Ringraziamo Jos Burgert per aiutare con alcune delle figure. Siamo grati a Ingo Selbach (e il gruppo &quot;Edelkrebsprojekt NRW&quot;) per i suoi sforzi per fornire il laboratorio con animali da esperimento. Ringraziamo Anna C. Schneider per la correzione prime versioni del manoscritto. Questa ricerca è stata sostenuta da un Emmy Noether DFG concessione SM 206 / 3-1 e una sovvenzione di avvio dell&#39;Università di Colonia per docenti di sesso femminile.

Questa procedura dissezione è in conformità con la Comunità europee Direttiva del Consiglio del 22 settembre 2010 (2010/63 / UE). 1. Preparazione <ol><li> Ottenere gamberi, Pacifastacus leniusculus (Dana), di entrambi i sessi ≥8 cm di dimensione. Assicurarsi che gli animali sono di vitale importanza e gli arti addome e addominali sono intatte. </li><li> Fare attenzione a ispezionare il carapace e che questa cuticola è dura e rigida. Pre e animali postmolt hanno un carapace morbido e non sono adatti per gli esperimenti perché durante il processo di muta cambiare molti parametri (ad esempio, diminuzione dell&#39;attività locomotoria). </li><li> Montare tutti gli strumenti ei materiali utilizzati durante la dissezione, pinning e desheathing del cordone nervoso illustrato nella figura 2 ed elencati nei supplementi previsti. </li></ol><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52109/52109fig2highres.jpg" /> Figura 2: <sTrong&gt; Materiali e strumenti utilizzati per la dissezione, pinning e desheathing del cordone nervoso. (1) grande secchio pieno di ghiaccio; (2) salina gamberi; (3) dispenser salina; (4) microscopio dissezione; (5) piatto dissezione; (6) forbici forti; (7) forcipe (8) forbici primavera; (9) piastra Petri rivestito con chiaro Sylgard; (10) perni di fissaggio; (11) con lampade a freddo. 2. Gross Dissection <ol><li> Anestetizzare animali sul ghiaccio per il 15 - 20 min. Effettuare la prima parte della dissezione lordo a un banco di laboratorio vicino al lavandino quanto comprende una fase dissanguamento e il campione deve essere risciacquato regolarmente con gamberi salina durante la procedura. </li><li> Tenere animali lato ventrale e usare le forbici per tagliare entrambi forti artigli alle loro basi vicino al torace (Figura 3-1). Rimuovere uropod sinistra e destra (Figura 3-2). </li><li> Posizionare il lato ventrale degli animali nel piatto dissezione allineato con Sylgard nero. Elevate cefalotorace inserendo ghiaccio sotto e appuntare l&#39;addome al telson (Figura 4A). </li><li> Riempire il dispenser salina con ~ 60 ml di soluzione salina fredda gamberi. Profumato gamberi con soluzione salina fredda attraverso l&#39;apertura artiglio (Figura 4B). Salina eccesso sgocciolare attraverso i tagli alle uropods. Coprire gamberi con ghiaccio durante dissanguamento </li><li> Decapitarlo l&#39;animale con un unico taglio trasversale appena posteriormente agli occhi dell&#39;animale con le forbici forti (Figura 5A). Rimuovere tutte le gambe che camminano vicino alle articolazioni di base come indicato nella figura 5B. </li><li> Isolare l&#39;addome con gli ultimi segmenti toracici dal resto del cefalotorace. Fare un primo taglio a livello della seconda gambe piedi (segmento toracico 3) inserendo la punta delle forbici nell&#39;apertura della seconda gamba piedi e taglio al lato opposto. (Figura 6A-1). </li><li> Estendere questo primo taglio per entrambe le parti attraverso tegli cefalotorace (Figura 6A-2). </li><li> Capovolgere l&#39;animale aperto per fare alcuni degli organi interni visibili. Premere il prominente ghiandola digestiva (Figura 6B-3) per la parte anteriore del campione e utilizzare pinze per rimuovere gli organi riproduttivi dalla cavità addominale. </li><li> Togliere la parte anteriore del cefalotorace (Figura 6C). Utilizzare tagli laterali per rimuovere le parti laterali del carapace, che coprono le branchie, su entrambi i lati del torace rimanente (Figura 6D-4). Rimuovere le branchie e risciacquare il campione con soluzione fisiologica fredda. </li><li> Continuare la dissezione con un taglio attraverso l&#39;intera lunghezza della piastra sternale come indicato nella figura 6E-5. Rendere questo taglio in posizioni laterali massime tra Pleuron e swimmerets (segni rossi Figura 6 sexies). Procedere sull&#39;altro lato con un stesso taglio. Sciacquare il campione con soluzione fisiologica fredda. </li><li> Effettuare la dissezione rimanendo sotto un dissection microscopio. Posizionare addome lato ventrale del gambero di fiume nel piatto dissezione allineato con Sylgard nero e pieno di gamberi salina in modo da coprire il campione. NOTA: Le seguenti operazioni (2,12-4,8) contengono istruzioni direzionali che si applicano a sperimentatori mano destra. Nei passi seguenti (2,12-6,8), è importante sostituire gamberi salina in intervalli regolari, ogni 20-30 minuti con soluzione salina fredda, per mantenere il sistema nervoso sano. </li><li> Fissare il campione con perni di insetti posteriormente al telson e anteriormente ai resti del carapace. Posizionare il campione in modo che i punti Telson a sinistra ed è parallela al bordo del tavolo. </li><li> Utilizzare pinze grossolani nella mano sinistra per afferrare attraverso un&#39;apertura gamba piedi (Figura 7A) ed estrarre il campione aperto (Figura 7B freccia bianca). Identificare i grandi due dorsali filoni flessore muscolari (Figura 7B-1 e C-1) e tagliare loro ventralebase come illustrato nella Figura 7B. </li><li> Identificare l&#39;arteria sternale (Figura 7C-2), che scende dalla dorsale (cuore) per ventrale, al segmento toracico 4 °. Questa arteria si trova proprio sopra il cordone nervoso (Figura 7C-3), prima che si proietta sotto il cordone nervoso, formando l&#39;arteria ventrale. </li><li> Transetto l&#39;arteria sternale. Come mostrato in Figura 7C, sollevare l&#39;arteria prima, usando una lama di forbici, e solo tagliare quando il cordone nervoso ventrale trova è visibile. </li><li> Fissare i muscoli flessori dorsali anteriormente (a destra). Questo dovrebbe essere fatto in posizione di massima allungato con perni in modo da non bloccare la visione e il campione rimane tesa. Quando i filamenti muscolari dorsali sono fissi (Figura 8-1), il primo gangli addominali, A1 e A2, con i nervi associati N1, N2, N3 e sono visibili (Figura 8). </li><li> Utilizzare pinze nella mano sinistra per afferrare le specificheImen in una sola apertura delle gambe a piedi. Durante il seguente dissezione passaggi tirare delicatamente per mantenere il campione aperto. </li><li> Transect i nervi N3 nella posizione più distante dal cordone nervoso. (Figura 8-3). </li><li> Tagliare i muscoli flessori vicino al apodeme ventrale come mostrato nella Figura 8-4. Fare attenzione a non danneggiare il cordone nervoso o nervi N2. </li><li> Ripetere i passaggi 2.18 e 2.19 per i nervi N3 e dei muscoli flessori della restante gangli A2 addominale A5. </li><li> Nell&#39;ultima ganglio addominale, A6, tagliare i muscoli flessori dorsali dal apodeme ventrale e il campione dovrebbe apparire come mostrato nella Figura 9. </li><li> Tagliare la piastra posteriore sternale ai nervi della A6 (Figura 9-1) e tenere la parte ventrale (Figura 9-2). Eliminare la parte dorsale con i muscoli flessori (Figura 9-3). Fissare la piastra sternale anteriormente con perni attraverso le aperture delle gambe piedi,e posteriormente a A6. </li></ol> 3. Belle Dissection <ol><li> Porre il preparato al microscopio con la parte anteriore rivolta di distanza e la parte posteriore verso il bordo dei tavoli. </li><li> Utilizzare pinze come mostrato in Figura 10A per rimuovere le parti più anteriori della sterna cephalothoracic. NOTA: I gangli del torace e nervi associati sono in parte coperti dalla muscolatura delle gambe e sterna cephalothoracic. La sterna cephalothoracic formare uno scheletro che separa le cavità situate lateralmente delle gambe piedi una dall&#39;altra e dalla cavità mediale in cui il cordone nervoso ventrale risiede. </li><li> Tagliare i muscoli tra le rimanenti strutture Esoscheletriche come indicato in Figura 10B -1 e B2. Utilizzare pinze per afferrare e sollevare l&#39;estremità anteriore del cordone nervoso ventrale (Figura 10C). NOTA: Il cordone nervoso sarà danneggiato nel processo in modo da evitare raccogliendo Nerve il cavo più volte. </li><li> Tagliare i nervi toracici laterale mentre si solleva il cordone nervoso (Figura 10C-3). Mantenere questi nervi a lunghezza adeguata per appuntare. Rimuovere la parte spremuto della catena di gangli, che è stato raccolto con una pinza, tagliando via tutto il anterior tessuto T4 (Figura 10C-4). </li><li> Posizionare il campione con la parte anteriore verso sinistra e concentrarsi su A1. Tagliare il N1 e N2 di nervi A1 ad una lunghezza adeguata (max. 1 cm) di spinatura fuori. </li><li> Focus su A2 e identificare i nervi N1, N2, N3 e di questo segmento (Figura 11). I nervi N1 di gangli addominali A2-A5 risiedono tra due ripiegamenti cuticolari sternale in ogni segmento (Figura 11A-1) e sono coperti da muscolatura. Fare un taglio lungo la parte posteriore dello sterno ripiegamento cuticolare. Inizia il bordo laterale dell&#39;addome e procedere verso la linea mediana, come mostrato in Figura 11A. </li><li> Se la destinazione è ancora N1 coverosso con il tessuto come mostrato in Figura 11B (freccia rossa), tutto il taglio del fascio muscolare, ma questa volta anterior per entrambi ripiegamenti cuticolari sternali e il nervo N1 (Figura 11B-2). </li><li> Tagliare nervo N1 distale possibile (Figura 11 C-3). Nerve N1 è completamente visibile e il ramo anteriore e posteriore può essere identificato (Figura 11C). </li><li> Procedere alla N1 nervo controlaterale e la prima tagliare i muscoli lungo la parte posteriore dello sterno ripiegamento cuticolare, partendo medialmente, vicino il ganglio (Figura 11D). Se il nervo è ancora coperto da tessuto, tagliare il fascio muscolare, ma questa volta anterior per entrambi ripiegamenti cuticolari sternali e il nervo N1, simile alla figura 11B-2. Tagliare il N1 nervo distale possibile. </li><li> Tagliare il nervi N2 del ganglio ad una lunghezza adatta (circa. 0,5 centimetri) di spinatura. </li><li> Ripetere i passaggi 3,7-3,11 per i nervi di A3-A5. </li><li> Tagliare il nerves di ganglio A6 distalmente possibile (Figura 12A). Utilizzare pinze per afferrare più nervi di A6 per sollevare questo ganglio e avviare isolare la catena dei gangli dalla piastra sternale. </li><li> Mentre si solleva il cordone nervoso, tirare delicatamente nella parte anteriore, come mostrato nella Figura 12B (freccia bianca). Poiché i singoli gangli sono sollevati, rimuovere l&#39;arteria ventrale che può essere attaccato al lato ventrale del cordone nervoso (Figura 12C). Continua questa sequenza (delicatamente) tirare taglio fino a quando il cordone nervoso è completamente isolato. </li><li> Trasferire la catena isolata dei gangli di una capsula di Petri rivestito con chiaro Sylgard e riempito con soluzione salina gamberi (Figura 12D). </li></ol> 4. Pinning cordone nervoso nella piastra di Petri NOTA: Usare piccoli perni tagliati da filo di acciaio inossidabile (vedi supplementi) per bloccare il cordone nervoso. Toccare solo il nervo che termina con le pinze e non fare squeezvia e connettivi o gangli. <ol><li> Pin la catena di gangli in linea retta, mentre si applica tratto delicato. </li><li> Disporre il cordone nervoso nella capsula di Petri con il lato dorsale verso l&#39;alto (Figura 13, linea nera). Il lato ventrale dei gangli può essere identificato dal suo convessità; lato dorsale è piatto. Pin i nervi toracici ai lati. Continuare con i nervi di A6, si estende il cordone nervoso lungo il suo asse longitudinale. </li><li> Pin i nervi di A1 ad un angolo di 90 ° rispetto al cordone nervoso. </li><li> Procedere alla A2 e pin nervi N2 ad un angolo di 35-45 ° rispetto al cordone nervoso (Figura 1A). </li><li> Separare i nervi N1 nelle loro anteriori e posteriori rami prima pinning come mostrato nella Figura 14. Utilizzare due coppie di pinze sottili a prendere con un paio di pinze anteriore e con l&#39;altra il ramo posteriore del nervo N1. Fare attenzione a scegliere solo alla fine più distales dei rami nervosi. Ora tirare con cautela. </li><li> Pin il ramo anteriore del nervo N1 ad un angolo di 90 ° rispetto al cordone nervoso (Figura 1A). Pin il ramo posteriore del nervo N1 tra il ramo N1 anteriore e il nervo N2. </li><li> Ripetere la procedura 4,4-4,6 per i nervi dei gangli A3-A5. Mentre fissarsi il tratto cordone nervoso in longitudinale e senso trasversale. </li></ol> 5. Desheathing gangli <ol><li> Posizionare il preparato in modo tale che le mani del sperimentatore sono sempre appoggiati su un piano stabile per evitare scuotimento. Per desheath i gangli illuminano il cordone nervoso dal basso. </li><li> Focus su qualsiasi gangli A1 addominale A5. Usare le forbici primavera pregiati per fare un piccolo taglio laterale attraverso la guaina gangli, posteriore al ganglio e tra i nervi N2 e N3 (Figura 15A freccia rossa). </li><li> Sollevare la guaina ganglio utilizzando molto fpinze ine e tagliati trasversalmente attraverso la guaina sopra connettivi, come indicato in Figura 15A-1. Fare attenzione a non comprimere o tagliare il cordone nervoso con le forbici. </li><li> Sempre tenendo e sollevando la guaina gangli con una pinza continuano a tagliare lungo i bordi laterali del ganglio (Figura 15B-2 e -3). Rimuovere la guaina. Alternativamente pin per entrambi i lati dei connettivi in ​​modo tale che è fisso, ma il cordone nervoso non venga schiacciato. </li><li> Ripetere i passaggi 5,2-5,4 per tutti addominale gangli A1 a A5. </li><li> Desheathe i gangli del torace e il ganglio A6 in modo simile. Per desheathe A6 anteriori inizio al ganglio e procedere in direzione posteriori. Pin guaina gangli della A6 alla estremità posteriore della catena di gangli. </li></ol> 6. extracellulare registrazioni da Motor neuroni <ol><li> Montare tutti gli strumenti ei materiali utilizzati per le registrazioni extracellulari indicati in Figura 16B ed elencati nei supplementi. Una panoramica del sistema di registrazione è mostrato in Figura 16A. Avviare tutte le apparecchiature elettroniche utilizzate in questo esperimento (Figura 16C), in modo che gli amplificatori possono riscaldarsi per almeno 30 minuti prima della registrazione. Accendere il computer e avviare il software di registrazione. </li><li> Posizionare la catena di gangli sul tavolo microscopio e illuminare dal basso. Inserire l&#39;elettrodo di registrazione nel sylgard vicino al nervo bersaglio e l&#39;elettrodo di riferimento in una posizione vicina, ma lateralmente alla gangli (Figura 17A e B). Piegare il nervo target intorno l&#39;elettrodo di registrazione (Figura 17C). </li><li> Stretch il nervo leggermente, per assicurare il contatto tra l&#39;elettrodo e il nervo e il pin di lato (F IGURA 17D). Fissare i cavi degli elettrodi al tavolo del microscopio con plastilina, in modo da rimanere nella posizione desiderata. </li><li> Utilizzare unsiringa piena di vaselina e un ago calibro 20 (con punta arrotondata) (Figura 17E-3) per isolare il nervo bersaglio dalla soluzione di balneazione. Prima tamponare alcuni vaselina sulla sylgard intorno l&#39;elettrodo di registrazione. Il risultato è uno strato di vaselina copre il Sylgard in prossimità dell&#39;elettrodo di registrazione (Figura 17E-4). Fare attenzione a non tamponare direttamente sul nervo e di evitare bolle d&#39;aria in questo strato. </li><li> Sigillare l&#39;elettrodo di registrazione con vaselina da tutti i lati fino al livello della superficie della soluzione salina (Figura 17F). </li><li> Ripetere questa procedura per tutti i nervi di destinazione cui attività devono essere monitorati. </li><li> Avviare la registrazione. Utilizzare una modalità di acquisizione gratuita continuo o gap e una frequenza di campionamento di 5 kHz. Impostare l&#39;amplificatore extracellulare ai seguenti parametri; guadagnare a 1.000 (amplifica il segnale 1.000 volte, aver cura di includere questo parametro di amplificazione nelle impostazioni del software di acquisizione) unada gamma filtro passa-banda di 300 Hz (taglio basso) a 2.000 Hz (high cut). </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

<html> L&#39;anatomia di gamberi e la loro gangli addominali è stata descritta in precedenza 5, 18, ​​19, 20 e si consiglia di acquisire familiarità con essi prima della dissezione, per evitare il taglio dei nervi importanti. È fondamentale per mantenere il preparato a temperature inferiori a 23 ° C per evitare la degradazione del cordone nervoso isolato. Ciò può essere ottenuto facilmente mediante sostituzione della soluzione di balneazione ogni 20-30 min con soluzione salina gamberi freddo. In queste circostanze, la catena di gangli può essere utilizzato per esperimenti elettrofisiologici fino a 12 ore. A volte motoneuroni swimmeret sono inattivi e non mostrano alcuna attività di scoppio spontanea. L&#39;agonista colinergico carbachol viene usato per indurre attività scoppio in queste preparazioni. Disciolto in soluzione salina gamberi freddo, le applicazioni per il bagno di 1-3 micron carbacolo sono sufficienti per attivare il ritmo swimmeret 21. ove_content &quot;&gt; La locomozione fittizia e soprattutto il coordinamento degli arti registrati in questo sistema forniscono un sacco di informazioni sulle proprietà cellulari di attività ritmica e coordinamento. In questo sistema le componenti neuronali 8-10 dei microcircuiti locali sono identificati e inoltre la rete di coordinamento è conosciuto in dettaglio cellulare 11,14,15. I risultati tratti dagli esperimenti eseguiti con registrazioni extracellulari, permettono già le previsioni per i modelli matematici e di robotica. Tutti i neuroni swimmeret mostrano dendritica branching all&#39;interno del laterale neuropilo e può essere intracellulare registrati da tali dendriti. Nella Figura 20, è mostrata una registrazione intracellulare di un motoneurone PS. Per questo un microelettrodo tagliente (vedi supplementi) riempita con 1 M Kac + 0,1 M KCl (resistenza dell&#39;elettrodo tra 35 - 45 MW) è posto al di sopra del laterale neuropilo. I potenziali di membrana oscillanti come wELL picchi dei dendriti di PS e RS motoneuroni possono essere registrati quando l&#39;elettrodo è inserito vicino alla base del nervo N1. Per colorare singoli neuroni (ad esempio, motoneuroni) intracellulare come mostrato nella Figura 21, il microelettrodo tagliente deve essere ulteriormente riempito con colorante fluorescente (ad esempio 1% destrano Texas Red, vedi supplementi) sciolto in 1 M KAC + 0,1 M KCl. Per riempire motoneuroni intracellulare dalla ionoforesi, polarizzando impulsi di 1 nA con una durata di 250 ms a 2 Hz si applicano per almeno 10 min. Per coloranti carica positiva usano depolarizzante impulsi e coloranti caricati negativamente utilizzare impulsi iperpolarizzanti. Riempimenti più lunghi comportano un forte neurone etichettati. Per la visualizzazione del cordone nervoso deve essere fissato, disidratati, e montato 22. Un metodo per macchiare un pool di motoneuroni è usare riporti dalla N1 nervi (Figura 22) 4, 23. Mettere un pozzo di vaselina attorno al ramo posteriore del nervo N1 per riempire la piscina dei motoneuroni PS. Per macchiare il pool di motore RS neuroni un pozzo è posto sul ramo anteriore del nervo N1. La salina gamberi nel pozzo è sostituito da DDH 2 O. Poi tagliare questo nervo all&#39;interno del pozzo e lasciare per 15 minuti in DDH 2 O a temperatura ambiente (RT). Successivamente, sostituire il DDH 2 O nei pozzetti o con 5% CoCl 2 - o 5% NiCl 2 - soluzione (sciolto in DDH 2 O) e chiudere i pozzi con vaselina. Il campione deve essere incubate per almeno 15 ore a 4 ° C. Aprire i pozzetti, rimuovere il colorante e lavare il campione tre volte con soluzione fisiologica. Precipitare le ioni Co 2+ Ni 2+ o con 10 gocce di Dithiooxamid (soluzione satura sciolti in 100% EtOH) per ogni 10 ml di soluzione salina gamberi nella piastra di Petri, sotto il cofano per 20 minuti a RT. Ni 2+ - ioni precipiterà al blu Ni (SCH) e Co 2+ </sup&gt; ioni a CoS arancioni. Il cordone nervoso deve essere fissato, disidratato, e montato per acquisire immagini delle cellule marcate con un microscopio ottico dotato di una fotocamera.

I swimmerets di gamberi hanno una funzione di controllo della postura e battere ritmicamente quando gli animali nuotano in avanti, ventilare le loro tane o femmine aerare le loro uova 5, 6. I swimmerets del gambero del segnale, Pacifastacus leniusculus, si verificano in coppie dalla seconda alla quinta segmento addominale, con un arto su ciascun lato dell&#39;addome 7. Il sistema nervoso centrale produce propria ticchettio motore ritmica che aziona il movimento swimmeret nell&#39;animale intatto nonché nella preparazione isolato cordone nervoso. Quando non c&#39;è feedback sensoriale o discendente ingresso presente modello motore ritmica prodotta viene chiamato locomozione fittizia 1, 2. Nel sistema swimmeret questo schema motorio non differisce in qualsiasi parametro dall&#39;attività delle swimmerets misurati nell&#39;animale intatto. Il movimento di ciascun swimmeret è guidato da un microcircuito che si trova dentro e limitato a una corresponding hemiganglion 1 -. 3 In ogni microcircuito c&#39;è un kernel generano tracciati che comprende cinque interneuroni identificati non spike. Essi possono essere funzionalmente caratterizzati come sia Inhibitor of Power Stroke (IPS) o inibitore della corsa di ritorno (IRS) 8. Questi IPS e interneuroni IRS non sono oscillatori endogeni, piuttosto la loro attività di alternanza è guidato da inibizione reciproca 9. Poiché questi interneuroni inibiscono direttamente i motoneuroni swimmeret, il movimento alternato PS-RS è generato 10. Locomotion tuttavia, non solo richiede la generazione di attività, ma anche il coordinamento dei vari microcircuiti indipendenti. Nel sistema swimmeret tale coordinamento è stabilito dal microcircuito coordinamento che assicura che gli arti sono attivi a volte corretti. Questo microcircuito è costruito da tre neuroni identificati in ogni segmento 11-15. Questo protocollo prevede the prima volta una guida passo-passo dissezione per isolare la catena di gangli (T4 al A6, Figura 1). Mostriamo come al pin isolato cordone nervoso addominale e desheathe ogni ganglio. In questo isolato preparazione del sistema nervoso, i neuroni responsabili del movimento swimmeret sono pronti per l&#39;uso negli esperimenti elettrofisiologici e morfologici. La seconda parte di questo protocollo illustra le caratteristiche principali del modello del motore swimmeret. Ciò include una guida step-by-step per registrare extracellulare l&#39;attività dei motoneuroni swimmeret. Gli assoni dei neuroni motori RS proiettano attraverso il ramo anteriore del nervo N1, mentre assoni dei motoneuroni PS proiettano attraverso il ramo posteriore dello stesso nervo (Figura 1) 4. Quindi la loro attività può essere registrato da questi rami con elettrodi pin differenziali. <img alt="Figura 1" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/52109/52109fig1highres.jpg" width="200" /><br/&gt; Figura 1: Isolati sistema nervoso dal ganglio toracico 4 (T4) per ganglio addominale 6 (A6) e un diagramma schematico di esso T4:. Ganglio toracico 4; T5: ganglio toracico 5; A1, A2 ... A6 ganglio addominale 1, ganglio addominale 2 ... ganglio addominale 6; N1: nervo N1; N2: nervo N2; N3: nervo N3; PS: power-stroke; RS: return-stroke. Abbreviazioni direzionali: A = anteriore; P = posteriori. Questa procedura dissezione e la tecnica dimostrata elettrofisiologico sono convenienti per gli studenti universitari e studenti possono integrare corsi pratici in fisiologia. La catena di gangli isolato è stato utilizzato in una serie di esperimenti per studiare la funzione del sistema nervoso, coordinamento, o la modulazione di microcircuiti swimmeret 6 così come il controllo neuronale del comportamento adattativo in locomozione 16, 17. Il sistema gamberi swimmeret fornisce pertanto una quantità enorme di insegnamento interessanti o tPiove opportunità che iniziano tutti con la dissezione del cordone nervoso ventrale di gamberi e la registrazione extracellulare del pattern motorio fittizia.

<table><tbody><tr><td>4-channel extracellular amplifier: MA 102&amp;nbsp;</td><td>Amplifier</td><td>Elektroniklabor, Zoologie, Universit&amp;auml;t zu K&amp;ouml;ln, Germany</td><td></td></tr><tr><td>air-table</td><td></td><td>Technical Manufacturing Corporation&lt;br/&gt; (TMC) a unit of AMETEK Ultra Precision Technologies, Peabody, MA, USA</td><td>63-534</td></tr><tr><td>Axon Digidata 1440A</td><td>Digitizer</td><td>Axon Instruments, Molecular Devices Design, Union City, CA</td><td>DD1440A</td></tr><tr><td>big bucket&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clampex &amp;amp; Clampfit</td><td>pClamp 10, recording and analysis software</td><td>Molecular Devices Design, Union City, CA</td><td>pClamps 10 Standard</td></tr><tr><td>cold lamp source</td><td>with flexible light guide (fiber optic bundle)&amp;nbsp;</td><td>Euromex microscopes holland, Arnhem, BD</td><td>LE.5211 &amp;amp; LE.5235</td></tr><tr><td>computer and monitor</td><td>equipped with recording software</td><td></td><td></td></tr><tr><td>container and pipette for liquid waste&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>crayfish saline&amp;nbsp;</td><td>contains (in mM): 5.4 KCl, 2.6 MgCl2, 13.5 CaCl2, and 195 NaCl, buffered with 10mM Tris base and 4.7mM maleic acid; aerated for 3 hours. Adjust at pH of 7.4.&amp;nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>dextran, Texas Red (3000MW, lysine fixable)</td><td>fluorescent dye, lysine fixable</td><td>Life Technologies GmbH, Darmstadt, Germany</td><td>D3328</td></tr><tr><td>dissection dish&amp;nbsp;</td><td>(l x w x h) 15x7x5 cm; linned with black silicone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>faraday cage</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>fixing pins</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>forceps (biology, Dumont #5)</td><td>Forceps: Biology, tip 0.05 x 0.02 mm, length 11cm, INOX</td><td>Fine Science Tools (FST), Germany</td><td>11252-20</td></tr><tr><td>forceps (biology, Dumont #55)</td><td>Forceps: Biology, tip 0.05 x 0.02 mm, length 11cm, INOX</td><td>Fine Science Tools (FST), Germany</td><td>11255-20</td></tr><tr><td>forceps (electronic, Dumont #5)</td><td>Forceps: Standard, tip 0.1 x 0.06 mm, length 11cm, INOX</td><td>Fine Science Tools (FST), Germany</td><td>11251-20</td></tr><tr><td>intracellular electrode</td><td>Borosilicate glass capillaries (outer/inner diameter: 1mm/0.5mm), with filament</td><td>Sutter Instruments, Novato, CA</td><td>BF100-50-10</td></tr><tr><td>Leica S8 Apo StereoZoom</td><td>Dissection Microscope&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; Zoom 1x - 8x</td><td>Leica, Germany</td><td>10446298</td></tr><tr><td>microscope table</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>mirror</td><td>to illuminate preparation from below</td><td></td><td></td></tr><tr><td>modeling clay</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus SZ61</td><td>Dissection Microscope&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; Zoom 0.67x - 4.5x</td><td>Olympus, Germany</td><td></td></tr><tr><td>petri dish&amp;nbsp;</td><td>94 x 16 mm; lined with clear silicone</td><td>Greiner bio-one, Germany</td><td>633180</td></tr><tr><td>ring scissors</td><td>ThoughCut, cutting edge: sharp/blunt, straight: 13cm</td><td>Fine Science Tools (FST), Germany</td><td>14054-13</td></tr><tr><td>spring scissors or alternative: Vannas spring scissors</td><td>cutting edge: 8 mm, tip diameter: 0.2mm, straight: 10cm or cutting edge 2.5 mm, tip diameter 0.075 mm, straight: 8cm</td><td>Fine Science Tools (FST), Germany</td><td>15024-10 or&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 15000-08</td></tr><tr><td>student Vannas&amp;nbsp; spring scissors or alternative:&amp;nbsp; Moria Spring Scissors</td><td>cutting edge: 5mm, tip diameter: 0.35mm, straight: 9cm or cutting edge: 5mm, tip diameter 0,1 mm, straight: 8 cm</td><td>Fine Science Tools (FST), Germany</td><td>91500-09 or&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; 15396-00</td></tr><tr><td>sylgard</td><td>184 Silicone Elastomer Base and Curing Agent; for black sylgard add activated carbon</td><td>Dow Corning, Midland, MI, USA</td><td></td></tr><tr><td>syringe filled with petroleum jelly and equipped with a 20 gauche needle with rounded tip</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

the swimmeret system of crayfish: a practical guide for the dissection of the nerve cord and extracellular recordings of the motor pattern

Qui mostriamo la dissezione del cordone nervoso addominale gamberi. La preparazione comprende gli ultimi due gangli toracica (T4, T5) e la catena di gangli addominali (A1 al A6). Questa catena di gangli comprende la parte del sistema nervoso centrale (CNS) che guida locomozione coordinata dei pleopodi (swimmerets): il sistema swimmeret. E &#39;noto per oltre cinque decenni in gamberi ogni swimmeret è guidato da un proprio kernel generano tracciati indipendenti che genera attività alternanza ritmica 1-3. I motoneuroni che innervano la muscolatura di ogni swimmeret comprendono due anatomicamente e funzionalmente distinte popolazioni 4. Uno è responsabile per la retrazione (corsa di potenza, PS) del swimmeret. Altre unità la protrazione (corsa di ritorno, RS) del swimmeret. Neuroni motori del sistema swimmeret sono in grado di produrre spontaneamente uno schema motorio fittizia, che è identico al modello registrato in vivo </em&gt; 1. Lo scopo di questo rapporto è quello di introdurre un interessante e conveniente sistema modello per lo studio delle reti di generazione del ritmo e il coordinamento di microcircuiti indipendenti per i corsi di laboratorio pratico degli studenti. Il protocollo fornito include le istruzioni passo-passo per la dissezione del cordone nervoso addominale del gambero di fiume, pinning della catena isolato di gangli, desheathing gangli e registrando il swimmerets fittizia pattern motorio extracellulare dal sistema nervoso isolato. Inoltre, siamo in grado di monitorare l&#39;attività dei neuroni swimmeret registrati intracellulare di dendriti. Qui abbiamo anche una breve descrizione di queste tecniche e fornire alcuni esempi. Inoltre, la morfologia dei neuroni swimmeret può essere valutata utilizzando varie tecniche di colorazione. Qui forniamo esempi di intracellulare (dalla ionoforesi) tintura piena neuroni e riporti di pool di motoneuroni swimmeret. Nel nostro laboratoriousiamo questa preparazione per studiare le funzioni di base di locomozione fittizia, l&#39;effetto di feedback sensoriale sull&#39;attività del SNC, e il coordinamento tra microcircuiti a livello cellulare.

Con le registrazioni extracellulari simultanee da RS e PS, motoneuroni di uno ganglio, l&#39;attività alternata di queste piscine motoneuroni, può essere monitorato (Figura 18), che rappresenta lo schema locomozione fittizia. <img alt="Figura 18" src="/files/ftp_upload/52109/52109fig18highres.jpg" /> Figura 18: Schema di un ganglio e il posizionamento di elettrodi pin differenziale registrazione extracellulare di RS motoneuroni (traccia superiore) e PS (neuroni motori inferiori traccia).. L&#39;attività PS extracellulare di PS ipsilaterale 2 per PS 5 motoneuroni evidenzia aspetti interessanti di coordinamento intersegmentale nel sistema swimmeret (Figura 19A). In primo luogo, l&#39;attività inizia sempre con un burst PS in A5 (Figura 19A, 4 ° traccia) e l&#39;onda di eccitazione si propaga nella direzione anteriore (&lt;strong&gt; Figura 19A, linea verde). In secondo luogo, il periodo (che è il tempo misurato dalla comparsa di uno scoppio all&#39;insorgenza del prossimo burst) in ciascun segmento rimane costante (Figura 19A, freccia ciano). Questo è vero, finché il flusso di informazioni da un ganglio al successivo è intatta e le condizioni sperimentali non cambiano. In diverse preparazioni o in diverse condizioni sperimentali i periodi e la durata di scoppio possono variare notevolmente: dai periodi di 0,25-1 sec. Al fine di confrontare questi parametri tra diverse preparazioni, hanno bisogno di essere normalizzata e graficamente in un istogramma fase (Figura 19B). Questo rivela il terzo aspetto interessante del modello del motore: la fase che intercorre tra i segmenti, il ritardo intersegmentale, rimane costante e indipendente dalla frequenza del ritmo. Per calcolare un istogramma fase, le seguenti misure e calcoli sono necessario: Innanzitutto, una traccia di riferimento deve essere scelto. Di solito si usa la traccia PS del ganglio più posteriore (ad esempio, PS 5) come riferimento (essendo tempo 0) per un istogramma fase del ritmo swimmeret registrata tra diverse segmenti (Figura 19A) .Poi, misurare il periodo (in ms ) del ritmo dall&#39;inizio di una PS 5 raffica (tempo 0, Figura 19A, arancione linea tratteggiata) per l&#39;inizio del successivo PS 5 raffica (Figura 19A, freccia ciano) .Within questo ciclo, misurare le latenze (in ms ) tra l&#39;inizio della PS 5 scoppio (tempo 0) e l&#39;inizio (insorgenza scoppio, Figura 19A e B, frecce arancione) e di fine (offset Figura 19A e B, frecce viola) del PS scoppio in ciascuno degli altri gangli . Quindi per calcolare l&#39;inizio fase e offset per ogni raffica le latenze sono divisi per il periodo concomitante. Queste misure comporteranno v numericoalori tra 0 e 1. Infine, terreno questi valori in un istogramma di fase, come mostrato nella Figura 19B. L&#39;istogramma fase risultante (Figura 19B) contiene informazioni sul ciclo di dovere del PS scoppiare in ogni segmento. E il intersegmentale fase-lag di circa 0,25 tra i segmenti vicini è chiaramente visibile. <img alt="Figura 19" src="/files/ftp_upload/52109/52109fig19highres.jpg" /> Figura 19: (A) Schema di posizionamento degli elettrodi e registrazione extracellulare di PS omolaterale 5 a 2. PS (B) Misure e calcoli necessari per l&#39;istogramma di fase. L&#39;istogramma di fase calcolato dal dieci burst consecutivi (n = 10) mostra il ritardo di fase di intersegmentale ~ 0,25. Per maggiori sperimentatori avanzate, registrazioni intracellulari con taglienti microelettrodi dei dendriti dei neuroni motori possono essere utili. I potenziali di membranadell intracellulare registrati motoneuroni PS mostrano oscillazioni in fase con l&#39;attività extracellulare registrata di tutti motoneuroni PS della stessa hemiganglion (Figura 20, pannelli grigio). In alternativa, motoneuroni RS o interneuroni possono essere registrati intracellulare nello stesso modo (dati non mostrati). <img alt="Figura 20" src="/files/ftp_upload/52109/52109fig20highres.jpg" /> Figura 20:. Schema di posizionamento degli elettrodi Il potenziale di membrana di una intracellulare registrato motoneurone PS (traccia superiore) oscilla in fase (pannelli grigi) con l&#39;attività PS extracellulare registrato (traccia inferiore). Per l&#39;identificazione dei neuroni intracellulare registrati (interneuroni o neuroni motori), le cellule possono essere tintura riempiti utilizzando microelettrodi taglienti e ionoforesi (vedi la discussione). Nella Figura 21, sono mostrati due neuroni motori PS intracellulare la tintura pieni. La loro somata ventralesi trova posteriormente alla base della N1 nervosa. I progetti dei neuriti primaria anteriormente (Figura 21B-2) e filiali all&#39;interno del laterale neuropilo (Figura 21A e B-3); progetti assone attraverso il ramo posteriore della N1 nervi alla muscolatura swimmeret (Figura 21B-4). <img alt="Figura 21" src="/files/ftp_upload/52109/52109fig21highres.jpg" /> Figura 21: (A) Schema di un ganglio addominale (B) Due intracellulare macchiato motoneuroni PS.. (1) somata; (2) neuriti primarie; (3) dendritica ramificazione nel neuropil laterale; (4) assoni progetto attraverso il ramo posteriore del nervo N1; Bar = 100 micron. Per meno sperimentatori avanzati, o coloro che vogliono studiare la morfologia del ganglio addominale, riporti dalle PS e del motore RS piscine neurone attraverso il nervo N1, sono un esercizio interessante. In Figura 22, i RS e PS motoneuroni di uno hemiganglion sono state colorate con Co 2+ (RS) e Ni 2 + ioni (PS), rispettivamente. Somata dei motoneuroni PS sono situati posteriormente alla base della N1 nervi (Figura 22-1). Tutti somata di RS motoneuroni si trovano anterior alla base del nervo N1 (Figura 22-2). <img alt="Figura 22" src="/files/ftp_upload/52109/52109fig22highres.jpg" /> Figura 22: riporti dal anteriore (arancione, Co 2+) e posteriore (blu, Ni 2+) ramo del nervo N1 (1) Somata di motoneuroni PS;. (2) somata dei motoneuroni RS. Bar = 100 micron. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52109/52109fig3highres.jpg" /> Figura 3: Rimozione gli artigli (1) e uropods (2). Le linee rosse (1) e (2) indicano le posizioni dei tagli. Bar = 5 centimetri. Figura 4:. (A) L&#39;animale è appuntato lato ventrale e fissato al telson (B) Il gambero è dissanguato attraverso l&#39;apertura artiglio con soluzione fisiologica fredda. Bar = 5 cm. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52109/52109fig5highres.jpg" /> Figura 5: (A) Decapitazione e (B) rimozione di gambe che camminano. Le linee rosse indicano le posizioni dei tagli. Bar = 1 cm. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/52109/52109fig6highres.jpg" /> Figura 6: (A, B, C e D) rimozione del anteriore e le parti laterali del cefalotorace. E. Apertura dell&#39;addome lungo il lato laterale.Le linee rosse (1), (2), (4), e (5) indicano le posizioni dei tagli. (3) ghiandola digestiva. Frecce rosse indicano la cavità addominale già aperto. Bar = 1 cm. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/52109/52109fig7highres.jpg" /> Figura 7: (A) Il provino viene afferrato in corrispondenza di un&#39;apertura delle gambe piedi (frecce rosse) trefoli (B) Il muscolari dorsali (1) vengono recisi, mentre il campione viene aperta.. Freccia bianca rappresenta la direzione in cui la piastra sternale è tirato. (C) Descrizione della cavità addominale con l&#39;arteria sternale (2) e cordone nervoso (3). <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/52109/52109fig8highres.jpg" /> Figura 8: vista trasversale dell&#39;addome gamberi con filamenti muscolari dorsali fisso (1) e arteria sternale (2); Le linee rosse (3) e (4) indicano posizioni di tagli. Bar= 5 mm. <img alt="Figura 9" src="/files/ftp_upload/52109/52109fig9highres.jpg" /> Figura 9: dorsale e parti ventrali dell&#39;addome sono separati l&#39;uno dall&#39;altro (1) la linea rossa indica la posizione di taglio.. Piastra sternale (2) con il cordone nervoso ventrale; dorsale parte dell&#39;addome (3). <img alt="Figura 10" src="/files/ftp_upload/52109/52109fig10highres.jpg" /> Figura 10:.. (A) Posizione delle pinze per rimuovere la sterna cephalothoracic anteriore (B) Le linee rosse (1) e (2) indicare dove tagliare i muscoli tra il restante sterna cephalothoracic (C) I nervi toracici sono recisi a le linee rosse (3) per isolare i gangli toracici dal tessuto circostante. Linea rossa (4) indica il taglio tra T3 e T4. Bar = 5 mm. Figura 11: (A e B) Vista della piastra sternale a A2. Il nervo N1 è isolato dal tessuto con un taglio lungo il ripiegamento sternale posteriore cuticolare (1) e anteriore ad entrambi ripiegamenti cuticolari sternali (B 2). (C) maggiore ingrandimento della regione intorno A2, con il nervo isolata N1. ( D) Isolamento del nervo N1 sul lato controlaterale con tagli simili. Le linee rosse (2) e (3) indicano le posizioni dei tagli; (1) anteriore e posteriore ripiegamenti cuticolari sternale; Bar = 5 mm. <img alt="Figura 12" src="/files/ftp_upload/52109/52109fig12highres.jpg" /> Figura 12: (A e B) A6 è isolato dal tessuto e il cavo nervo può essere sollevato nervi di A6 (C). </strong&gt; Tutti i collegamenti dei gangli addominali al arteria addominale ventrale sono recisi. (D) cordone nervoso isolato viene trasferito in una capsula di Petri rivestito con chiaro Sylgard e riempito con soluzione fisiologica. Le linee rosse indicano le posizioni dei tagli. Bar = 5 mm. <img alt="Figura 13" src="/files/ftp_upload/52109/52109fig13highres.jpg" /> Figura 13: Vista laterale di un ganglio Identificazione della dorsale e ventrale (linea nera) del cordone nervoso.. Bar = 5 mm <img alt="Figura 14" src="/files/ftp_upload/52109/52109fig14highres.jpg" /> Figura 14: Il ramo anteriore del nervo N1 è separato dal ramo posteriore Bar = 5 mm.. <img alt="Figura 15" src="/files/ftp_upload/52109/52109fig15highres.jpg" /> Figura 15: Istruzioni per desheathing di un ganglio addominale (A) Posizione del primo piccolo taglio attraverso la guaina dei connettivi (freccia rossa), posto laterale e posteriore al ganglio. Il successivo taglio attraverso la guaina sopra il connettivo è segnato dalla linea rossa (1). (B) Le linee rosse (1) e (2) segnano i tagli lungo i bordi laterali del ganglio. La guaina può poi essere tirato dal ganglio. Bar = 1 mm. <img alt="Figura 16" src="/files/ftp_upload/52109/52109fig16highres.jpg" /> Figura 16:. (A) Panoramica della configurazione di registrazione (B) Materiali e strumenti necessari per le registrazioni extracellulari. C. Materiale necessario per la registrazione elettrofisiologica. (1) Fonte lampada fredda; (2) gabbia di Faraday; (3) stereomicroscopio; (4) aria-table; (5) Tavolo microscopio; (6) specchio; (7) elettrodi pin differenziale; (8) siringa riempita con etere di petroliogelatina; (9) plastilina; (10) pinze; (11) smaltimento dei rifiuti liquidi; (12) digitalizzatore; (13) amplificatore extracellulare; (14) del computer, dotato di software di registrazione e monitor. <img alt="Figura 17" src="/files/ftp_upload/52109/52109fig17highres.jpg" /> Figura 17: (A e B) posizione di registrazione (1) e di riferimento (2) Elettrodo pin. (C e D) Il ramo posteriore del nervo N1 è piegato attorno all&#39;elettrodo di registrazione. E. La base (4) dell&#39;elettrodo di registrazione è isolato con vaselina. F. L&#39;elettrodo di registrazione completo è isolato con vaselina dalla soluzione bagno. (3) Siringa riempito di vaselina. Bar = 2 mm.

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The Swimmeret System of Crayfish: A Practical Guide for the Dissection of the Nerve Cord and Extracellular Recordings of the Motor Pattern

Here we describe the dissection of the crayfish abdominal nerve cord. We also demonstrate an electrophysiological technique to record fictive locomotion from swimmeret motor neurons.

Il Sistema swimmeret di gamberi: Una guida pratica per la dissezione del cavo di Nerve e extracellulari registrazioni del modello Motor

Here we demonstrate the dissection of the crayfish abdominal nerve cord. The preparation comprises the last two thoracic ganglia (T4, T5) and the chain of ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.0K Views.  University of Cologne. Here we describe the dissection of the crayfish abdominal nerve cord. We also demonstrate an electrophysiological technique to record fictive locomotion from swimmeret motor neurons. 

Video: The Swimmeret System of Crayfish: A Practical Guide for the Dissection of the Nerve Cord and Extracellular Recordings of the Motor Pattern

Physiological Recordings of High and Low Output NMJs on the Crayfish Leg Extensor Muscle

We explain in detail how to expose and conduct electrophysiological recordings of synaptic responses for high (phasic) and low (tonic) output motor neurons innervating the extensor muscle in the walking leg of a crayfish. Distinct differences are present in the physiology and morphology of the phasic and tonic nerve terminals. The tonic axon contains many more mitochondria, enabling it to take a vital stain more intensely than the phasic axon. The tonic terminals have varicosities, and the phasic terminal is filiform. The tonic terminals are low in synaptic efficacy but show dramatic facilitated responses. In contrast, the phasic terminals are high in quantal efficacy but show synaptic depression with high frequency stimulation. The quantal output is measured with a focal macropatch electrode placed directly over the visualized nerve terminals. Both phasic and tonic terminals innervate the same muscle fibers, which suggests that inherent differences in the neurons, rather than differential retrograde feedback from the muscle, account for the morphological and physiological differentiation.

This article demonstrates how to conduct electrophysiological recordings of synaptic responses on the extensor muscle in the walking leg of a crayfish and how the nerve terminals are visualized to show the gross morphological differences of high- and low-output nerve terminals.

Le registrazioni fisiologiche NMJs uscita alta e bassa del muscolo estensore gamberi Leg

We explain in detail how to expose and conduct electrophysiological recordings of synaptic responses for high (phasic) and low (tonic) output motor ...

Ricerca

Neuroscienze

Membrane Potentials, Synaptic Responses, Neuronal Circuitry, Neuromodulation and Muscle Histology Using the Crayfish: Student Laboratory Exercises

The purpose of this report is to help develop an understanding of the effects caused by ion gradients across a biological membrane. Two aspects that influence a cell's membrane potential and which we address in these experiments are: (1) Ion concentration of K+ on the outside of the membrane, and (2) the permeability of the membrane to specific ions. The crayfish abdominal extensor muscles are in groupings with some being tonic (slow) and others phasic (fast) in their biochemical and physiological phenotypes, as well as in their structure; the motor neurons that innervate these muscles are correspondingly different in functional characteristics. We use these muscles as well as the superficial, tonic abdominal flexor muscle to demonstrate properties in synaptic transmission. In addition, we introduce a sensory-CNS-motor neuron-muscle circuit to demonstrate the effect of cuticular sensory stimulation as well as the influence of neuromodulators on certain aspects of the circuit. With the techniques obtained in this exercise, one can begin to answer many questions remaining in other experimental preparations as well as in physiological applications related to medicine and health. We have demonstrated the usefulness of model invertebrate preparations to address fundamental questions pertinent to all animals.

The experiments demonstrate an easy approach for students to gain experience in examining muscle structure, synaptic responses, the effects of ion gradients and permeability on membrane potentials. Also, a sensory-CNS-motor-muscle circuit is presented to show a means to test effects of compounds on a neuronal circuit.

Potenziali di membrana, Risposte Synaptic, circuiti neuronali, neuromodulazione e Istologia muscolare Utilizzando la Gamberi: Esercizi di laboratorio per studenti

The purpose of this report is to help develop an understanding of the effects caused by ion gradients across a biological membrane. Two aspects that ...

Muscle Receptor Organs in the Crayfish Abdomen: A Student Laboratory Exercise in Proprioception 

The primary purpose of this experiment is to demonstrate primary sensory neurons conveying information of joint movements and positions as proprioceptive information for an animal. An additional objective of this experiment is to learn anatomy of the preparation by staining, dissection and viewing of neurons and sensory structures under a dissecting microscope. This is performed by using basic neurophysiological equipment to record the electrical activity from a joint receptor organ and staining techniques. The muscle receptor organ (MRO) system in the crayfish is analogous to the intrafusal muscle spindle in mammals, which aids in serving as a comparative model that is more readily accessible for electrophysiological recordings. In addition, these are identifiable sensory neurons among preparations. The preparation is viable in a minimal saline for hours which is amenable for student laboratory exercises. The MRO is also susceptible to neuromodulation which encourages intriguing questions in the sites of modulatory action and integration of dynamic signals of movements and static position along with a gain that can be changed in the system.

Muscle Receptor Organs in the Crayfish Abdomen: A Student Laboratory Exercise in Proprioception

The primary purpose of this experiment is to understand how primary sensory neurons convey information of joint movements and positions as proprioceptive information for an animal. An additional objective of this report is present the anatomy of the preparation by dissection and viewing of neurons under a dissecting microscope.

Receptor Organi muscolare all&#39;addome gamberi: un esercizio di laboratorio per studenti in propriocezione

The primary purpose of this experiment is to demonstrate primary sensory neurons conveying information of joint movements and positions as proprioceptive ...

Physiological Experimentation with the Crayfish Hindgut: A Student Laboratory Exercise

The purpose of the report is to describe dissection techniques for preparing the crayfish hindgut and to demonstrate how to make physiological recordings with a force transducer to monitor the strength of contraction. In addition, we demonstrate how to visually monitor peristaltic activity, which can be used as a bioassay for various peptides, biogenic amines and neurotransmitters. This preparation is amenable to student laboratories in physiology and for demonstrating pharmacological concepts to students. This preparation has been in use for over 100 years, and it still offers much as a model for investigating the generation and regulation of peristaltic rhythms and for describing the mechanisms underlying their modulation. The pharmacological assays and receptor sub-typing that were started over 50 years ago on the hindgut still contribute to research today. This robust preparation is well suited to training students in physiology and pharmacology.

In this report we demonstrate techniques that can be used to investigate the biology of the crayfish hindgut. We show how to dissect a crayfish abdomen and study the associated anatomy, physiology and modulation of activity. The peristaltic activity and strength of contractions are measured using a force transducer.

La sperimentazione con la fisiologica hindgut gamberi: un esercizio di laboratorio per studenti

The purpose of the report is to describe dissection techniques for preparing the crayfish hindgut and to demonstrate how to make physiological recordings ...

Continuous Noninvasive Measuring of Crayfish Cardiac and Behavioral Activities

A crayfish is a pivotal aquatic organism that serves both as a practical biological model for behavioral and physiological studies of invertebrates and as a useful biological indicator of water quality. Even though crayfish cannot directly specify the substances that cause water quality deterioration, they can immediately (within a few seconds) warn humans of water quality deterioration via acute changes in their cardiac and behavioral activities.
In this study, we present a noninvasive method that is simple enough to be implemented under various conditions due to a combination of simplicity and reliability in one model.
This approach, in which the biological organisms are implemented into environmental evaluation processes, provides a reliable and timely alarm for warning of and preventing acute water deterioration in an ambient environment. Therefore, this noninvasive system based on crayfish physiological and ethological parameter recordings was investigated for the detection of changes in an aquatic environment. This system is now applied at a local brewery for controlling&#160;quality of the water used for beverage production, but it can be used at any water treatment and supply facility for continuous, real-time water quality evaluation and for regular laboratory investigations of crayfish cardiac physiology and behavior.

This article presents a noninvasive biomonitoring system for the continuous recording and analyses of crayfish cardiac and locomotor activities. This system consists of a near-infrared optical sensor, a video-tracking module, and software for evaluating crayfish heartbeats that reflects its physiological condition and characterizes crayfish behavior during heartbeat fluctuations.

Continua la misurazione non invasiva dell'attività cardiaca e comportamentali di gamberi

A crayfish is a pivotal aquatic organism that serves both as a practical biological model for behavioral and physiological studies of invertebrates and as ...

Comportamento

Recordings of Neural Circuit Activation in Freely Behaving Animals

The relationship between patterns of neural activity and corresponding behavioral expression is difficult to establish in unrestrained animals. Traditional non-invasive methods require at least partially restrained research subjects, and they only allow identification of large numbers of simultaneously activated neurons. On the other hand, small ensembles of neurons or individual neurons can only be measured using single-cell recordings obtained from largely reduced preparations. Since the expression of natural behavior is limited in restrained and dissected animals, the underlying neural mechanisms that control such behavior are difficult to identify. 
Here, I present a non-invasive physiological technique that allows measuring neural circuit activation in freely behaving animals. Using a pair of wire electrodes inside a water-filled chamber, the bath electrodes record neural and muscular field potentials generated by juvenile crayfish during natural or experimentally evoked escape responses. The primary escape responses of crayfish are mediated by three different types of tail-flips which move the animals away from the point of stimulation. Each type of tail-flip is controlled by its own neural circuit; the two fastest and most powerful escape responses require activation of different sets of large &#8220;command&#8221; neurons. In combination with behavioral observations, the bath electrode recordings allow unambiguous identification of these neurons and the associated neural circuits. Thus activity of neural circuitry underlying naturally occurring behavior can be measured in unrestrained animals and in different behavioral contexts.

Non-invasive measurements of neural activity patterns in freely behaving animals are obtained by combining neurophysiological recordings with high speed videography.

Le registrazioni di attivazione circuito neurale in Liberamente Comportarsi Animali

The relationship between patterns of neural activity and corresponding behavioral expression is difficult to establish in unrestrained animals. ...

Biologia

Neural Circuit Recording from an Intact Cockroach Nervous System

The cockroach ventral nerve cord preparation is a tractable system for neuroethology experiments, neural network modeling, and testing the physiological effects of insecticides. This article describes the scope of cockroach sensory modalities that can be used to assay how an insect nervous system responds to environmental perturbations. Emphasis here is on the escape behavior mediated by cerci to giant fiber transmission in Periplaneta americana. This in situ preparation requires only moderate dissecting skill and electrophysiological expertise to generate reproducible recordings of neuronal activity. Peptides or other chemical reagents can then be applied directly to the nervous system in solution with the physiological saline. Insecticides could also be administered prior to dissection and the escape circuit can serve as a proxy for the excitable state of the central nervous system. In this context the assays described herein would also be useful to researchers interested in limb regeneration and the evolution of nervous system development for which P. americana is an established model organism.

This article describes the cockroach ventral nerve cord dissection and extracellular recordings from the cercal nerve and connectives. Evoked responses are generated by electrical stimulation of the cercal nerve or direct mechanical stimulation of the cerci.

Neural Circuit Registrazione da un intatto scarafaggio Sistema Nervoso

The cockroach ventral nerve cord preparation is a tractable system for neuroethology experiments, neural network modeling, and testing the physiological ...

Measures of Heart and Ventilatory Rates in Freely Moving Crayfish

The fear, flight or fight response serves as the fundamental physiological basis for examining an organism's awareness of its environment under an impending predator attack.  Although it is not known whether invertebrates posses an autonomic nervous system identical to that of vertebrates, evidence shows invertebrates have a  sympathetic-like  response to regulate the internal environment and ready the organism to act behaviorally to a given stimuli.  Furthermore, this physiological response can be feasibly measured and it acts as a biological index for the animal's internal state.  Measurements of the physiological response can be directly related to internal and external stressors through changes in the central nervous system controlled coordination of the cardio-vascular and respiratory systems.   More specifically, monitoring heart and ventilation rates provide quantifiable measures of the stress response not always behaviorally observed. Crayfish are good model organisms for heart and ventilatory rate measurements due to the feasibility of recording, as well as the rich history known of the morphology of the crayfish, dating back to Huxley in 1888, and the well-studied typical behaviors.

Invertebrates show an autonomic sympathetic-like response similar to that described for vertebrates. The coordination of the cardio-vascular and ventilatory systems allows for measurement of a biological index in which to assess an organism internal state.

Misure di Cuore e Tariffe ventilatoria a muoversi liberamente gamberi di fiume

The fear, flight or fight response serves as the fundamental physiological basis for examining an organism's awareness of its environment under an ...

Historical View and Physiology Demonstration at the NMJ of the Crayfish Opener Muscle

Here we present some of the key important discoveries made with the opener neuromuscular (NMJ) preparation of crustaceans and illustrate that there is still much to learn from this model preparation. In understanding the history one can appreciate why even today this NMJ still offers a rich playground to address questions regarding pre- and post-synaptic function and plasticity. The viability and ease of access to the terminal for intracellular as well as extracellular electrophysiology and imaging are significant advantages. The mechanisms behind the modulation of vesicular kinetics and fusion within the high- and low-output terminals are begging for investigation. The preparation also offers a testable model system for computational assessments and manipulations to examine key variables in theoretical models of synaptic function, for example calcium dynamics during short-term facilitation. The synaptic complexity of active zone and statistical nature of quantal release is also an open area for future investigation both experimentally and computationally.

The opener muscle of the crayfish leg is presented for its historical importance and experimental versatility in muscle phenotype, synaptic physiology and plasticity.

Vedi storici e dimostrazione di Fisiologia presso la NMJ del Muscolo Opener gamberi di fiume

Here we present some of the key important discoveries made with the opener neuromuscular (NMJ) preparation of crustaceans and illustrate that there is ...

Proprioception and Tension Receptors in Crab Limbs: Student Laboratory Exercises

The primary purpose of these procedures is to demonstrate for teaching and research purposes how to record the activity of living primary sensory neurons responsible for proprioception as they are detecting joint position and movement, and muscle tension. Electrical activity from crustacean proprioceptors and tension receptors is recorded by basic neurophysiological instrumentation, and a transducer is used to simultaneously measure force that is generated by stimulating a motor nerve. In addition, we demonstrate how to stain the neurons for a quick assessment of their anatomical arrangement or for permanent fixation. Staining reveals anatomical organization that is representative of chordotonal organs in most crustaceans. Comparing the tension nerve responses to the proprioceptive responses is an effective teaching tool in determining how these sensory neurons are defined functionally and how the anatomy is correlated to the function. Three staining techniques are presented allowing researchers and instructors to choose a method that is ideal for their laboratory.

Physiological and anatomical techniques are demonstrated to address function and structure for joint proprioceptors and muscle tension receptors in crustacean walking limbs.

Propriocezione e la tensione recettori in Crab Arti: Esercizi di laboratorio per studenti

The primary purpose of these procedures is to demonstrate for teaching and research purposes how to record the activity of living primary sensory neurons ...