Name: a possible zebrafish model of polycystic kidney disease: knockdown of wnt5a causes cysts in zebrafish kidneys
Uploaded: 2014-12-02T11:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
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Questo lavoro è stato supportato dal NIH (DK093625 di LH e DK069909 e DK047757 a JHL) e la VA (Merit Award I01BX000820 a JHL). Vorremmo ringraziare il Dr. Michael Pack and Dr. Jie Egli presso l&#39;Università della Pennsylvania Zebrafish core per fornire supporto essenziale.

NOTA: Etica Dichiarazione: Tutti gli esperimenti di zebrafish sono stati approvati dalla cura e l&#39;uso degli animali Comitato Istituzionale presso la Virginia Medical School orientale. 1. Morpholino Preparazione <ol><li> Progettazione e sintesi di traduzione-bloccante (AUG-) e-giunzione inibizione (Splice-) antisenso morfolino (MO) oligonucleotidi per il gene di interesse secondo le istruzioni del produttore (Figura 1A). Si prega di consultare le informazioni del produttore nella tabella 1. NOTA: MO vengono spediti come scorte liofilizzati in bottiglie di vetro. </li><li> Aggiungere acqua sterile alta qualità per le bottiglie di vetro per risospendere MOs ad una concentrazione finale di 25 mg / mL. Assicurarsi che l&#39;oligonucleotide è completamente sciolto. Se alcuni resti solidi, riscaldare il flaconcino contenente la soluzione di riserva oligonucleotide a 65 ° C per 5 a 10 minuti e vortex brevemente. </li><li> Conservare la soluzione di riserva MO a RT. Non riporli a -20 ° 4 ° C o; C perché le temperature più basse possono provocare l&#39;oligonucleotide MO di legarsi alla parete del contenitore. Misurare la concentrazione della soluzione madre utilizzando uno spettrofotometro (fare riferimento alla Tabella 1) ogni volta che un nuovo MO soluzione madre è fatto. </li><li> Preparare la soluzione di lavoro MO il giorno dell&#39;iniezione diluendo la soluzione madre con acqua sterile alta qualità alla dose desiderata. Aggiungere 0,5% di fenolo-rosso per raggiungere una concentrazione di 0,05%. Ad esempio, per rendere soluzione di lavoro 5 microlitri con una concentrazione di 15 ng / nL, aggiungere 3 microlitri soluzione stock MO e 0,5 microlitri 0,5% di fenolo-rosso a 1,5 ml di acqua. NOTA: Con questa concentrazione di lavoro, ogni goccia (500 pl) di iniezione contiene 7,5 ng di MO e due gocce contiene 15 ng di MO. </li></ol> 2. Preparazione del Apparato Injection <ol><li> Vetro Acquisto aghi pre-tirato (vedi Tabella 1 per informazioni dettagliate). In alternativa, tirare l&#39;iniezione di vetro ago with un estrattore ago. </li><li> Accendere il compressore d&#39;aria e regolare l&#39;impostazione di 50 psi pressione. Accendere la sorgente di luce microscopio da dissezione e Pico pompa micro-iniezione e regolare le impostazioni come segue: mantenere la pressione 20 psi, espellere pressione 10 psi, valore periodo di 2,5 e 100 msec gamma di gating. </li><li> Caricare il bicchiere ago pre-stirato con 5 ml di soluzione di iniezione e inserire l&#39;ago in posizione verticale con la punta rivolta verso il basso. Attendere che tutta la soluzione raggiunge la punta dell&#39;ago con bolle d&#39;aria visibili. Posizionare il porta-aghi in una posizione appropriata vicino al microscopio e inserire l&#39;ago di vetro nel supporto. Regolare l&#39;angolo di iniezione a 45 gradi. </li><li> Portare la punta dell&#39;ago in vista al microscopio, alta dal palco, e concentrarsi sulla regione più sottile della punta. Spezzare la punta dell&#39;ago con una pinzetta punta fine. </li><li> Posizionare un righello e un tubo capillare con diametro interno di 0,15 mm di lato a fianco al microscopio;iniettare la soluzione in una estremità del tubo capillare per effettuare una colonna di liquido. Regolare il tempo di espulsione per raggiungere ogni 17 gocce per 1 mm di colonna lunghezza di liquido, poi il volume di ogni goccia è 1 NL (volume goccia = π x raggio 2 x lunghezza (di colonna di liquido) / count (di gocce). NOTA: Una goccia di diametro 0,1 mm restituisce un volume di iniezione di circa 500 pl (volume goccia = 4/3 x π x raggio 3). </li></ol> 3. Preparazione di fertilizzato Zebrafish embrioni e iniezione con Morpholinos <ol><li> Impostare Tg (wt1b: GFP) transgenici coppie nidificanti zebrafish secondo protocolli pubblicati per la zootecnia zebrafish di serie e la manutenzione. Raccogliere gli embrioni dopo progenie naturale, e tenerli in una piastra di Petri 10 centimetri riempito con acqua E3 (5mm NaCl, KCl 0,17 mm, 0,33 mM CaCl 2, 0,33 MgSO mm 4). Inizia iniezione MO subito 13. Monitorare dell&#39;embrione morfologia al microscopio e assicurarsi iniezione MO è al onefase delle cellule, o al più tardi nella fase quattro celle. <ol><li> Trasferire gli embrioni di una capsula di Petri 10 centimetri con il cuneo a forma di agar depressioni. Aspirare l&#39;acqua E3 supplementare e premere delicatamente gli embrioni nelle depressioni. </li><li> Manipolare gli embrioni con la micropipetta di visualizzare 1-cellule di embrioni stadio sotto il microscopio da dissezione. Penetrare il corion e poi il tuorlo di iniettare una o due gocce di MO nel tuorlo (1 goccia = 500 pl). Trasferire gli embrioni iniettati di 10 cm capsula di Petri con acqua E3 e incubare a 28,5 ° C. </li></ol></li><li> Dopo le iniezioni, rimuovere gli embrioni morti e registrare il numero di embrioni iniettati. Sostituire l&#39;acqua E3 nel piatto ogni 24-48 ore. </li></ol> 4. Esperimenti fenotipo di soccorso <ol><li> Selezionare un ortologo da un&#39;altra specie che ha una diversa struttura di coppia di base principale (di solito 3-7 coppie di basi disallineamenti) ed è, quindi, resistenti al MO, per il soccorso. Ad esempio, in questo esperimento, abbiamo sceltoMouse perché la sequenza del mouse Wnt5a mRNA è differente dalla sequenza zebrafish. </li><li> Progettare un set di primer con il primer forward partenza dal sito traslazionale e il primer reverse da vicino alla fine della regione codificante mRNA. Aggiungere una sequenza promotore T7 alla 5&#39;fine della sequenza primer forward. In questo esperimento, abbiamo utilizzato le seguenti sequenze di primer; avanti: 5&#39;-TAA tac gac tca tag cta cta gga tga TGC TGC tga agc tga a- 3 &#39;e retromarcia: 5&#39;-TCA ctt gca gac gta ctg gtc- 3&#39;. </li><li> Eseguire Polymerase Chain Reaction 50 microlitri (PCR) con il set di primer (0,5 mM di ciascun primer) progettati sopra e 0.1 mg DNA stampo contenente il mouse Wnt5a sequenza cDNA con il seguente programma PCR: 1 ciclo a 95 ° C per 5 min; 35 cicli di 95 ° C (30 sec), 58,5 ° C (30 sec), 72 ° C (1 minuto); e passo estensione finale a 72 ° C per 7 minuti. </li><li> Dopo aver terminato tegli ciclo, eseguito 2 ml di prodotto di PCR su 1% gel per assicurarsi che la banda è la dimensione giusta. Purificare il prodotto di PCR con un kit di purificazione PCR secondo le istruzioni del produttore. Controllare concentrazione di DNA con uno spettrofotometro. Conservare il prodotto di PCR purificato a -20 ° C o utilizzare direttamente capped trascrizione dell&#39;RNA nel passaggio successivo. </li><li> Sintetizzare in vitro capped mRNA con un kit di sintesi di RNA capped secondo le istruzioni del produttore. Diluire il mRNA in 20 microlitri RNasi acqua gratuita e determinare la concentrazione. Aliquota della RNA e conservare a -80 ° C. </li><li> Il giorno dell&#39;iniezione, preparare una soluzione di lavoro del mRNA con RNasi acqua sterile libera. Si noti che il 40 pg è generalmente la dose massima RNA in cui effetti non specifici o tossici del RNA non si verificano. Mantenere la soluzione di lavoro su ghiaccio. Iniettare l&#39;embrione con MO e quindi l&#39;mRNA di salvataggio, o co-iniezione di entrambi insieme. Ad esempio, se la concentrazione del prepar mRNAed al passo 4.5 è 0,6 mg / mL, aggiungere 0,67 ml di mRNA (0,4 mg) di 4,33 ml di acqua RNasi libero di fare una concentrazione finale di 0,08 mg / mL, allora una goccia (500 pl) di ciascuna iniezione contiene 40 pg di mRNA. Preparare MO come descritto al punto 3. </li></ol> 5. Preparazione di embrioni iniettati per Imaging fluorescente <ol><li> Dopo incubazione a 28,5 ° CO / N, aggiungere 0,003% N-feniltiourea (PTU) all&#39;acqua E3 per prevenire melanizzazione, che colpisce l&#39;osservazione della struttura pronephros mediante microscopia a fluorescenza. Tuttavia, non aggiungere PTU prima gastrulation, perché colpisce sviluppo embrionale precoce. </li><li> Al 48 HPF, dechorionate manualmente gli embrioni con pinzette sottili. Prendere le immagini di 48 e di 72 embrioni HPF al microscopio dissezione luce. NOTA: Queste immagini possono essere prese senza anestesia. </li><li> Circa 10 minuti prima di imaging al microscopio a fluorescenza, anestetizzare gli embrioni mettendoli inuna capsula di Petri 10 centimetri contenente 160 mg / ml tamponata Tricaine. Attendere 5-10 minuti, quindi toccare leggermente il zebrafish per verificare che non si muovono e quindi l&#39;anestesia sta lavorando. </li><li> Dopo gli embrioni vengono anestetizzati, montarli in 3% metilcellulosa e li orientano in posizione prona sotto un microscopio da dissezione (fare riferimento alla Tabella 1). </li><li> Osservare la struttura pronephros sotto un microscopio a fluorescenza (fare riferimento alla Tabella 1) e scattare foto a diversi ingrandimenti (10X e 20X). </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Rene policistico (PKD) è una delle principali cause di malattia renale allo stadio terminale nell&#39;uomo ed è caratterizzata da progressiva formazione di cisti, l&#39;allargamento renale, e lo sviluppo tubulo anormale 14. Autosomica dominante PKD (ADPKD) è una malattia genetica in cui la mutazione di una PKD1, codifica policistina-1 (PC1), o PKD2, codifica policistina-2 (PC2), i risultati di reni policistiche. Molti altri geni, in particolare quelli che codificano proteine ​​che si trovano nel cilium primario, si pensa di essere coinvolto nello sviluppo di cisti renali, e finora non c&#39;è strumento ideale per lo screening di questi geni. Descriviamo un modo veloce e facile da osservare la formazione di cisti renali dopo atterramento gene in zebrafish. Questo metodo può probabilmente essere usato per lo screening altri geni candidati PKD. Uno dei punti di forza di questa tecnica è la sua semplicità. In Tg (wt1b: GFP) zebrafish, l&#39;espressione della GFP è in glomeruli, tubuli e dotti, che lo rende un particolarely modello adatto per studiare l&#39;intera struttura del rene pronephric. Il Tg (wt1b: GFP) zebrafish permette la visualizzazione diretta delle strutture pronephric e formazione di cisti renali dopo gene abbattere. Si sospettava che Wnt5a atterramento potrebbe causare difetti PCP pathway e formazione di cisti renali nei topi. Tuttavia, knockout globale di Wnt5a è postnatale letali nei topi e non poteva essere usato per osservare la formazione di cisti renali dopo la nascita. Utilizzando il metodo descritto qui, in un breve periodo di tempo è stato stabilito che Wnt5a atterramento in zebrafish provocato formazione di cisti renali. Con questo risultato, il prossimo passo sarà quello di generare renali specifici topi knockout Wnt5a. Questa tecnica ha anche alcune limitazioni. È difficile valutare l&#39;efficacia di MOs senza una buona anticorpi, ed esclude la possibilità che la MO potrebbe inibire la funzione di un gene irrilevante per causare il fenotipo. Ampia experime Controllonti sono tenuti a superare questi problemi. Due MO distinti, il AUG-MO e la splice- MO sono stati utilizzati per valutare Wnt5a atterramento. Entrambi morphants phenocopied vicenda, e l&#39;iniezione di topo Wnt5a mRNA, resistente alle MOs a causa di una differenza nella struttura di coppie base principale, salvo il fenotipo anormale, dimostrando che il fenotipo non era dovuto a effetti &quot;off-target&quot; del MO. Il nostro modello dimostra che Wnt5a atterramento provoca rene formazione di cisti in embrioni di zebrafish. Questo metodo può essere impiegato per testare molti altri geni che sono sospettati di provocare la formazione di cisti renali, come è semplice e richiede meno tempo. Una volta che si è dimostrato che i risultati della mutazione genica dei reni formazione di cisti in zebrafish, ulteriori esperimenti possono essere condotti per indagare i meccanismi specifici di formazione di cisti renali. In questo esperimento, poiché le Wnt5a topi knockout globale sono postnatale letali e non possono essere utilizzate per observire rene formazione di cisti dopo la nascita, il prossimo passo sarà quello di generare specifici rene topi knockout Wnt5a utilizzando il sistema Cre-lox.

Zebrafish (Danio rerio) gli embrioni sono stati ampiamente utilizzati come modello per lo studio dello sviluppo del rene e rene policistico. Ci sono molti vantaggi di utilizzare zebrafish come un modello animale: la fattibilità di studiare le interazioni genetiche, la capacità di utilizzare Morpholinos antisenso (MO) per le proteine ​​atterramento, l&#39;opportunità di saggiare rapidamente un gran numero di embrioni, e la facilità di visualizzazione fenotipi organo in larve 1 vivono. I pronephros è il primo rene a sviluppare nei vertebrati ed è funzionale in zebrafish larvale 2. La struttura dei pronephros zebrafish è relativamente semplice rispetto alle metanefro mammiferi, la terza e ultima rene sviluppare nei mammiferi. Il nefrone è l&#39;unità di lavoro del rene, con ogni rene umano contenente tra 500,000-1,000,000 nefroni 3,4 e ciascun rene del mouse con circa 13.000 nefroni 5, il che rende difficile osservare la struttura singola nefrone in reni umani o il mouse. Il pesce zebra ha solo due nefroni, e ogni nefrone zebrafish contiene tutti i principali componenti presenti nel glomerulo e tubuli di topi e gli esseri umani 6 e tipi di cellule renali specializzati simili. Rispetto ad altri modelli di vertebrati, come Xenopus, nefrone zebrafish assomiglia più da vicino il nefrone mammiferi perché ha un sistema chiuso 7. Negli ultimi anni, il genoma zebrafish è stato sequenziato, permettendo l&#39;ampia introduzione di strumenti genetici, ampie risorse mutanti, e raccolte di linee giornalista transgeniche nei modelli di zebrafish. Pronefro zebrafish forme tra 12-72 ore dopo la fecondazione (HPF) e possono essere visualizzati facilmente negli embrioni trasparenti. Proteina tumore del Wilm WT1 è un fattore essenziale per lo sviluppo del rene. Linee di zebrafish transgenici che esprimono la proteina fluorescente verde (GFP) sotto il controllo del promotore wt1b Tg (wt1b: GFP) mostrano GFP espresfissione specificamente trova nelle regioni pronephric in embrioni di zebrafish, a partire dal 17 hpf 8. Nefronoftisi (NPHP), una malattia renale cistica autosomica recessiva, è causata da mutazioni di geni NPHP 9. NPHP4 atterramento da morpholino causato la formazione di cisti nel Tg (wt1b: GFP). Pesce 10 Pertanto, questo pesce transgenico è un modello adatto per osservare le strutture renali e formazione di cisti durante lo sviluppo del rene. È importante sottolineare che l&#39;influenza di modulatori di sviluppo rene può essere studiata utilizzando questo ceppo in un tempo e manodopera modo efficiente. Il nostro documento descrive l&#39;uso di Tg (wt1b: GFP) pesce come modello per visualizzare rene formazione di cisti dopo la modulazione del gene. Abbiamo usato inizio e splice-site anti-senso MOs per abbattere il gene Wnt5a in zebrafish. Wnt5a è una glicoproteina secreta non canonica della famiglia Wnt che svolge un ruolo importante nello sviluppo dei vari organi e postnatale cellularefunzione 11. Wnt5a opera attraverso percorsi Wnt non canonici, tra cui il percorso di polarità planare delle cellule (PCP), che è stato trovato a svolgere un ruolo nella divisione cellulare orientato durante renale allungamento tubolare. Wnt5a regola l&#39;/ PCP pathway Wnt formando un complesso con il recettore come tirosina chinasi (Ryk), che trasduce ulteriormente segnalazione Wnt5a formando un complesso con la proteina VANGL polarità cellulare planare 2 (Vangl2), promuovendo in tal modo la stabilità Vangl2 12. Difetti nella via PCP possono provocare divisione cellulare casuale e causare la formazione di cisti renale. Abbiamo usato il Tg (wt1b: GFP) Linea zebrafish per osservare la formazione di cisti renali dopo Wnt5a atterramento. Il Tg (wt1b: GFP) modello di zebrafish permette l&#39;imaging dal vivo e l&#39;osservazione puntuale della struttura del rene. Dopo Wnt5a atterramento, formazione di cisti renali è stato trovato con inizio alle 24 HPF; a 72 HPF, cisti potrebbero essere trovati nei glomeruli e tubuli prossimali. Questo metodo può essere utilizzato anche per sCreen altri geni che possono causare la formazione di cisti renali.

<table><tbody><tr><td>0.5% Phenol-Red</td><td>Sigma</td><td>P0290</td><td>Color indicator for injection</td></tr><tr><td>Morpholino</td><td>Genn Tools, LLC</td><td>(customized)</td><td>Customized designed to the gene of interest</td></tr><tr><td>Pre-pulled needle</td><td>Tritech Research</td><td>MINJ-PP</td><td>If large amount of needle is required, you can also purchase a needle puller and prepare the needle in the lab</td></tr><tr><td>T7 mMessage Kit</td><td>Ambion</td><td>1344</td><td>For in vitro transcription to make capped mRNA for rescue experiment</td></tr><tr><td>N-Phenylthiourea</td><td>Sigma</td><td>P7629</td><td>For prevention of melanization</td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma</td><td>A5040</td><td>Also called ethyl 3-aminobenzoate, for zebrafish anesthesia</td></tr><tr><td>Methyl Cellulose</td><td>Sigma</td><td>M-0387</td><td>For position of zebrafish&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>For purification of PCR product for cap RNA synthesis.</td></tr><tr><td>dNTP mix</td><td>Promega</td><td>U1511</td><td>For PCR</td></tr><tr><td>Tag DNA Polymerase</td><td>Invitrogen</td><td>10342-053</td><td>For PCR</td></tr><tr><td>NanoDrop spectrophotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-1000</td><td>For measure morpholino and RNA concentration</td></tr><tr><td>Air Compressor</td><td>Werther International, Inc.</td><td>Panther Compact 106</td><td>Air source for injection</td></tr><tr><td>Pico micro-injection pump</td><td>World Precision Instruments Inc</td><td>PV830 Pnematic PicoPump</td><td>Other types of microinjection system can be used.</td></tr><tr><td>Micro-manuplator</td><td>World Precision Instruments Inc</td><td>MMJR</td><td>Right-handed (MMJL for left handed)</td></tr><tr><td>Needle holder</td><td>World Precision Instruments Inc</td><td>5430-ALL</td><td>To hold needle for micromanipulation</td></tr><tr><td>Dumont Tweezers</td><td>Fine Surgical Tools</td><td>11253-20</td><td>For breaking off the needle tip</td></tr><tr><td>Dissecting microscope</td><td>Leica M205C&amp;nbsp;</td><td></td><td>For observing and imaging zebrafish embryos</td></tr><tr><td>Fluorscence microscope</td><td>Zeiss Axio Obserer D1m &amp;nbsp;</td><td></td><td>For imaging zebrafish pronephros</td></tr><tr><td>Capillary tube (I.D. 0.15 mm)</td><td>VitroCom</td><td>CV1525Q-100</td><td>For measure the volume of each injected drop</td></tr></tbody></table>

a possible zebrafish model of polycystic kidney disease: knockdown of wnt5a causes cysts in zebrafish kidneys

Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The molecular mechanisms leading to cyst formation in PKD remain somewhat unclear, but many genes are thought to be involved. Wnt5a is a non-canonical glycoprotein that regulates a wide range of developmental processes. Wnt5a works through the planar cell polarity (PCP) pathway that regulates oriented cell division during renal tubular cell elongation. Defects of the PCP pathway have been found to cause kidney cyst formation. Our paper describes a method for developing a zebrafish cystic kidney disease model by knockdown of the wnt5a gene with wnt5a antisense morpholino (MO) oligonucleotides. Tg(wt1b:GFP) transgenic zebrafish were used to visualize kidney structure and kidney cysts following wnt5a knockdown. Two distinct antisense MOs (AUG - and splice-site) were used and both resulted in curly tail down phenotype and cyst formation after wnt5a knockdown. Injection of mouse Wnt5a mRNA, resistant to the MOs due to a difference in primary base pair structure, rescued the abnormal phenotype, demonstrating that the phenotype was not due to &#8220;off-target&#8221; effects of the morpholino. This work supports the validity of using a zebrafish model to study wnt5a function in the kidney.

Wnt5a abbattere è stato ottenuto con l&#39;introduzione di traduzione bloccando MO (AUG-MO) o esone / introni splice confine MO (giuntura-MO) per zebrafish embrioni nella fase di una cella. Il AUG-MO rivolge il codone di inizio e, quindi, inibisce entrambi messaggio Wnt5a materna e zigotico. La giunzione-MO rivolge il terzo sito donatore di splicing e inibisce solo la trascrizione zygotic di Wnt5a (Figura 1A). Il AUG- e morphants splice- phenocopied vicenda con più difetti, tra cui la coda giù all&#39;asse del corpo ricci e edema pericardico (Figura 1B). Mouse Wnt5a mRNA salva parzialmente il fenotipo morphant (Figura 4B), a dimostrazione che il fenotipo non è dovuto agli effetti off-target. Il Tg (wt1b: GFP) zebrafish transgenico, che esprime GFP guidato dal promotore wt1b in modo che la GFP ricapitola espressione endogena di wt1b, è stato utilizzato per descrivere la struttura pronephric. Il Tg (WT1b: GFP) pesci mostrato formazione di cisti glomerulare dopo Wnt5a knockdown a 48 HPF, che gli embrioni di controllo iniettati con fenolo-rosso alone visualizzata normale sviluppo pronephric, formando un glomerulo fuso a forma di &quot;U&quot; con tubuli che si estendono lateralmente (figura 2). Al 72 HPF, struttura glomerulare ulteriormente sviluppato con passanti vascolari facilmente visualizzati, sia con AUG- e giunzione-MOS sviluppato cisti nel glomeruli e tubuli prossimali (Figura 3). H &amp; E colorazione delle sezioni istologiche trasversali di 72 HPF embrioni morphant rivelato la formazione di cisti, interrotto strutture glomerulari e tubuli renali dilatati (Figura 4A). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52156/52156fig1highres.jpg" /> Figura 1: il design e la luce Morpholino aspetto microscopico di embrioni di zebrafish a 72 ore dopo la fecondazione (HPF) in seguito ad iniezionecon il controllo fenolo-rosso, agosto-MO, o giunzione-MO. (A) Schema del gene zebrafish Wnt5a, la regione codificante, e le regioni oggetto di tale AUG- e splice- MO. Il Wnt5a AUG-MO è stato progettato per indirizzare il codone di inizio ATG per bloccare traduzione delle proteine; la giunzione-MO è stato progettato per indirizzare il confine di esoni 3 e 4. Splice-MO oligo dirette contro qualsiasi giunzione giunzione si prevede di generare sia una delezione dell&#39;esone singolo completo o parziale o di un inserimento totale o parziale introne unico. Abbiamo scelto di abbattere Wnt5a sia con un AUG-MO, che colpisce il messaggio materna e zigotica, e una giunta-MO, che riguarda solo la trascrizione zygotic, al fine di migliorare la specificità. (B) L&#39;embrione iniettato con fenolo-rosso ( controllo dell&#39;iniezione) ha mostrato curvatura normale del corpo, la lunghezza e il pericardio. L&#39;embrione iniettato con l&#39;AUG-MO ha mostrato la struttura verso il basso ricci coda e edema pericardico, e l&#39;embrione iniettato con la giunzione-MO phenocopied ilaspetto dell&#39;embrione iniettato con AUG-MO. Bar = 2 mm. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52156/52156fig2highres.jpg" /> Figura 2: Fluorescenza aspetto microscopico di Tg (wt1b: GFP). Zebrafish embrioni a 48 HPF dopo l&#39;iniezione con controllo di fenolo-rosso, Wnt5a AUG-MO o Wnt5a Splice-MO Nel controllo iniezione di fenolo-rosso, sviluppo pronephros era completa a 48 hpf. Due glomeruli fuse e tubuli prossimali può essere visto. Formazione di cisti può essere osservato in glomeruli sia nel AUG- e giunzione-MO embrioni a 48 HPF entro la fine del pronephros zebrafish sviluppo (bar = 100 micron). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52156/52156fig3highres.jpg" /> Figura 3: fluorescenza aspetto microscopico di Tg (wt1b: GFP) zebrafish embrioni a 72 HPF dopo l&#39;iniezione con fenolo-rossoControllo, Wnt5a AUG-MO o Wnt5a giunzione-MO. A 72 HPF, struttura glomerulare può essere chiaramente visualizzato. Nel controllo iniezione di fenolo-rosso, due glomeruli fusi e loops vascolari può essere osservato. Wnt5a atterramento portato formazione di cisti in tutte le strutture nefrone che possono essere visualizzati, tra cui i glomeruli e regione del tubulo prossimale (bar = 100 micron). <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52156/52156fig4highres.jpg" /> Figura 4: (A) H &amp; E colorazione delle sezioni istologiche trasversali di 72 embrioni hpf morphant rivelato la formazione di cisti, interrotto strutture glomerulari e tubuli renali dilatati. Freccia: glomeruli pronephric; freccia: dilatato tubulo renale. Bar = 20 micron. (B) Il fenotipo AUG-MO potrebbe essere parzialmente salvato con il mouse Wnt5a, resistente alla MO a causa di una differenza nella struttura di coppie base principale, Dimostrando in tal modo che il fenotipo non era dovuta agli effetti off-target. La differenza era statisticamente significativa a p &lt;0,05 (* P &lt;0.05 vs gruppo fenolo-rosso; # P &lt;0.05 vs AUG-MO gruppo 15 ng).

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A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

We describe a method of generating a possible zebrafish model of polycystic kidney disease. We used Tg(wt1b:GFP) fish to visualize kidney structure. Knockdown of wnt5a was by morpholino injection. Pronephric cyst formation after wnt5a knockdown was observed in this GFP transgenic zebrafish.

Un possibile modello Zebrafish della malattia del rene policistico: Knockdown di<em&gt; Wnt5a</em&gt; Provoca cisti in Zebrafish Reni

Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The ...

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A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

11.1K Views.  Eastern Virginia Medical School. We describe a method of generating a possible zebrafish model of polycystic kidney disease. We used Tg(wt1b:GFP) fish to visualize kidney structure. Knockdown of wnt5a was by morpholino injection. Pronephric cyst formation after wnt5a knockdown was observed in this GFP transgenic zebrafish. 

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Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method described here allows time-lapse analysis of normal and impaired kidney development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope equipped for structured illumination and z-stack acquisition. To visualize nephrogenesis, transgenic zebrafish (Tg(wt1b:GFP)) with fluorescently labeled kidney structures were used. Renal defects were triggered by injection of an antisense morpholino oligonucleotide against the Wilms tumor gene wt1a, a factor known to be crucial for kidney development.
The advantage of the experimental setup is the combination of a zoom microscope with simple strategies for re-adjusting movements in x, y or z direction without additional equipment. To circumvent focal drift that is induced by temperature variations and mechanical vibrations, an autofocus strategy was applied instead of utilizing a usually required environmental chamber. In order to re-adjust the positional changes due to a xy-drift, imaging chambers with imprinted relocation grids were employed.
In comparison to more complex setups for time-lapse recording with optical sectioning such as confocal laser scanning&#160;or light sheet microscopes, a zoom microscope is easy to handle. Besides, it offers dissecting microscope-specific benefits such as high depth of field and an extended working distance.
The method to study organogenesis presented here can also be used with fluorescence stereo microscopes not capable of optical sectioning. Although limited for high-throughput, this technique offers an alternative to more complex equipment that is normally used for time-lapse recording of developing tissues and organ dynamics.

The method described here allows time-lapse analysis of organ development in zebrafish embryos by using a fluorescence dissecting microscope capable of performing optical sectioning and simple strategies of readjustment to correct focal and planar drift.

Analisi dello sviluppo del rene Zebrafish con time-lapse imaging Utilizzando una dissezione microscopio dotato di sezionamento ottico

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Precise Cellular Ablation Approach for Modeling Acute Kidney Injury in Developing Zebrafish

Acute Kidney Injury (AKI) is a common medical condition with a high mortality rate. With the repair abilities of the kidney, it is possible to restore adequate kidney function after supportive treatment. However, a better understanding of how nephron cell death and repair occur on the cellular level is required to minimize cell death and to enhance the regenerative process. The zebrafish pronephros is a good model system to accomplish this goal because it contains anatomical segments that are similar to the mammalian nephron. Previously, the most common model used to study kidney injury in fish was the pharmacological gentamicin model. However, this model does not allow for precise spatiotemporal control of injury, and hence it is difficult to study cellular and molecular processes involved in kidney repair. To overcome this limitation, this work presents a method through which, in contrast to the gentamicin approach, a specific Green Fuorescent Protein (GFP)-expressing nephron segment can be photoablated using a violet laser light (405 nm). This novel model of AKI provides many advantages that other methods of epithelial injury lack. Its main advantages are the ability to &#34;dial&#34; the level of injury and the precise spatiotemporal control in the robust in vivo animal model. This new method has the potential to significantly advance the level of understanding of kidney injury and repair mechanisms.

This work presents a new in vivo model of segmental kidney injury using kidney GFP transgenic zebrafish. The model allows for the induction of the targeted ablation of kidney epithelial cells to show the cellular mechanisms of nephron injury and repair.

Approccio preciso di ablazione cellulare per la modellazione di lesioni acute del rene nello sviluppo di zebrafish

Acute Kidney Injury (AKI) is a common medical condition with a high mortality rate. With the repair abilities of the kidney, it is possible to restore ...

Shifting Zebrafish Lethal Skeletal Mutant Penetrance by Progeny Testing

Zebrafish mutant phenotypes are often incompletely penetrant, only manifesting in some mutants. Interesting phenotypes that inconsistently appear can be difficult to study, and can lead to confounding results. The protocol described here is a straightforward breeding paradigm to increase and decrease penetrance in lethal zebrafish skeletal mutants. Because lethal mutants cannot be selectively bred directly, the classic selective breeding strategy of progeny testing is employed. This method also includes protocols for Kompetitive Allele Specific PCR (KASP) genotyping zebrafish and staining larval zebrafish cartilage and bone. Applying the husbandry strategy described here can increase the penetrance of an interesting skeletal phenotype enabling more reproducible results in downstream applications. In addition, decreasing the mutant penetrance through this selective breeding strategy can reveal the developmental processes that most crucially require the function of the mutated gene. While the skeleton is specifically considered here, we propose that this methodology will be useful for all zebrafish mutant lines.

The goal of this protocol is to alter the penetrance of lethal skeletal mutant phenotypes in zebrafish by selective breeding. Lethal mutants cannot be grown to adulthood and bred themselves, therefore this protocol describes a method for tracking and selecting penetrance through multiple generations by progeny testing.

Lo spostamento di penetranza mutante scheletrica letale di Zebrafish progenie test

Zebrafish mutant phenotypes are often incompletely penetrant, only manifesting in some mutants. Interesting phenotypes that inconsistently appear can be ...

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and optical transparency. In particular, the zebrafish embryo has become an important organism to study vertebrate kidney organogenesis as well as multiciliated cell (MCC) development. To visualize MCCs in the embryonic zebrafish kidney, we have developed a combined protocol of whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) and whole mount immunofluorescence (IF) that enables high resolution imaging. This manuscript describes our technique for co-localizing RNA transcripts and protein as a tool to better understand the regulation of developmental programs through the expression of various lineage factors.

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Cilia development is vital to proper organogenesis. This protocol describes an optimized method to label and visualize ciliated cells of the zebrafish.

Visualizzazione di cellule Multiciliated in Zebrafish attraverso un protocollo combinato di tutta Monte fluorescente ibridazione In Situ e immunofluorescenza

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

Behavioral And Physiological Analysis In A Zebrafish Model Of Epilepsy

Epilepsy represents one of the most common neurological disorders, affecting an estimated 50 million people worldwide. Recent advances in genetic research have uncovered a large spectrum of genes implicated in various forms of epilepsy, highlighting the heterogeneous nature of this disorder. Appropriate animal models are essential for investigating the pathological mechanisms triggered by genetic mutations implicated in epilepsy and for developing specialized, targeted therapies. In recent years, zebrafish has emerged as a valuable vertebrate organism for modeling epilepsies, with the use of both genetic manipulation and exposure to known epileptogenic drugs, such as pentylenetetrazole (PTZ), to identify novel anti-epileptic therapeutics. Deleterious mutations in the mTOR regulator DEPDC5 have been associated with various forms of focal epilepsies and knock-down of the zebrafish orthologue causes hyperactivity associated with spontaneous seizure-like episodes, as well as enhanced electrographic activity and characteristic turn wheel swimming. Here, we described the method involved in generating the DEPDC5 loss-of-function model and illustrate the protocol for assessing motor activity at 28 and 48 h post fertilization (hpf), as well as a method for recording field activity in the zebrafish optic tectum. An illustration of the effect of the epileptogenic drug PTZ on neuronal activity over time is also provided.

Here, we present a protocol for the development and the characterization of a zebrafish model of epilepsy resulting from the transient inhibition of the DEPDC5 gene.

Analisi comportamentale e fisiologica in un modello di zebrafish di epilessia

Epilepsy represents one of the most common neurological disorders, affecting an estimated 50 million people worldwide. Recent advances in genetic research ...

Neuroscienze

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Here, we present methods for the development of assays to query potentially clinically significant nonsynonymous changes using in vivo complementation in zebrafish. Zebrafish (Danio rerio) are a useful animal system due to their experimental tractability; embryos are transparent to enable facile viewing, undergo rapid development ex vivo, and can be genetically manipulated.1 These aspects have allowed for significant advances in the analysis of embryogenesis, molecular processes, and morphogenetic signaling. Taken together, the advantages of this vertebrate model make zebrafish highly amenable to modeling the developmental defects in pediatric disease, and in some cases, adult-onset disorders. Because the zebrafish genome is highly conserved with that of humans (~70% orthologous), it is possible to recapitulate human disease states in zebrafish. This is accomplished either through the injection of mutant human mRNA to induce dominant negative or gain of function alleles, or utilization of morpholino (MO) antisense oligonucleotides to suppress genes to mimic loss of function variants. Through complementation of MO-induced phenotypes with capped human mRNA, our approach enables the interpretation of the deleterious effect of mutations on human protein sequence based on the ability of mutant mRNA to rescue a measurable, physiologically relevant phenotype. Modeling of the human disease alleles occurs through microinjection of zebrafish embryos with MO and/or human mRNA at the 1-4 cell stage, and phenotyping up to seven days post fertilization (dpf). This general strategy can be extended to a wide range of disease phenotypes, as demonstrated in the following protocol. We present our established models for morphogenetic signaling, craniofacial, cardiac, vascular integrity, renal function, and skeletal muscle disorder phenotypes, as well as others.

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Here, we present a systematic approach for developing physiologically relevant, sensitive and specific in vivo assays for interpreting variation in human pathology. Transient genetic manipulation via microinjection of WT and mutant human mRNA and morpholino (MO) antisense oligonucleotides harness the tractability of the developing zebrafish embryo to rapidly assay pathogenic mutations, especially, but not exclusively, in the context of human developmental disorders.

In Vivo Modellazione del genoma umano Morbid utilizzando Danio rerio

Here,  we present methods for the development of assays to query potentially clinically  significant nonsynonymous changes using in  vivo complementation ...

Biologia

Visualization of Craniofacial Development in the sox10: kaede Transgenic Zebrafish Line Using Time-lapse Confocal Microscopy

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, convergence and extension of facial prominences, and maturation of the craniofacial skeleton. To study the contribution of the cranial neural crest to specific regions of the zebrafish palate a sox10: kaede transgenic zebrafish line was generated. Sox10 provides lineage restriction of the kaede reporter protein to the neural crest, thereby making the cell labeling a more precise process than traditional dye or reporter mRNA injection. Kaede is a photo-convertible protein that turns from green to red after photo activation and makes it possible to follow cells precisely. The sox10: kaede transgenic line was used to perform lineage analysis to delineate CNC cell populations that give rise to maxillary versus mandibular elements and illustrate homology of facial prominences to amniotes. This protocol describes the steps to generate a live time-lapse video of a sox10: kaede zebrafish embryo. Development of the ethmoid plate will serve as a practical example. This protocol can be applied to making a time-lapse confocal recording of any kaede or similar photoconvertible reporter protein in transgenic zebrafish. Furthermore, it can be used to capture not only normal, but also abnormal development of craniofacial structures in the zebrafish mutants.

Visualization of experimental data has become a key element in presenting results to the scientific community. Generation of live time-lapse recording of growing embryos contributes to better presentation and understanding of complex developmental processes. This protocol is a step-by-step guide to cell labeling via photoconversion of kaede protein in zebrafish.

Visualizzazione di sviluppo craniofacciale nei SOX10: Kaede transgenici Zebrafish line utilizzando Time-lapse Microscopia confocale

Vertebrate palatogenesis is a highly choreographed and complex developmental process, which involves migration of cranial neural crest (CNC) cells, ...

Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys are composed of functional units known as nephrons, which are highly conserved with other vertebrates, including mammals. Research in zebrafish has recently demonstrated that two distinctive phenomena transpire after adult nephrons incur damage: first, there is robust regeneration within existing nephrons that replaces the destroyed tubule epithelial cells; second, entirely new nephrons are produced from renal progenitors in a process known as neonephrogenesis. In contrast, humans and other mammals seem to have only a limited ability for nephron epithelial regeneration. To date, the mechanisms responsible for these kidney regeneration phenomena remain poorly understood. Since adult zebrafish kidneys undergo both nephron epithelial regeneration and neonephrogenesis, they provide an outstanding experimental paradigm to study these events. Further, there is a wide range of genetic and pharmacological tools available in the zebrafish model that can be used to delineate the cellular and molecular mechanisms that regulate renal regeneration. One essential aspect of such research is the evaluation of nephron structure and function. This protocol describes a set of labeling techniques that can be used to gauge renal composition and test nephron functionality in the adult zebrafish kidney. Thus, these methods are widely applicable to the future phenotypic characterization of adult zebrafish kidney injury paradigms, which include but are not limited to, nephrotoxicant exposure regimes or genetic methods of targeted cell death such as the nitroreductase mediated cell ablation technique. Further, these methods could be used to study genetic perturbations in adult kidney formation and could also be applied to assess renal status during chronic disease modeling.

The zebrafish adult kidney is an excellent system for renal regeneration and disease studies. An essential aspect of such research is the assessment of nephron structure and function. This protocol describes several methodologies that can be implemented to assess nephron tubule composition and to evaluate renal reabsorption.

Analisi di Nefrone Composizione e funzione del rene Zebrafish adulti

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...

Acute Kidney Injury Model Induced by Cisplatin in Adult Zebrafish

Cisplatin is commonly used as chemotherapy. Although it has positive effects in cancer-treated individuals, cisplatin can easily accumulate in the kidney due to its low molecular weight. Such accumulation causes the death of tubular cells and can induce the development of Acute Kidney Injury (AKI), which is characterized by a quick decrease in kidney function, tissue damage, and immune cells infiltration. If administered in specific doses cisplatin can be a useful tool as an AKI inducer in animal models. The zebrafish has appeared as an interesting model to study renal function, kidney regeneration, and injury, as renal structures conserve functional similarities with mammals. Adult zebrafish injected with cisplatin shows decreased survival, kidney cell death, and increased inflammation markers after 24 h post-injection (hpi). In this model, immune cells infiltration and cell death can be assessed by flow cytometry and TUNEL assay. This protocol describes the procedures to induce AKI in adult zebrafish by intraperitoneal cisplatin injection and subsequently demonstrates how to collect the renal tissue for flow cytometry processing and cell death TUNEL assay. These techniques will be useful to understand the effects of cisplatin as a nephrotoxic agent and will contribute to the expansion of AKI models in adult zebrafish. This model can also be used to study kidney regeneration, in the search for compounds that treat or prevent kidney damage and to study inflammation in AKI. Moreover, the methods used in this protocol will improve the characterization of tissue damage and inflammation, which are therapeutic targets in kidney-associated comorbidities.

This protocol describes the procedures to induce Acute Kidney Injury (AKI) in adult zebrafish using cisplatin as a nephrotoxic agent. We detailed the steps to evaluate the reproducibility of the technique and two techniques to analyze inflammation and cell death in the renal tissue, flow cytometry and TUNEL, respectively.

Modello di lesione renale acuta indotto dal cisplatino nel pesce zebra adulto

Cisplatin is commonly used as chemotherapy. Although it has positive effects in cancer-treated individuals, cisplatin can easily accumulate in the kidney ...

Medicina

Evaluation of Zebrafish Kidney Function Using a Fluorescent Clearance Assay

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish kidney develops and functions in almost the same way as humans. A major difference in the construction of the human kidney is the presence of millions of nephrons compared to the zebrafish that has only two. However, simplifying such a complex system into basic functional units has aided our understanding of how the kidney develops and operates. In zebrafish, the midline located glomerulus is responsible for the initial blood filtration into two pronephric tubules that diverge to run bilaterally down the embryonic axis before fusing to each other at the cloaca. The pronephric tubules are heavily populated by motile cilia that facilitate the movement of filtrate along the segmented tubule, allowing the exchange of various solutes before finally exiting via the cloaca2-4. Many genes responsible for CKD, including those related to ciliogenesis, have been studied in zebrafish5. However, a major draw back has been the difficulty in evaluating zebrafish kidney function after genetic manipulation. Traditional assays to measure kidney dysfunction in humans have proved non translational to zebrafish, mainly due to their aquatic environment and small size. For example, it is not physically possible to extract blood from embryonic staged fish for analysis of urea and creatinine content, as they are too small. In addition, zebrafish do not produce enough urine for testing on a simple proteinuria &#8216;dipstick&#8217;, which is often performed during initial patient examinations. We describe a fluorescent assay that utilizes the optical transparency of the zebrafish to quantitatively monitor the clearance of a fluorescent dye, over time, from the vasculature and out through the kidney, to give a read out of renal function1,6-9.

The zebrafish is a popular tool to model chronic kidney disease (CKD). However, their small size makes it impossible to evaluate renal function using traditional methods. We describe a fluorescent dye kidney clearance assay1 that allows quantitative analysis of zebrafish kidney function in CKD.

Valutazione del rene Zebrafish Funzione Con un test Clearance fluorescente

The zebrafish embryo offers a tractable model to study organogenesis and model human genetic disease. Despite its relative simplicity, the zebrafish ...

Un possibile modello Zebrafish della malattia del rene policistico: Knockdown di

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