817-54</td><td></td></tr><tr><td>Razor blade</td><td>Fisher Scientific</td><td>S17302</td><td></td></tr></tbody></table>

a fish-feeding laboratory bioassay to assess the antipredatory activity of secondary metabolites from the tissues of marine organisms

Marine chemical ecology is a young discipline, having emerged from the collaboration of natural products chemists and marine ecologists in the 1980s with the goal of examining the ecological functions of secondary metabolites from the tissues of marine organisms. The result has been a progression of protocols that have increasingly refined the ecological relevance of the experimental approach. Here we present the most up-to-date version of a fish-feeding laboratory bioassay that enables investigators to assess the antipredatory activity of secondary metabolites from the tissues of marine organisms. Organic metabolites of all polarities are exhaustively extracted from the tissue of the target organism and reconstituted at natural concentrations in a nutritionally appropriate food matrix. Experimental food pellets are presented to a generalist predator in laboratory feeding assays to assess the antipredatory activity of the extract. The procedure described herein uses the bluehead, Thalassoma bifasciatum, to test the palatability of Caribbean marine invertebrates; however, the design may be readily adapted to other systems. Results obtained using this laboratory assay are an important prelude to field experiments that rely on the feeding responses of a full complement of potential predators. Additionally, this bioassay can be used to direct the isolation of feeding-deterrent metabolites through bioassay-guided fractionation. This feeding bioassay has advanced our understanding of the factors that control the distribution and abundance of marine invertebrates on Caribbean coral reefs and may inform investigations in diverse fields of inquiry, including pharmacology, biotechnology, and evolutionary ecology.

Qui riportiamo i risultati di questo saggio biologico per sei specie di spugne caraibiche comuni (Figura 2). Questi dati sono stati inizialmente pubblicati nel 1995 da Pawlik et al. 12 e dimostrano la potenza di questo approccio per esaminare le differenze nelle strategie di difesa chimiche tra taxa concomitanti. I risultati sono stati riportati come un numero medio di pellet cibo mangiato + errore standard (SE) per ogni specie. Quasi nessun pellet sono stati consumati in test con es...

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A Fish-feeding Laboratory Bioassay to Assess the Antipredatory Activity of Secondary Metabolites from the Tissues of Marine Organisms

Questo saggio biologico si avvale di un modello di pesce predatore per valutare la presenza di metaboliti di alimentazione-deterrenti da estratti organici dei tessuti degli organismi marini a concentrazioni naturali utilizzando un punto di vista nutrizionale analoga matrice alimentare.

Un pesce-alimentare Laboratorio Bioassay per valutare l&#39;attività di antipredatory Secondary metaboliti dai tessuti di organismi marini

Marine chemical ecology is a young discipline, having emerged from the collaboration of natural products chemists and marine ecologists in the 1980s with ...

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Universidad San Sebastian

Research

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9.4K Views.  University of North Carolina Wilmington.  Questo saggio biologico si avvale di un modello di pesce predatore per valutare la presenza di metaboliti di alimentazione-deterrenti da estratti organici dei tessuti degli organismi marini a concentrazioni naturali utilizzando un punto di vista nutrizionale analoga matrice alimentare. 

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Laboratory Estimation of Net Trophic Transfer Efficiencies of PCB Congeners to Lake Trout (Salvelinus namaycush) from Its Prey

A technique for laboratory estimation of net trophic transfer efficiency (&#947;) of polychlorinated biphenyl (PCB) congeners to piscivorous fish from their prey is described herein. During a 135-day laboratory experiment, we fed bloater (Coregonus hoyi) that had been caught in Lake Michigan to lake trout (Salvelinus namaycush) kept in eight laboratory tanks. Bloater is a natural prey for lake trout. In four of the tanks, a relatively high flow rate was used to ensure relatively high activity by the lake trout, whereas a low flow rate was used in the other four tanks, allowing for low lake trout activity. On a tank-by-tank basis, the amount of food eaten by the lake trout on each day of the experiment was recorded. Each lake trout was weighed at the start and end of the experiment. Four to nine lake trout from each of the eight tanks were sacrificed at the start of the experiment, and all 10 lake trout remaining in each of the tanks were euthanized at the end of the experiment. We determined concentrations of 75 PCB congeners in the lake trout at the start of the experiment, in the lake trout at the end of the experiment, and in bloaters fed to the lake trout during the experiment. Based on these measurements, &#947; was calculated for each of 75 PCB congeners in each of the eight tanks. Mean &#947; was calculated for each of the 75 PCB congeners for both active and inactive lake trout. Because the experiment was replicated in eight tanks, the standard error about mean &#947; could be estimated. Results from this type of experiment are useful in risk assessment models to predict future risk to humans and wildlife eating contaminated fish under various scenarios of environmental contamination.

Laboratory Estimation of Net Trophic Transfer Efficiencies of PCB Congeners to Lake Trout Salvelinus namaycush from Its Prey

A technique for laboratory estimation of net trophic transfer efficiency of polychlorinated biphenyl (PCB) congeners to piscivorous fish from their prey is presented. To maximize applicability of the laboratory results to the field, the piscivorous fish should be fed prey fish that are typically eaten in the field.

Laboratorio Stima di Net trofiche trasferimento incrementi di efficienza di congeneri di PCB a Lake Trout (<em&gt; Salvelinus namaycush</em&gt;) Dalla sua preda

A technique for laboratory estimation of net trophic transfer efficiency (&#947;) of polychlorinated biphenyl (PCB) congeners to piscivorous fish from ...

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Ambiente

Assaying Predatory Feeding Behaviors in Pristionchus and Other Nematodes

This protocol provides multiple methods for the analysis and quantification of predatory feeding behaviors in nematodes. Many nematode species including Pristionchus pacificus display complex behaviors, the most striking of which is the predation of other nematode larvae. However, as these behaviors are absent in the model organism Caenorhabditis elegans, they have thus far only recently been described in detail along with the development of reliable behavioral assays 1. These predatory behaviors are dependent upon phenotypically plastic but fixed mouth morphs making the correct identification and categorization of these animals essential. In P. pacificus there are two mouth types, the stenostomatous and eurystomatous morphs 2, with only the wide mouthed eurystomatous containing an extra tooth and being capable of killing other nematode larvae. Through the isolation of an abundance of size matched prey larvae and subsequent exposure to predatory nematodes, assays including both "corpse assays" and "bite assays" on correctly identified mouth morph nematodes are possible. These assays provide a means to rapidly quantify predation success rates and provide a detailed behavioral analysis of individual nematodes engaged in predatory feeding activities. In addition, with the use of a high-speed camera, visualization of changes in pharyngeal activity including tooth and pumping dynamics are also possible.

Assaying Predatory Feeding Behaviors in Pristionchus and Other Nematodes

Behavioral assays provide powerful tools for understanding neuronal function. Here we present several protocols for quantifying predatory feeding behavior found in the model nematode Pristionchus pacificus and its relatives. Additionally, we provide methods for analyzing predatory feeding adaptations including mouth structures and teeth.

Saggio comportamenti alimentari predatori in<em&gt; Pristionchus</em&gt; E altri nematodi

This protocol provides multiple methods for the analysis and quantification of predatory feeding behaviors in nematodes. Many nematode species including ...

Ecotoxicological Method with Marine Bacteria Vibrio anguillarum to Evaluate the Acute Toxicity of Environmental Contaminants

Bacteria are an important component of the ecosystem, and microbial community alterations can have a significant effect on biogeochemical cycling and food webs. Toxicity testing based on microorganisms are widely used because they are relatively quick, reproducible, cheap, and are not associated with ethical issues. Here, we describe an ecotoxicological method to evaluate the biological response of the marine bacterium Vibrio anguillarum. This method assesses the acute toxicity of chemical compounds, including new contaminants such as nanoparticles, as well as environmental samples. The endpoint is the reduction of bacterial culturability (i.e., the capability to replicate and form colonies) due to exposure to a toxicant. This reduction can be generally referred to as mortality. The test allows for the determination of the LC50, the concentration that causes a 50% decrease of bacteria actively replicating and forming colonies, after a 6 h exposure. The culturable bacteria are counted in terms of colony forming units (CFU), and the &#34;mortality&#34; is evaluated and compared to the control. In this work, the toxicity of copper sulphate (CuSO4) was evaluated. A clear dose-response relationship was observed, with a mean LC50 of 1.13 mg/L, after three independent tests. This protocol, compared to existing methods with microorganisms, is applicable in a wider range of salinity and has no limitations for colored/turbid samples. It uses saline solution as the exposure medium, avoiding any possible interferences of growth medium with the investigated contaminants. The LC50 calculation facilitates comparisons with other bioassays commonly applied to ecotoxicological assessments of the marine environment.

Ecotoxicological Method with Marine Bacteria Vibrio anguillarum to Evaluate the Acute Toxicity of Environmental Contaminants

This work describes a new protocol to assess the ecotoxicity of pollutants, including emerging contaminants such as nanomaterials, using the marine bacterium Vibrio anguillarum. This method allows for the determination of the LC50, or mortality, the concentration that causes a 50% decrease in bacteria culturability, after a 6 h exposure.

Metodo ecotossicologico con i batteri marini<em&gt; Vibrio anguillarum</em&gt; Per valutare la tossicità acuta dei contaminanti ambientali

Bacteria are an important component of the ecosystem, and microbial community alterations can have a significant effect on biogeochemical cycling and food ...

The Identification of Sea Lamprey Pheromones Using Bioassay-Guided Fractionation

Bioassay-guided fractionation is an iterative approach that uses the results of physiological and behavioral bioassays to guide the isolation and identification of an active pheromone compound. This method has resulted in the successful characterization of the chemical signals that function as pheromones in a wide range of animal species. Sea lampreys rely on olfaction to detect pheromones that mediate behavioral or physiological responses. We use this knowledge of fish biology to posit functions of putative pheromones and to guide the isolation and identification of active pheromone components. Chromatography is used to extract, concentrate, and separate compounds from the conditioned water. Electro-olfactogram (EOG) recordings are conducted to determine which fractions elicit olfactory responses. Two-choice maze behavioral assays are then used to determine if any of the odorous fractions are also behaviorally active and induce a preference. Spectrometric and spectroscopic methods provide the molecular weight and structural information to assist with the structure elucidation. The bioactivity of the pure compounds is confirmed with EOG and behavioral assays. The behavioral responses observed in the maze should ultimately be validated in a field setting to confirm their function in a natural stream setting. These bioassays play a dual role to 1) guide the fractionation process and 2) confirm and further define the bioactivity of isolated components. Here, we report the representative results of a sea lamprey pheromone identification that exemplify the utility of the bioassay-guided fractionation approach. The identification of sea lamprey pheromones is particularly important because a modulation of its pheromone communication system is among the options considered to control the invasive sea lamprey in the Laurentian Great Lakes. This method can be readily adapted to characterize the chemical communication in a broad array of taxa and shed light on waterborne chemical ecology.

Here, we present a protocol to isolate and characterize the structure, olfactory potency, and behavioral response of putative pheromone compounds of sea lampreys.

L'identificazione di feromoni Petromyzon marinus mediante frazionamento analisi biologica-Guida

Bioassay-guided fractionation is an iterative approach that uses the results of physiological and behavioral bioassays to guide the isolation and ...

Biochimica

Experimental Protocol for Examining Behavioral Response Profiles in Larval Fish: Application to the Neuro-stimulant Caffeine

Fish models and behaviors are increasingly used in the biomedical sciences; however, fish have long been the subject of ecological, physiological and toxicological studies. Using automated digital tracking platforms, recent efforts in neuropharmacology are leveraging larval fish locomotor behaviors to identify potential therapeutic targets for novel small molecules. Similar to these efforts, research in the environmental sciences and comparative pharmacology and toxicology is examining various behaviors of fish models as diagnostic tools in tiered evaluation of contaminants and real-time monitoring of surface waters for contaminant threats. Whereas the zebrafish is a popular larval fish model in the biomedical sciences, the fathead minnow is a common larval fish model in ecotoxicology. Unfortunately, fathead minnow larvae have received considerably less attention in behavioral studies. Here, we develop and demonstrate a behavioral profile protocol using caffeine as a model neurostimulant. Though photomotor responses of fathead minnows were occasionally affected by caffeine, zebrafish&#160;were markedly more sensitive for photomotor and locomotor endpoints, which responded at environmentally relevant levels. Future studies are needed to understand comparative behavioral sensitivity differences among fish with age and time of day, and to determine whether similar behavioral effects would occur in nature and be indicative of adverse outcomes at the individual or population levels of biological organization.

Here, we present a protocol to examine larval zebrafish and fathead minnow locomotor activities and photomotor responses (PMR) using an automated tracking software. When incorporated in common toxicology bioassays, analyses of these behaviors provide a diagnostic tool to examine chemical bioactivity. This protocol is described using caffeine, a model neurostimulant.

Protocollo sperimentale per l'esame di profili di risposta comportamentale nel pesce larvale: applicazione alla caffeina Neuro-stimolante

Fish models and behaviors are increasingly used in the biomedical sciences; however, fish have long been the subject of ecological, physiological and ...

Identification of Hemolytic and Phospholipase Activity in Crude Extracts from Sea Anemones by Straightforward Bioassays

Sea anemone venom composition includes polypeptide and non-proteins molecules. Cytolytic components have a high biotechnological and biomedical potential for designing new molecular tools. Sea anemone venom locates in glandular cells from ectoderm and sub-cellular structures called nematocysts, both of which are distributed throughout the sea anemone body. This characteristic implies challenges because the cells and nematocyst must be lysed to release the venom components with other non-toxic molecules. Therefore, first, the venom is derived from a crude extract (mixture of different and diverse molecules and tissue debris). The next step is to detect polypeptides with specific bioactivities. Here, we describe an efficient strategy to obtain the sea anemone crude extract and bioassay to identify the presence of cytolysins. The first step involves inexpensive and straightforward techniques (stirred and freeze-thaw cycle) to release cytolysins. We obtained the highest cytolytic activity and protein (~500 mg of protein from 20 g of dry weight). Next, the polypeptide complexity of the extract was analyzed by SDS-PAGE gel detecting proteins with molecular weights between 10 kDa and 250 kDa. In the hemolytic assay, we used sheep red blood cells and determined HU50 (11.1 &plusmn; 0.3 &#181;g/mL). In contrast, the presence of phospholipases in the crude extract was determined using egg yolk as a substrate in a solid medium with agarose. Overall, this study uses an efficient and inexpensive protocol to prepare the crude extract and applies replicable bioassays to identify cytolysins, molecules with biotechnological and biomedical interests.

Here, we describe a protocol to obtain crude venom extract from sea anemone and detect its hemolytic and phospholipase activity.

Identificazione dell'attività emolitica e fosfolipasi in estratti grezzi di anemoni di mare mediante saggi biologici semplici

Sea anemone venom composition includes polypeptide and non-proteins molecules. Cytolytic components have a high biotechnological and biomedical potential ...

Lethality Bioassay Using Artemia salina L.

Natural products have been used since ancient times to produce medicines. Nowadays, there are plenty of chemotherapeutic drugs obtained from natural sources and used against a plethora of diseases. Unfortunately, most of these compounds often display systemic toxicity and adverse effects. In order to better evaluate the tolerability of selected potentially bioactive samples, brine shrimp (Artemia salina) is generally used as a model in lethality studies. The A. salina test is based on the ability of the studied bioactive compounds to kill the microcrustaceans in their larval stage (nauplii). This method represents a convenient starting point for cytotoxicity studies, as well as for the general toxicity screening of synthetic, semisynthetic, and natural products. It can be considered a simple, quick, and low-cost assay, compared to many other assays (in vitro cells or yeast strains, zebrafish, rodents) generally suitable for the aforementioned purposes; moreover, it can be easily performed even without any specific training. Overall, A. salina assay represents a useful tool for the preliminary toxicity evaluation of selected compounds and the bio-guided fractionation of natural product extracts.

Lethality Bioassay Using Artemia salina L.

This work aims to evaluate and review the Artemia salina lethality bioassay procedure, also identified as brine shrimp lethality assay. This simple and cheap method gives information about the general toxicity (considered as a preliminary toxicity evaluation) of samples, namely, natural products.

Saggio biologico di letalità con Artemia salina L.

Natural products have been used since ancient times to produce medicines. Nowadays, there are plenty of chemotherapeutic drugs obtained from natural ...

Chimica

Batteria di test comportamentali per valutare gli effetti neurotossici nel pesce zebra adulto

Neurotoxicity Assessment in Adult Danio rerio using a Battery of Behavioral Tests in a Single Tank

The presence of neuropathological effects proved to be, for many years, the main endpoint for assessing the neurotoxicity of a chemical substance. However, in the last 50 years, the effects of chemicals on the behavior of model species have been actively investigated. Progressively, behavioral endpoints were incorporated into neurotoxicological screening protocols, and these functional outcomes are now routinely used to identify and determine the potential neurotoxicity of chemicals. Behavioral assays in adult zebrafish provide a standardized and reliable means to study a wide range of behaviors, including anxiety, social interaction, learning, memory, and addiction. Behavioral assays in adult zebrafish typically involve placing the fish in an experimental arena and recording and analyzing their behavior using video tracking software. Fish can be exposed to various stimuli, and their behavior can be quantified using a variety of metrics. The novel tank test is one of the most accepted and widely used tests to study anxiety-like behavior in fish. The shoaling and social preference tests are useful in studying the social behavior of zebrafish. This assay is particularly interesting since the behavior of the entire shoal is studied. These assays have proven to be highly reproducible and sensitive to pharmacological and genetic manipulations, making them valuable tools for studying the neural circuits and molecular mechanisms underlying behavior. Additionally, these assays can be used in drug screening to identify compounds that may be potential modulators of behavior.
We will show in this work how to apply behavioral tools in fish neurotoxicology, analyzing the effect of methamphetamine, a recreational drug, and glyphosate, an environmental pollutant. The results demonstrate the significant contribution of behavioral assays in adult zebrafish to the understanding of the neurotoxicological effects of environmental pollutants and drugs, in addition to providing insights into the molecular mechanisms that may alter neuronal function.

Autore in primo piano: Valutazione dei cambiamenti comportamentali ambientali e indotti da farmaci nel pesce zebra adulto 

Here, we present a comprehensive behavioral test battery, including the novel tank, Shoaling, and social preference tests, to effectively determine the potential neurotoxic effects of chemicals (e.g., methamphetamine and glyphosate) on adult zebrafish using a single tank. This method is relevant to neurotoxicity and environmental research.

Un pesce-alimentare Laboratorio Bioassay per valutare l'attività di antipredatory Secondary metaboliti dai tessuti di organismi marini

Riepilogo

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Laboratorio Stima di Net trofiche trasferimento incrementi di efficienza di congeneri di PCB a Lake Trout (

Saggio comportamenti alimentari predatori in

Metodo ecotossicologico con i batteri marini

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Protocollo sperimentale per l'esame di profili di risposta comportamentale nel pesce larvale: applicazione alla caffeina Neuro-stimolante

Identificazione dell'attività emolitica e fosfolipasi in estratti grezzi di anemoni di mare mediante saggi biologici semplici

Saggio biologico di letalità con Artemia salina L.

Valutazione della neurotossicità in Danio rerio adulto utilizzando una batteria di test comportamentali in un singolo serbatoio

Valutazione della neurotossicità in Danio rerio adulto utilizzando una batteria di test comportamentali in un singolo serbatoio

Valutazione della neurotossicità in Danio rerio adulto utilizzando una batteria di test comportamentali in un singolo serbatoio