Name: isolating and using sections of bovine mesenteric artery and vein as a bioassay to test for vasoactivity in the small intestine
Uploaded: 2014-10-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolating and Using Sections of Bovine Mesenteric Artery and Vein as a Bioassay to Test for Vasoactivity in the Small Intestine at JoVE.com

Gli autori riconoscono Ryan Chaplin e il dottor Gregg Rentfrow della University of Kentucky Carni Lab e Dipartimento di Scienze degli Alimenti animali e per fornire opportunità di raccogliere i tessuti sperimentali utilizzati nel presente documento.

Le procedure utilizzate in questo studio non hanno richiesto l&#39;approvazione presso l&#39;Università del Kentucky Animal Care and Use Committee, perché non sono stati utilizzati animali vivi. Prima di raccolta di ogni campione utilizzato nel presente documento, tutti gli animali sono stati storditi con un proiettile captivo e dissanguato. Questo è stato condotto in una struttura federale mattatoio ispezionato presso l&#39;Università del Kentucky. Un rappresentante ufficiale della sicurezza alimentare e Inspection Servizio USDA ha osservato tutte le attività che si sono occupati con il live degli animali e la manipolazione della carcassa. 1 Preparazione di Strumentazione <ol><li> Per ridurre al minimo la quantità di tempo tra le collezioni di campioni di tessuto per l&#39;inizio di un esperimento, impostare attrezzature e preparare i buffer prima di raccogliere il tessuto sperimentale (o se sono disponibili personale supplementare, queste attività possono verificarsi simultaneamente). NOTA: Questo non solo fornisce la maggior quantità di tempo che il tessuto rimane vitale per condurre esperimenti, ma alcuniesperimenti possono funzionare per lunghi periodi di tempo (o vi è il desiderio di completare più esperimenti in un giorno), quindi di solito è opportuno iniziare il più presto possibile. </li><li> Accendere il computer associato, attrezzature acquisizioni di dati, bagnomaria (per il buffer (s)) e myograph unità (s). Posizionare l&#39;apparecchiatura di calibrazione sull&#39;unità myograph (s) e accendere il calore myograph (preimpostato a 37,5 ° C) e lasciare le unità e le apparecchiature di taratura a caldo per preimpostare le temperature. <ol><li> Aprire un file di impostazioni del software Grafico creato in precedenza sul computer e avviare una corsa (ma non l&#39;acquisizione di dati). </li></ol></li><li> Riscaldare l&#39;apparecchio per 10 min. <ol><li> Avviare l&#39;acquisizione dei dati. </li><li> Zero tutti i canali. </li><li> Vedi, e condurre calibrazione (se necessario) su ciascun canale (4 canali per multimyograph) per standardizzare il segnale elettrico fornito dal rispettivo trasduttore di forza associata a quel canale a 2 g forza fornita da un peso certificata. </li><li> Dopo la calibrazione e una conversione unità sono completate, memorizzare tutti i dati successivi come grammi. Cambia di conseguenza sulla base di desideri di ogni laboratorio separato; l&#39;apparecchiatura e il software consentono l&#39;uso di altre unità, come millinewton e volt. </li></ol></li><li> Assicurarsi che le linee del gas sono chiare di blocchi e accendere fornitura di gas (95% O 2/5% di CO 2) per myograph (s) unità. Continuamente gas tutti i buffer (nelle camere myograph) durante l&#39;intera procedura. </li><li> Riempire tutte le camere myograph con il 70% di etanolo e ammollo per 10 minuti, rimuovere l&#39;etanolo, e ripetere per un secondo 10 min ammollo. <ol><li> Dopo aver rimosso l&#39;etanolo, lavare tre volte con acqua deionizzata, seguita da tre lavaggi con tampone preparato (vedi Sezione 2 per la preparazione di buffer), lasciando la terza aggiunta di tampone nelle camere. NOTA: A questo punto l&#39;apparecchio può rimanere inattiva in questo stato fino a quando sono preparati tampone e il tessuto e il personale è pronto a procedere con le sperit. </li></ol></li></ol> 2 Preparazione del buffer <ol><li> Preparare una soluzione tampone 1 L Krebs-Henseleit per l&#39;uso nel trasporto e lavorazione di campioni di tessuto per ottenere concentrazioni finali di 11.1 mm D-glucosio; 1.2 mM MgSO4; 1,2 mm KH 2 PO 4; 4.7 mM KCl; 118,1 mM NaCl; 3.4 mM CaCl 2; 24.9 NaHCO mm 3. <ol><li> Mescolare 9,6 g di sali Krebs in circa 900 ml di acqua deionizzata su un piatto mescolare. </li><li> Mescolare in 0,373 g di cloruro di calcio diidrato seguita da 2,1 g di bicarbonato di sodio per L di tampone desiderato. </li><li> Soluzione tampone a gas per 20 minuti con il 95% O 2/5% di CO 2. </li><li> Dopo la gasazione, aggiustare il pH a 7.05 (filtrazione di tampone aumenta il pH; obiettivo finale pH dovrebbe essere 7.4) e regolare il volume di 1 L. </li><li> Filtro sterilizzare tampone in un autoclave 1 L bottiglia e serbatoio tampone mezzi puliti a 4 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li></ol></li><li> Preparare a parte Krebs-Hsoluzione tampone enseleit per l&#39;uso negli esperimenti myograph come descritto al punto 2.1 per il trasporto tampone Krebs-Henseleit con composti aggiuntivi che riguardano gli esperimenti contrattilità. NOTA: in genere 2 L sarà sufficiente per esperimenti descritti in questo articolo, ma questo volume potrebbe dover essere aumentato o diminuito in base alla lunghezza dell&#39;esperimento, numero di camere myograph, e sostituzioni tampone numero (relativi a integrazioni di trattamento). <ol><li> Prima della fase di gassificazione (punto 2.1.3), aggiungere 9,1 mg (per L di tampone in preparazione) di desipramina-HCl buffer. </li><li> Preparare una soluzione di propranololo-HCl 1,0 micron e aggiungere 1 ml (per L di tampone in preparazione) di questa soluzione alla soluzione tampone Krebs-Henseleit. Rendere questo buffer nel giorno di utilizzo e mantenerlo a temperature myograph operativo (una temperatura che produce una temperatura di 37,5 ° nella myograph). NOTA: La desipramina viene aggiunto per inibire i meccanismi selettivi della ricaptazione delle ammine biogenee permettere compensazione di aggiunte sperimentali dal buffer di balneazione i vasi sanguigni a verificarsi più rapidamente. L&#39;aggiunta di propranololo previene il legame di composti di trattamento di β-adrenergici recettori non specifico. </li></ol></li></ol> 3 Raccolta e preparazione dei vasi <ol><li> Non appena possibile, rimuovere il tratto gastrointestinale dalla carcassa. Una volta che l&#39;animale non presenta alcun riflesso involontario, togliere la testa e nascondere e poi sollevare la carcassa in senso verticale. La rimozione dei visceri gastrointestinale (esofago all&#39;ano) dalla carcassa dovrebbe essere completata da personale macelli riconosciuti (&lt;20 min dal momento di stordimento). NOTA: quanto tempo, è generalmente limitata dalla posizione / struttura in cui il tratto intestinale viene raccolto da e procedure operative standard o procedure mandato federale seguite da personale dell&#39;impianto. <ol><li> Nella maggior parte delle strutture, effettuare manipolazioni del tratto gastrointestinalein una posizione separata dalla trasformazione della carcassa che è destinata ad entrare nella alimentare. Utilizzare una zona comoda dove il tratto gastrointestinale può essere preso e sparsi per l&#39;esame. </li></ol></li><li> Una volta che il tratto gastrointestinale è sparso, identificare l&#39;intestino tenue, la piega ileocecale collega il piccolo intestino per cieco, e la flangia ileale estende prossimalmente alla piega ileocecale (Figura 1A). <ol><li> Usando un bisturi o un coltello, molto leggermente fare un&#39;incisione nella membrana mesenterica nel centro della flangia ileale. Utilizzando due dita indice, senza mezzi termini sezionare via il tessuto adiposo e connettivo, esponendo il sistema vascolare mesenterica (Figura 1B). </li></ol></li><li> Da questa flangia o rigonfiamento nel mesentere intestinale, sezionare i rami multipli (~ 2 cm di lunghezza) delle arteria e vena mesenterica fasci esposti che supportano questa porzione dell&#39;ileo (Figura 1C). <ol><li> Se ucantare pinze per afferrare il tessuto, fare attenzione a non afferrare o tirare direttamente sui vasi sanguigni a tutti durante la rimozione come qualsiasi tipo di stretching può danneggiare e effetto negativamente sulle prestazioni dei tessuti 14. Rimozione dei vasi sanguigni è fatto meglio, tagliando attraverso ciascuna estremità della sezione da rimuovere e poi tagliando a fianco o parallela alla sezione ora isolato. Per facilità, rimuovere alcuni del tessuto circostante con vasi di fornire alcuni tessuti di cogliere con un paio di pinze. </li><li> Con un paio di pinze, sommergere campione di tessuto in una provetta contenente ghiaccio freddo tampone Krebs-Henseleit e memorizzare in ghiaccio fino al trattamento può avvenire in laboratorio. </li></ol></li><li> Mettere campione di tessuto su una superficie di taglio o in una scatola di Petri e parzialmente immergere in ghiaccio freddo Krebs-Henseleit. <ol><li> Utilizzando # 5 gioiellerie pinze, Noyes iris forbici, e la lampada di ingrandimento o dissezione portata (da 2,5 a 5.0X ingrandimento è sufficiente), sezionare con attenzione via il connecti grasso e dintornive tessuti e separare l&#39;arteria e vena. Identificare l&#39;apertura nave ad una estremità della sezione e afferrare con cura la fascia che circonda il vaso con le pinze. </li><li> Effettuare un taglio con le forbici parallele alla nave facendo scorrere la punta della forbice sotto la fascia in rilievo. Dopo l&#39;incisione iniziale, il grasso e tessuti connettivi possono essere ulteriormente staccati dal vaso riducendo entrambi i lati con le forbici. Assicurarsi che i vasi siano il più pulito possibile, riducendo al minimo la quantità di tempo che le navi passano in panchina. </li><li> Ritorna vasi sanguigni per tubi di fresco tampone Krebs-Henseleit e conservare a 4 ° C (campioni rimangono memorizzati fino a 24 ore dopo la raccolta e ancora produrre dati contrattilità validi). </li><li> Utilizzando una lama di rasoio, nave slice da utilizzare in myograph in numero desiderato di sezioni da 2 mm (è utile usare una affettatrice tessuto per ottenere sezioni coerenti). </li><li> Esaminare ogni sezione sotto una sco dissezionepe (12,5X ingrandimento) per garantire che ogni sezione ha anomalie, rami, valvole, o danni superficiali inavvertitamente fatto durante la dissezione e la pulizia. Sostituire la sezione di nave se c&#39;è qualche anomalia, ramo, valvola, o danni superficiali. </li></ol></li><li> Conservare accettabili sezioni fette di navi (sommersi in tampone Krebs-Henseleit) su ghiaccio o a 4 ° C fino al momento per il montaggio in camere myograph (di solito &lt;30 min). </li><li> Montare delicatamente il vaso sul myograph inserendo i supporti attraverso il lume e aumentare la tensione (utilizzando il micropositioner sul myograph) facendo attenzione a non allungare i vasi sopra una lettura da 2 a 3 g. </li><li> Una volta che tutte le camere sono coperte, aspirare il buffer da tutte le camere e riempire con 5,0 ml di tampone e avviare un timer di 15 minuti per iniziare il periodo di equilibrio e l&#39;esperimento. </li></ol> 4 Experiment <ol><li> Equilibrare tutte le sezioni delle navi per 1,5 ore per ottenere una res stabileting tensione di 1,0 g. <ol><li> Sostituire il tampone di incubazione Krebs-Henseleit ogni 15 min. </li><li> Durante l&#39;equilibrio, costantemente regolare la tensione sulle sezioni dei vasi sanguigni fino a 2 g e quindi consentire di rilassarsi fino a circa 0,80 g. Cercate di non consentire alle navi di rilassarsi troppo (potrebbero scivolare i supporti). Cercate di ottenere una tensione di riferimento costante, dove la nave detiene 1 g tensione senza necessità di regolazione. </li></ol></li><li> Durante l&#39;equilibrazione, preparare una soluzione acquosa 1,32 M di KCl da utilizzare come riferimento. </li><li> A seguito del completamento di una equilibrazione soddisfacente, aggiungere 500 ml di soluzione 1,32 M KCl comportare una soluzione 0,12 M in soluzione 5,5 ml balneazione nave. <ol><li> Dopo l&#39;aggiunta di 1,32 M KCl, non regolare manualmente la tensione come la risposta massima di tale aggiunta viene utilizzato per valutare la vitalità del tessuto e può essere utilizzato per normalizzare i dati di trattamento (ad esempio risposte di concentrazione di un agonist). </li><li> Sostituire il buffer in intervalli di 15 minuti fino a quando la tensione è tornato al valore basale di 1,0 g. </li></ol></li><li> Una volta raggiunto basale, modificare il buffer e contemporaneamente iniziare un 1 min timer. Fate questo per tutte le camere simultaneamente per evitare un impressionante di orari di inizio. <ol><li> Agitare la norma da aggiungere e preparare un commento per camera 1 durante il conto alla rovescia 1 min. </li><li> Aggiungere le norme in 25 aliquote microlitri di ciascuna camera come i dettami esperimento (questo mantiene il trattamento al di sotto dello 0,5% del volume totale). </li><li> Una volta aggiunto l&#39;ultimo livello, avviare un 9 min timer. </li><li> Alla fine del 9 min di incubazione standard rimuovere il tampone di trattamento contenenti dalle camere e aggiungere 5,0 ml di tampone fresco, e avviare il timer 2,5 min. </li><li> Ripetere il punto 4.4.4. </li><li> Alla fine del secondo 2,5 min risciacquo, aspirare sezioni e aggiungere tampone fresco, e avviare un 1 min timer per conto alla rovescia l&#39;inizio della secondad aggiunta standard. </li></ol></li><li> Continuare con questo ciclo per tutte le aggiunte standard della giornata. </li><li> Durante l&#39;aggiunta dello standard finale e la successiva 9 min di incubazione preparare il composto di riferimento M KCl 1,32 per un fine dose aggiunta di riferimento run di 500 microlitri. </li><li> Dopo l&#39;intervallo di 1 min dopo l&#39;aggiunta del trattamento finale, aggiungere il KCl e avviare un 9 min timer. NOTA: L&#39;aggiunta KCl è quello di confermare la vitalità del tessuto a conclusione dell&#39;esperimento ed è utile se la somministrazione di un trattamento che si traduce in risposta trascurabile. </li><li> Al termine della finale 9 min composto di riferimento di incubazione, aspirare o rimuovere il tampone da tutte le camere. Non aggiungere tampone fresco. Concludere l&#39;esperimento. </li><li> Salvare il file grafico, rimuovere le sezioni dei vasi sanguigni e smaltire correttamente e seguire il protocollo pulizia (fornito dal costruttore e possono essere specifiche di laboratorio) per le apparecchiature myograph. </li></ol>

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La sfida iniziale per lo sviluppo di questo saggio biologico è stato la creazione di un centro di raccolta ripetibile per vascolarizzazione mesenterica. Consistenza sito campione è critica, in quanto alcune delle funzioni del piccolo intestino cambiamento durante la progressione del digiuno attraverso l&#39;ileo e conseguentemente il mesentere variano in un modello simile. I rami ileali di mesenterica e vena sono stati i più facilmente identificabili attraverso punti di riferimento anatomici. Collocando il cieco e seguendo la piega ileocecale al suo capolinea sul lato sinistro del mesentere, questo è vicino alla cessazione del cranica mesenterica 15. L&#39;area del mesentere più lungo (definito la flangia) e l&#39;estensione della piega ileocecale (unico al bovino) 16 campionamento realizzato attraverso numerosi animali molto ripetibili. Una delle insidie ​​più grandi che possono essere fatte sia in questa fase del saggio biologico. Stiramento meccanico ha un grande impatto negativo sulla successiva nave prestazioni 14 e il ricercatore noteranno che le navi che sono troppo manipolate o allungati durante la rimozione e la pulizia successiva non risponderanno al composto di riferimento in uso. Questo è purtroppo l&#39;unico modo per valutare veramente la qualità della preparazione vascolare a livello funzionale e vasi che non rispondono al KCl non dovrebbero essere considerati ulteriore per la generazione di dati affidabili. Altri due passi di validazione metodo (non mostrato) che hanno portato al metodo finale presentata qui erano l&#39;uso di altre sostanze chimiche, come composti di riferimento e testare la fattibilità dei vasi sanguigni dopo 24 ore di archiviazione. Noradrenalina e serotonina sono stati valutati come composti di riferimento, ma le risposte da parte l&#39;arteria mesenterica e la vena erano troppo variabili in tutta tipo di nave e di tutti gli animali per loro di essere utilizzati con successo. Al contrario, l&#39;aggiunta di 120 mM KCl determinato una risposta molto riproducibile su entrambe le preparazioni arterie e vene. LaLSO, arteria e vena risposte sono state valutate al momento della raccolta e rivalutato 24 ore dopo la raccolta e non c&#39;erano differenze nella risposta agonista da una arteria o vena. Questo era un aspetto importante del saggio biologico, come spesso ci sono un gran numero di trattamenti (o varie combinazioni di trattamento) che possono essere applicate, ma i ricercatori sono limitati da spazio sulla miografo e tempo. Estendendo il periodo di validità out 24 ore dalla raccolta, il tempo per la sperimentazione supplementare è aumentata notevolmente. E &#39;importante per il ricercatore per capire la flessibilità della struttura trattamento applicato a questo saggio biologico. Un ricercatore può aggiungere qualsiasi composto al buffer di incubazione che lui o lei è interessato cronicamente esponendo i vasi sanguigni in modo da controllare qualcosa di rilevanza biologica o come trattamento (nel caso di Klotz et al. 17, questo è stato fatto con safene laterali continuamente esposti a ketanserin, che antagonizzata un recettore della serotonina di interesse). I vasi sanguigni mesenterici potevano essere pretrattati con un composto di interesse prima di condurre un esperimento risposta contrattile. Il saggio biologico, come presentato, è stato progettato per condurre un esperimento di concentrazione-risposta cumulative guardando alcaloidi della segale cornuta come agonisti e se prima esposizione alimentare di alcaloidi dell&#39;ergot colpite la risposta vascolare 18. I risultati rappresentativi dimostrano che questo metodo può produrre una risposta vascolare misurabile e solo quattro concentrazioni sono stati usati per raggiungere questo obiettivo. Nel caso di Egert et al. 18, c&#39;erano fino a 10 differenti concentrazioni usate per costruire una curva di risposta. Questo metodo è un metodo per valutare un gran numero di composti o recettori sui vasi sanguigni differenti da un singolo animale in una piccola finestra di tempo.

Le alterazioni del flusso sanguigno in un letto di tessuto può avere un grande impatto sulla funzione d&#39;organo. Una funzione primaria del piccolo intestino è l&#39;assorbimento dei nutrienti. Arteriosa flusso di sangue verso la superficie di assorbimento dell&#39;intestino è necessario per l&#39;assorbimento dei nutrienti e aumenta il flusso sanguigno per aiutare l&#39;assorbimento dei nutrienti come Digesto si muove lungo la superficie 1. Una diminuzione del flusso sanguigno può causare una riduzione dell&#39;assorbimento dei nutrienti a causa di una diminuzione del gradiente transepiteliale 2. Oltre ai nutrienti, il piccolo intestino può essere esposto a metaboliti secondari, farmaci o tossine che esercitano un effetto sul flusso sanguigno localizzato nel mesentere. Nel caso di animali ruminanti, composti possono essere liberati da un mangime (ad esempio, sostanze nutritive, quali aminoacidi, o tossine come ad esempio alcaloidi della segale cornuta) attraverso processi fermentativi del foregut. Se questi composti sopravvivono il metabolismo microbico di fermentazione ruminale, sono ora disponibili per l&#39;assorbimentoo interazione mentre viaggiano attraverso il tratto gastrointestinale dell&#39;animale. Ci sono un certo numero di metodi diversi a disposizione per misurare il flusso di sangue in vivo (ad esempio, Doppler, insito flussometri sangue, microsfere radioattivi, e le tecniche di indicatore-diluizione) che permettono la valutazione dei vari scenari sperimentali o trattamenti. Tuttavia, per ottenere informazioni riguardanti le proprietà meccaniche o farmacologiche di muscolatura liscia vascolare, i metodi sono rimasti limitati alle imbarcazioni più grandi fino Mulvany e Halpern 3 ha pubblicato un articolo che descrive una tecnica con filo montato preparati anello vascolare in un miografo. Poiché lo sviluppo di questa tecnica, modifiche continuano ad essere apportata ai sistemi miografo associate che permettono una varietà di applicazioni differenti per la valutazione di strutture tubolari. Il sistema è stato anche adattato per utilizzare barre fissi per il montaggio di navi più grandi 4 dove perfusionetecniche non sono desiderati. A causa delle differenze nei vasi di diverse origini anatomiche e distinzioni nelle stesse navi di diverse specie di animali, i dati da nave e tipo di animale non può essere facilmente estrapolati in diversi recipienti o sulla stessa nave in diversi tipi di animali 5. Di conseguenza, test biologici separati devono essere sviluppati e convalidati in qualsiasi momento questi aspetti sono cambiati. Recentemente diversi test biologici sono stati sviluppati con queste tecnologie per l&#39;uso in bovini laterali vena safena e destra arteria e vena ruminale 6,7. Questo saggio biologico è stato sviluppato specificamente per indagare gli effetti che alcaloidi dell&#39;ergot hanno sul sistema vascolare sostegno tenue. E &#39;stato riferito che il 50-60% di alcaloidi alimentati appaiono in contenuti abomasali, ma solo il 5% viene recuperato nelle feci 8. Strickland et al. 9 ha dichiarato in una recensione di alcaloidi della segale cornuta, che i dati Sugg disponibiliest che l&#39;intestino tenue può essere il sito più importante per l&#39;assorbimento ergopeptine. Eckert et al. 10 aspetti biofarmaceutici recensione di alcaloidi della segale cornuta e ha dichiarato che una volta che attraversano la barriera epiteliale, alcaloidi della segale cornuta sono trasportati dal sistema linfatico alla vena succlavia o via vena mesenterica e in sangue portale. Rhodes et al. 11 ha registrato una diminuzione del flusso di sangue al duodeno e colon in manzi che consumano un (alto alcaloide della segale cornuta) dieta ad alto endophyte-infettati. Utilizzando il diritto ruminale arteria e vena biotest, Foote et al. 12 hanno dimostrato che gli alcaloidi dell&#39;ergot sono vasoattivi in vasi ruminale. Foote et al. 13 successivamente dimostrato in vivo che l&#39;esposizione agli alcaloidi dell&#39;ergot ruminale risultati in una diminuzione del rumine flusso di sangue epiteliale. Questa diminuzione del flusso di sangue alla superficie di assorbimento del rumine contemporaneamente ha provocato una riduzione dei nutrienti (acidi grassi volatili) flusso. Data la quantity di alcaloidi della segale cornuta che passano al piccolo intestino dal foregut; è stato ipotizzato che un effetto simile sulla piccola vascolare intestinale e l&#39;assorbimento dei nutrienti si sarebbe verificato. Ciò ha richiesto lo sviluppo dei bovini prossimale dell&#39;ileo mesenterica arteria e vena biotest.

<table><tbody><tr><td>Multi Myograph</td><td>Danish Myo Technologies</td><td>610M</td><td>A myograph is critical to this bioassay, but there are other platforms available for use that will suffice.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Powerlab 8/sp</td><td>ADIntruments</td><td>ML785</td><td></td></tr><tr><td>LabChart 7</td><td>ADInstruments</td><td>Version 7</td><td></td></tr><tr><td>Force Calibration Kit</td><td>Danish Myo Technologies</td><td>100055</td><td>Specific to DMT myographs</td></tr><tr><td>Bottle-top Filter</td><td>Nalgene</td><td>595-4520</td><td>0.22 &amp;#956;m pore size; 45 mm neck size</td></tr><tr><td>#5 Jewler&amp;rsquo;s Forceps</td><td>Miltex</td><td>555008FT</td><td>Any brand of forceps can be used</td></tr><tr><td>Noyes Iris Scissors</td><td>Miltex</td><td>18-1510</td><td>Any brand of scissors can be used</td></tr><tr><td>Dissecting Scope</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000-C</td><td>Any brand of dissecting light microscope will suffice</td></tr><tr><td>Adjustable Tissue Matrice</td><td>Braintree Scientific</td><td>TM C12</td><td>This is not critical to the assay, but greatly reduces section to section variation in length and speeds up the slicing process greatly</td></tr><tr><td>Krebs-Hensleit Buffer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K3753-10x1L</td><td>It is not necessary to buy Krebs, this can be made in house</td></tr><tr><td>Calcium chloride dehydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7902-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761-500G</td><td></td></tr><tr><td>Desipramine-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D3900-5G</td><td></td></tr><tr><td>Propranolol-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0884-1G</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333-500G</td><td></td></tr><tr><td>95% O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;/5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Scott Gross</td><td>UN3156</td><td></td></tr></tbody></table>

isolating and using sections of bovine mesenteric artery and vein as a bioassay to test for vasoactivity in the small intestine

Sistemi gastrointestinale dei mammiferi sono costantemente esposti a composti (desiderabili e indesiderabili) che possono avere un effetto sul flusso di sangue da e verso quel sistema. Le variazioni di flusso di sangue al piccolo intestino può provocare effetti sulle funzioni di assorbimento dell&#39;organo. Particolare interesse per le tossine liberate dai mangimi attraverso processi fermentativi e digestivi si è sviluppata nei ruminanti come un settore in cui le efficienze produttive potrebbero essere migliorati. Il video associato a questo articolo viene descritto un test biologico in vitro sviluppati per i composti dello schermo per vasoactivity in isolate sezioni di bovini mesenterica arteria e vena con un multimyograph. Una volta che i vasi sanguigni sono montati ed equilibrati nel myograph, il saggio biologico in sé può essere utilizzata: come strumento di screening per valutare la risposta contrattile o vasoactivity di composti di interesse; determinare la presenza di tipi di recettori da parte farmacologicamente mira recettori con agonisti specificis; determinare il ruolo di un recettore con la presenza di uno o più antagonisti; o determinare potenziali interazioni di composti di interesse con antagonisti. Attraverso tutto questo, i dati vengono raccolti in tempo reale, il tessuto prelevato da un singolo animale può essere esposto a un gran numero di diversi trattamenti sperimentali (un vantaggio in vitro), e rappresenta vascolare su entrambi i lati del letto capillare per fornire un accurato immagine di ciò che potrebbe accadere nel afferenti ed efferenti apporto di sangue sostenere il piccolo intestino.

I vasi sanguigni utilizzati per generare i risultati inclusi sono stati raccolti da 6 manzi Holstein (425 ± 8 kg) all&#39;interno di un intervallo di 3 settimane. Un esempio di una tipica mesenterica risposta contrattile vena di KCl e aggiunte di trattamento in aumento in concentrazione è presentato in Figura 2. L&#39;entità della risposta varierà alcuni con le dimensioni del vaso (correlata alla dimensione dell&#39;animale donatore), ma può anche essere influenzato (negativamente) da un uso improprio (stretching) dei vasi durante la raccolta e la pulizia. Pertanto, è importante osservare una significativa risposta contrattile nell&#39;esposizione vasi di KCl. Se una risposta trascurabile viene osservata a questo punto, non è opportuno procedere oltre nella procedura di tale nave. Come visto nei periodi di incubazione 9 min in figura 2, vi sono aumenti incrementali nella risposta che corrispondono con concentrazioni crescenti. Anche se auspicabile che tale particdisegno sperimentale lare, non può sempre verificarsi o essere ricercata con altri trattamenti. L&#39;aggiunta KCl a conclusione dell&#39;esperimento, anche se non utilizzato nel trattamento dei dati raccolti, è molto importante in quanto conferma la vitalità del tessuto al termine del periodo di sperimentazione (diventa più importante se la nave non risponde a qualsiasi delle aggiunte di trattamento). I dati presentati nella figura 2 sono registrati in grammi di tensione. È importante normalizzare questi dati per ridurre al minimo qualsiasi animale a animale variazione vaso-a-nave e. Così, oltre ad essere utilizzato come indicatore di vitalità, la risposta massima KCl viene utilizzato per normalizzare tutte le aggiunte di trattamento. Questo genera dati di risposta contrattile come percentuale del massimo KCl. Ecco come mesenterica e di risposta vena curve della crescente concentrazione di 5-idrossitriptamina (serotonina, Figura 3) e noradrenalina ( <strong&gt; Figura 4) sono presentati. I dati in queste figure sono state in forma sigmoidale curva di concentrazione-risposta mediante una regressione non lineare. La risposta vena mesenterica sia 5-idrossitriptamina (Figura 3) e noradrenalina (Figura 4) iniziato come valori negativi. Questo è il risultato di correggere la tensione massima registrata durante ciascun periodo di incubazione 9 min dalla tensione basale registrata prima dell&#39;aggiunta iniziale KCl. Questa correzione al basale assicura che eventuali lievi differenze di tensione non sono inclusi nelle analisi e consentono i dati presentati per riflettere solo un cambiamento di tensione. Il valore risultati negativi del vaso sanguigno del relax e cadere di sotto dei livelli basali pre-KCl prima della successiva aggiunta di trattamento. Ciò è particolarmente comune in campioni venosi dove le concentrazioni iniziali del trattamento o agonista sono troppo bassa per causare una risposta contrattile. Questo non era il caso per il me<html> risposta arteria senteric a uno amine biogene, che ha tenuto la tensione al di sopra della linea di base fino a quando la nave ha cominciato a rispondere alle aggiunte di trattamento. Questa differenza esemplifica le differenze di vasi su entrambi i lati del letto capillare e perché sono stati entrambi considerati come parte di questo saggio biologico. Questo saggio biologico può essere utilizzato per valutare vasoactivity di composti sui vasi sanguigni che forniscono sostanze nutritive per il piccolo intestino e vasi sanguigni che portano nutrienti assorbiti dal piccolo intestino. Dati in figure 3 e 4 sono semplici esempi di come questo possa essere realizzato. Nel caso della 5-idrossitriptamina (Figura 3), non c&#39;era una differenza nella risposta contrattile arteriosa o venosa. Viceversa, la risposta contrattile della vena mesenterica a concentrazioni crescenti di noradrenalina era maggiore di quella dell&#39;arteria mesenterica. figura 1 &quot;fo: content-width =&quot; &quot;src =&quot; 3in / files / ftp_upload / 52020 / 52020fig1highres.jpg &quot;width =&quot; 300 &quot;/&gt; Figura 1:. Un esempio di tratto intestinale bovina utilizzata come fonte di vasi sanguigni mesenterici L&#39;asterisco rosso indica la porzione visibile della piega ileocecale in tutti e tre i riquadri come punto di riferimento. (A) L&#39;intero tratto con l&#39;ovale rosso che indica la flangia ileale cui si è verificato il campionamento del sistema vascolare. (B) L&#39;esposizione del letto vascolare mesenterica. Forbici (C) Iris siano rivolte verso un ramo esposto della vena mesenterica (visibile) e l&#39;arteria (non visibile) solo prima della raccolta. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52020/52020fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2: Esempio di una risposta concentrazione di una vena mesenterica a concentrazioni crescenti di noradrenalina (1 × 10 -7 a 1× 10 -4 M). I grandi eventi all&#39;inizio e alla fine del tracciato sono le risposte alle 0.12 aggiunte M KCl. Il rettangolo rosso indica la zona di raccolta dati corrispondente al periodo di incubazione 9 min per ogni aggiunta di trattamento. Le punte 3 sottili che seguono questo sono artefatti generati dalle sostituzioni tampone e non sono inclusi nell&#39;analisi. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52020/52020fig2highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52020/52020fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3: Significa risposte contrattili dell&#39;arteria mesenterica (MA) e vena (MV, n = 6 manzi) a concentrazioni crescenti di 5-idrossitriptamina (serotonina) linee mostrate sono state generate utilizzando l&#39;analisi di regressione non lineare per adattare i dati a un sigmoidale. concentrazione rcurva esponse che utilizzava la seguente equazione: y = inferiore + [(alto - basso) / (1 ​​+ 10 (logEC 50 - x))], dove superiore e inferiore sono la percentuale di 120 mM KCl massima risposta contrattile alla plateau, e la EC50 è la concentrazione molare di alcaloide produrre il 50% della risposta massima KCl. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52020/52020fig4highres.jpg" width="500" /> Figura 4: Significa risposte contrattili dell&#39;arteria mesenterica (MA) e vena (MV, n = 6 manzi) a concentrazioni crescenti di noradrenalina linee mostrate sono state generate utilizzando l&#39;analisi di regressione non lineare per adattarsi ai dati di una curva di concentrazione-risposta sigmoidale che ha utilizzato. la seguente equazione: y = inferiore + [(alto - basso) / (1 ​​+ 10 (logEC 50 - x))], dove superiore e inferiore sono la percentuale di 120 mM KCl massimo contractile risposta al plateau, e la CE 50 è la concentrazione molare di alcaloide produrre il 50% della risposta massima KCl.

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Isolating and Using Sections of Bovine Mesenteric Artery and Vein as a Bioassay to Test for Vasoactivity in the Small Intestine

L&#39;intestino tenue è spesso esposto alle tossine che possono influenzare il flusso di sangue e di influenzare negativamente l&#39;assorbimento dei nutrienti. Utilizzando un multimyograph e mesenterica arteria e vena isolati, composti o tossine di interesse possono essere sottoposti a screening per vasoactivity.

Isolare e utilizzo Sezioni di mesenterica bovina arteria e vena come un saggio biologico per verificare Vasoactivity nel piccolo intestino

Mammalian gastrointestinal systems are constantly exposed to compounds (desirable and undesirable) that can have an effect on blood flow to and from that ...

isolating-using-sections-bovine-mesenteric-artery-vein-as-bioassay-to

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Medicine

9.6K Views.  USDA-Agricultural Research Service.  L'intestino tenue è spesso esposto alle tossine che possono influenzare il flusso di sangue e di influenzare negativamente l'assorbimento dei nutrienti. Utilizzando un multimyograph e mesenterica arteria e vena isolati, composti o tossine di interesse possono essere sottoposti a screening per vasoactivity. 

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Mesenteric Artery Contraction and Relaxation Studies Using Automated Wire Myography

Proximal resistance vessels, such as the mesenteric arteries, contribute substantially to the peripheral resistance. These small vessels of between 100-400 &mu;m in diameter function primarily in directing blood flow to various organs according to the overall requirements of the body. The rat mesenteric artery has a diameter greater than 100 &mu;m. The myography technique, first described by Mulvay and Halpern1, was based on the method proposed by Bevan and Osher2. The technique provides information about small vessels under isometric conditions, where substantial shortening of the muscle preparation is prevented. Since force production and sensitivity of vessels to different agonists is dependent on the extent of stretch, according to active tension-length relation, it is essential to conduct contraction studies under isometric conditions to prevent compliance of the mounting wires. Stainless steel wires are preferred to tungsten wires because of oxidation of the latter, which affects recorded responses3.The technique allows for the comparison of agonist-induced contractions of mounted vessels to obtain evidence for normal function of vascular smooth muscle cell receptors.
We have shown in several studies that isolated mesenteric arteries that are contracted with phenylyephrine relax upon addition of cumulative concentrations of extracellular calcium (Ca2+e). The findings led us to conclude that perivascular sensory nerves, which express the G protein-coupled Ca2+-sensing receptor (CaR), mediate this vasorelaxation response. Using an automated wire myography method, we show here that mesenteric arteries from Wistar, Dahl salt-sensitive(DS) and Dahl salt-resistant (DR) rats respond differently to Ca2+e. Tissues from Wistar rats showed higher Ca2+-sensitivity compared to those from DR and DS. Reduced CaR expression in mesenteric arteries from DS rats correlates with reduced Ca2+e-induced relaxation of isolated, pre-contracted arteries. The data suggest that the CaR is required for relaxation of mesenteric arteries under increased adrenergic tone, as occurs in hypertension, and indicate an inherent defect in the CaR signaling pathway in Dahl animals, which is much more severe in DS.
The method is useful in determining vascular reactivity ex vivo in mesenteric resistance arteries and similar small blood vessels and comparisons between different agonists and/or antagonists can be easily and consistently assessed side-by-side6,7,8.

An automated myography method for force measurements in isolated mesenteric arteries is described. It employs a Mulvany-Halpern Auto Dual Wire Myograph 510A to determine responses to phenylephrine and extracellular calcium. The method allows consistent determination of isometric responses to agonists in small vessels of diameters of 60 - 300 &mu;m, independently.

Contrazione Arteria mesenterica e Studi Relax Utilizzando Myography automatica Wire

Proximal resistance vessels, such as the mesenteric arteries, contribute substantially to the peripheral resistance. These small vessels of between ...

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Assessing Myogenic Response and Vasoactivity In Resistance Mesenteric Arteries Using Pressure Myography

Small resistance arteries constrict and dilate respectively in response to increased or decreased intraluminal pressure; this phenomenon known as myogenic response is a key regulator of local blood flow. In isobaric conditions small resistance arteries develop sustained constriction known as myogenic tone (MT), which is a major determinant of systemic vascular resistance (SVR). Hence, ex vivo&#160;pressurized preparations of small resistance arteries are major tools to study microvascular function in near-physiological states. To achieve this, a freshly isolated intact segment of a small resistance artery (diameter ~260 &#956;m) is mounted onto two small glass cannulas and pressurized. These arterial preparations retain most in vivo characteristics and permit assessment of vascular tone in real-time. Here we provide a detailed protocol for assessing vasoactivity in pressurized small resistance mesenteric arteries from rats; these arteries develop sustained vasoconstriction - approximately 25% of maximal diameter - when pressurized at 70 mmHg. These arterial preparations may be used to study the effect of investigational compounds on relationship between intra-arterial pressure and vasoactivity and determine changes in microvascular function in animal models of various diseases.

Pressure myography is used to assess vasoactivity of small arteries that develop sustained constriction when pressurized. This manuscript provides a detailed protocol to assess in isolated segments of small mesenteric arteries from rats, vasoactivity and the effect of intraluminal pressure on vascular diameter.

Valutare Miogenica risposta e Vasoactivity nelle arterie di resistenza mesenteriche Utilizzando Myography Pressione

Small resistance arteries constrict and dilate respectively in response to increased or decreased intraluminal pressure; this phenomenon known as myogenic ...

Ex Vivo Intestinal Sacs to Assess Mucosal Permeability in Models of Gastrointestinal Disease

The epithelial barrier is the first innate defense of the gastrointestinal tract and selectively regulates transport from the lumen to the underlying tissue compartments, restricting the transport of smaller molecules across the epithelium and almost completely prohibiting epithelial macromolecular transport. This selectivity is determined by the mucous gel layer, which limits the transport of lipophilic molecules and both the apical receptors and tight junctional protein complexes of the epithelium. In vitro cell culture models of the epithelium are convenient, but as a model, they lack the complexity of interactions between the microbiota, mucous-gel, epithelium and immune system. On the other hand, in vivo assessment of intestinal absorption or permeability may be performed, but these assays measure overall gastrointestinal absorption, with no indication of site specificity. Ex vivo permeability assays using &#34;intestinal sacs&#34; are a rapid and sensitive method of measuring either overall intestinal integrity or comparative transport of a specific molecule, with the added advantage of intestinal site specificity. Here we describe the preparation of intestinal sacs for permeability studies and the calculation of the apparent permeability (Papp) of a molecule across the intestinal barrier. This technique may be used as a method of assessing drug absorption, or to examine regional epithelial barrier dysfunction in animal models of gastrointestinal disease.

Ex Vivo Intestinal Sacs to Assess Mucosal Permeability in Models of Gastrointestinal Disease

This protocol describes the use of excised intestinal tissue preparations or "intestinal sacs" as an ex vivo model of intestinal barrier function. This model may be used to assess integrity of both the epithelial barrier and the mucous gel layer at specific intestinal sites in animal models of digestive disease.

Ex Vivo intestinale Sacs per valutare mucosa Permeabilità in modelli di malattia gastrointestinale

The epithelial barrier is the first innate defense of the gastrointestinal tract and selectively regulates transport from the lumen to the underlying ...

Rat Mesentery Angiogenesis Assay

The adult rat mesentery window angiogenesis assay is biologically appropriate and is exceptionally well suited to the 
study of sprouting angiogenesis in vivo [see review papers], which is the dominating form of angiogenesis in human tumors and non-tumor 
tissues, as discussed in invited review papers1,2. Angiogenesis induced in the membranous mesenteric parts by intraperitoneal (i.p.) injection of a pro-angiogenic factor can be modulated
by subcutaneous (s.c.), intravenous (i.v.) or oral (p.o.) treatment with modifying agents of choice. Each membranous part of the mesentery is 
translucent and framed by fatty tissue, giving it a window-like appearance.
The assay has the following advantageous features: (i) the test tissue is natively vascularized, albeit 
sparsely, and since it is extremely thin, the microvessel network is virtually two-dimensional, which allows the entire network 
to be assessed microscopically in situ; (ii) in adult rats the test tissue lacks significant physiologic angiogenesis, which characterizes
 most normal adult mammalian tissues; the degree of native vascularization is, however, correlated with age, as discussed in1; 
(iii) the negligible level of trauma-induced angiogenesis ensures high sensitivity; (iv) the 
assay replicates the clinical situation, as the angiogenesis-modulating test drugs are administered systemically and the responses 
observed reflect the net effect of all the metabolic, cellular, and molecular alterations induced by the treatment; (v) the assay 
allows assessments of objective, quantitative, unbiased variables of microvascular spatial extension, density, and network pattern 
formation, as well as of capillary sprouting, thereby enabling robust statistical analyses of the dose-effect and molecular 
structure-activity relationships; and (vi) the assay reveals with high sensitivity the toxic or harmful effects of treatments in 
terms of decreased rate of physiologic body-weight gain, as adult rats grow robustly.
Mast-cell-mediated angiogenesis was first demonstrated using this assay3,4. The model demonstrates a high level of 
discrimination regarding dosage-effect relationships and the measured effects of systemically administered chemically or functionally closely related drugs and proteins, 
including: (i) low-dosage, metronomically administered standard chemotherapeutics that yield diverse, drug-specific effects (i.e., 
angiogenesis-suppressive, neutral or angiogenesis-stimulating activities5); (ii) natural iron-unsaturated human lactoferrin, which stimulates 
VEGF-A-mediated angiogenesis6, and natural iron-unsaturated bovine lactoferrin, which inhibits VEGF-A-mediated angiogenesis7; and (iii) 
low-molecular-weight heparin fractions produced by various means8,9. Moreover, the assay is highly suited to studies of the combined 
effects on angiogenesis of agents that are administered systemically in a concurrent or sequential fashion.
The idea of making this video originated from the late Dr. Judah Folkman when he visited our laboratory and witnessed the methodology being demonstrated.
Review papers (invited) discussing and appraising the assay
Norrby, K. In vivo models of angiogenesis. J. Cell. Mol. Med. 10, 588-612 (2006).
Norrby, K. Drug testing with angiogenesis models. Expert Opin. Drug. Discov. 3, 533-549 (2008).

Normal adult vascularized mammalian tissue that lacks physiologic angiogenesis and that has not been exposed to surgical intervention is used to study: (i) the initiation and development of angiogenesis following intraperitoneal administration of test agents; and (ii) modification of angiogenesis following systemic administration of selected test agents.

Rat mesentere angiogenesi Assay

The adult rat mesentery window angiogenesis assay is biologically appropriate and is exceptionally well suited to the 
study of sprouting angiogenesis in ...

Biologia

The ex vivo Isolated Skeletal Microvessel Preparation for Investigation of Vascular Reactivity

The isolated microvessel preparation is an ex vivo preparation that allows for examination of the different contributions of factors that control vessel diameter, and thus, perfusion resistance1-5. This is a classic experimental preparation that was, in large measure, initially described by Uchida et al.15 several decades ago. This initial description provided the basis for the techniques that was extensively modified and enhanced, primarily in the laboratory of Dr. Brian Duling at the University of Virginia6-8, and we present a current approach in the following pages. This preparation will specifically refer to the gracilis arteriole in a rat as the microvessel of choice, but the basic preparation can readily be applied to vessels isolated from nearly any other tissue or organ across species9-13. Mechanical (i.e., dimensional) changes in the isolated microvessels can easily be evaluated in response to a broad array of physiological (e.g., hypoxia, intravascular pressure, or shear) or pharmacological challenges, and can provide insight into mechanistic elements comprising integrated responses in an intact, although ex vivo, tissue. The significance of this method is that it allows for facile manipulation of the influences on the integrated regulation of microvessel diameter, while also allowing for the control of many of the contributions from other sources, including intravascular pressure (myogenic), autonomic innervation, hemodynamic (e.g., shear stress), endothelial dependent or independent stimuli, hormonal, and parenchymal influences, to provide a partial list. Under appropriate experimental conditions and with appropriate goals, this can serve as an advantage over in vivo or in situ tissue/organ preparations, which do not readily allow for the facile control of broader systemic variables. 
The major limitation of this preparation is essentially the consequence of its strengths. By definition, the behavior of these vessels is being studied under conditions where many of the most significant contributors to the regulation of vascular resistance have been removed, including neural, humoral, metabolic, etc. As such, the investigator is cautioned to avoid over-interpretation and extrapolation of the data that are collected utilizing this preparation. The other significant area of concern with regard to this preparation is that it can be very easy to damage cellular components such as the endothelial lining or the vascular smooth muscle, such that variable source of error can be introduced. It is strongly recommended that the individual investigator utilize appropriate measurements to ensure the quality of the preparation, both at the initiation of the experiment and periodically throughout the course of a protocol.

The ex vivo Isolated Skeletal Microvessel Preparation for Investigation of Vascular Reactivity

An ex vivo preparation is described for isolation of the largest gracilis muscle resistance arterioles for interrogation of both vascular responses to vasoactive stimuli and the assessment of basic structural properties via passive wall mechanics.

Il Ex vivo Preparazione isolato microvasi scheletrico per le Indagini di reattività vascolare

The isolated  microvessel preparation is an ex vivo preparation that allows for examination of the different contributions of  factors that control vessel ...

Exploring Arterial Smooth Muscle Kv7 Potassium Channel Function using Patch Clamp Electrophysiology and Pressure Myography

Contraction or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries determines the artery diameter and thereby controls flow of blood through the vessel and contributes to systemic blood pressure. The contraction process is regulated primarily by cytosolic calcium concentration ([Ca2+]cyt), which is in turn controlled by a variety of ion transporters and channels. Ion channels are common intermediates in signal transduction pathways activated by vasoactive hormones to effect vasoconstriction or vasodilation. And ion channels are often targeted by therapeutic agents either intentionally (e.g. calcium channel blockers used to induce vasodilation and lower blood pressure) or unintentionally (e.g. to induce unwanted cardiovascular side effects).
Kv7 (KCNQ) voltage-activated potassium channels have recently been implicated as important physiological and therapeutic targets for regulation of smooth muscle contraction. To elucidate the specific roles of Kv7 channels in both physiological signal transduction and in the actions of therapeutic agents, we need to study how their activity is modulated at the cellular level as well as evaluate their contribution in the context of the intact artery.
The rat mesenteric arteries provide a useful model system. The arteries can be easily dissected, cleaned of connective tissue, and used to prepare isolated arterial myocytes for patch clamp electrophysiology, or cannulated and pressurized for measurements of vasoconstrictor/vasodilator responses under relatively physiological conditions. Here we describe the methods used for both types of measurements and provide some examples of how the experimental design can be integrated to provide a clearer understanding of the roles of these ion channels in the regulation of vascular tone.

Measurements of Kv7 (KCNQ) potassium channel activity in isolated arterial myocytes (using patch clamp electrophysiological techniques) in parallel with measurements of constrictor/dilator responses (using pressure myography) can reveal important information about the roles of Kv7 channels in vascular smooth muscle physiology and pharmacology.

Esplorare arteriosa Muscolo liscio KV7 Funzione canale del potassio con morsetto Elettrofisiologia Patch e Myography pressione

Contraction  or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries  determines the artery diameter and thereby controls flow of ...

Isolation of Microvascular Endothelial Tubes from Mouse Resistance Arteries

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic by-products, as exemplified by exercising skeletal muscle. Endothelial cells (ECs) line the intima of all resistance vessels and serve a key role in controlling diameter (e.g.&#160;endothelium-dependent vasodilation) and, thereby, the magnitude and distribution of tissue blood flow. The regulation of vascular resistance by ECs is effected by intracellular Ca2+ signaling, which leads to production of diffusible autacoids (e.g.&#160;nitric oxide and arachidonic acid metabolites)1-3 and hyperpolarization4,5 that elicit smooth muscle cell relaxation. Thus understanding the dynamics of endothelial Ca2+ signaling is a key step towards understanding mechanisms governing blood flow control. Isolating endothelial tubes eliminates confounding variables associated with blood in the vessel lumen and with surrounding smooth muscle cells and perivascular nerves, which otherwise influence EC structure and function. Here we present the isolation of endothelial tubes from the superior epigastric artery (SEA) using a protocol optimized for this vessel.
To isolate endothelial tubes from an anesthetized mouse, the SEA is ligated in situ to maintain blood within the vessel lumen (to facilitate visualizing it during dissection), and the entire sheet of abdominal muscle is excised. The SEA is dissected free from surrounding skeletal muscle fibers and connective tissue, blood is flushed from the lumen, and mild enzymatic digestion is performed to enable removal of adventitia, nerves and smooth muscle cells using gentle trituration. These freshly-isolated preparations of intact endothelium retain their native morphology, with individual ECs remaining functionally coupled to one another, able to transfer chemical and electrical signals intercellularly through gap junctions6,7. In addition to providing new insight into calcium signaling and membrane biophysics, these preparations enable molecular studies of gene expression and protein localization within native microvascular endothelium.

We present a preparation for visualizing and manipulating calcium signaling in native, intact microvascular endothelium. Endothelial tubes freshly isolated from mouse resistance arteries supplying skeletal muscle retain in vivo morphology and dynamic signaling within and between neighboring cells. Endothelial tubes can be prepared from microvessels of other tissues and organs.

Isolamento di microvascolare endoteliale tubi da arterie di resistenza mouse

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic ...

Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular mechanisms regulating vascular permeability in cultured endothelial cell monolayers and the functional exchange properties of whole microvascular beds. A method to cannulate and perfuse venular microvessels of rat mesentery and measure the hydraulic conductivity of the microvessel wall is described. The main equipment needed includes an intravital microscope with a large modified stage that supports micromanipulators to position three different microtools: (1) a beveled glass micropipette to cannulate and perfuse the microvessel; (2) a glass micro-occluder to transiently block perfusion and enable measurement of transvascular water flow movement at a measured hydrostatic pressure, and (3) a blunt glass rod to stabilize the mesenteric tissue at the site of cannulation. The modified Landis micro-occlusion technique uses red cells suspended in the artificial perfusate as markers of transvascular fluid movement, and also enables repeated measurements of these flows as experimental conditions are changed and hydrostatic and colloid osmotic pressure difference across the microvessels are carefully controlled. Measurements of hydraulic conductivity first using a control perfusate, then after re-cannulation of the same microvessel with the test perfusates enable paired comparisons of the microvessel response under these well-controlled conditions. Attempts to extend the method to microvessels in the mesentery of mice with genetic modifications expected to modify vascular permeability were severely limited because of the absence of long straight and unbranched microvessels in the mouse mesentery, but the recent availability of the rats with similar genetic modifications using the CRISPR/Cas9 technology is expected to open new areas of investigation where the methods described herein can be applied.

The modified Landis technique enables paired measurement of the hydraulic conductivity of individual microvessels in the mesentery of normal and genetically modified rats under control and test conditions using microperfusion techniques. It provides a convenient method to evaluate mechanisms that regulate microvessel permeability and transvascular exchange under physiological conditions.

Microperfusione Tecnica per Indagare regolamento di microvasi permeabilità a Rat mesentere

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular ...

Assessment of Vascular Tone Responsiveness using Isolated Mesenteric Arteries with a Focus on Modulation by Perivascular Adipose Tissues

Altered vascular tone responsiveness to pathophysiological stimuli contributes to the development of a wide range of cardiovascular and metabolic diseases. Endothelial dysfunction represents a major culprit for the reduced vasodilatation and enhanced vasoconstriction of arteries. Adipose (fat) tissues surrounding the arteries play important roles in the regulation of endothelium-dependent relaxation and/or contraction of the vascular smooth muscle cells. The cross-talks between the endothelium and perivascular adipose tissues can be assessed ex vivo using mounted blood vessels by a wire myography system. However, optimal settings should be established for arteries derived from animals of different species, ages, genetic backgrounds and/or pathophysiological conditions.

The protocol describes the use of wire myography to evaluate the transmural isometric tension of mesenteric arteries isolated from mice, with special consideration of the modulation by factors released from endothelial cells and perivascular adipose tissues.

Valutazione della reattività del tono vascolare utilizzando arterie mesenteriche isolate con un focus sulla modulazione dei tessuti adiposi perivascolare

Altered vascular tone responsiveness to pathophysiological stimuli contributes to the development of a wide range of cardiovascular and metabolic ...

<meta charset="utf8"></head><body>Protocollo per lo studio della dinamica gastrointestinale e degli effetti dei farmaci sulla motilità

Using An In Vitro Tissue Perfusion System to Detect the Functional Activities of Isolated Intestinal Tubes in Real Time

Gastrointestinal diseases, which have a high incidence, pose considerable challenges for humans. The small intestine is integral to food and drug digestion and absorption and plays a crucial role in treating these diseases. The intestinal tube movement experiment, a common and essential in vitro method, is utilized to study gastrointestinal dynamics. This includes the preparation of the isolated intestinal tube, as well as the suspension of the prepared intestinal tube in the bath and its connection to a signal detector. This is followed by the recording and analysis of a series of parameters, such as tension, which can be used to assess intestinal motor function, as well as considerations for keeping the intestinal tube active in vitro. The standardized program from sampling to data collection greatly improves the repeatability of the experimental data and ensures the authenticity of the recording of intestinal tension after physiological, pathological, and drug intervention. Here we present the key problems in experimental operation and a valuable reference experimental protocol for studying drugs that regulate gastrointestinal motility.

<meta charset="utf8"></head><body>Autore in primo piano: Valutazione in vitro affidabile e riproducibile dell'impatto dei farmaci sui tubi intestinali di ratto

We present a method for isolating rat intestinal tubes and assessing the impact of drugs on their tension, frequency, and amplitude in vitro. This method offers a valuable approach for researchers investigating intestinal tubes.