Name: a small volume procedure for viral concentration from water
Uploaded: 2015-02-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Small Volume Procedure for Viral Concentration from Water at JoVE.com

We would like to thank Dr. Nicholas J. Ashbolt and Dr. G. Shay Fout for their review of the manuscript.

1. Preparazione di cristalleria e Filter Contenitori <ol style="margin-left: 40px;"><li> Se non diversamente specificato, sterilizzare tutti i bicchieri, contenitori e soluzioni di filtro a 121 ° C per 15 minuti. Per garantire la sterilità, coprire tutte le aperture o le superfici esposte sia con fogli di alluminio o di carta nastro fissato prima della sterilizzazione. </li><li> Montare apparato di filtrazione allegando alloggiamento del filtro (diametro di 47 mm) a 1 L braccio laterale beuta. Raccogliere filtri necessari: 47 mm di diametro filtri a disco elettropositivi / electronegative. </li><li> Preparare 1 L di estratto di carne bovina 1,5% (flocculanti; produce particelle Floc quando pH della soluzione si abbassa a 3,5, o non flocculante, che non fa aggregato a pH 3,5), con 0,05 M glicina, sciogliendo 15 g di estratto di carne bovina in 1 L di acqua deionizzata e l&#39;aggiunta di 3,75 g di glicina. NOTA: estratti di carne non floccaggio richiedono l&#39;aggiunta di celite prima concentrazione terziaria. </li><li> Aggiungi eluizione polyph additivo sodioosphate di estratto di carne bovina ad una concentrazione di 0,1%. </li><li> Aggiungere 1 soluzione di acido cloridrico M, gocciolamento, di miscelazione estratto di carne, pH della soluzione a pH desiderato. Estratto di carne bovina Autoclave per 15-30 minuti a 121 ° C. </li><li> Misura 0,1 g di fine, media, o grande celite particelle (per l&#39;utilizzo con estratto di carne non-flocculanti solo). </li><li> Preparare vuoto / aspirazione collegando tubazioni compatibile beuta braccio laterale e alla presa di vuoto. </li></ol> 2. preparazione di soluzioni e virus Stock <ol style="margin-left: 40px;"><li> Preparare 1 L di 1 M HCl. </li><li> Preparare 1 L di 1 M NaOH. </li><li> Preparare la soluzione PBS 1x (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1.47 mm K 2 PO 4 e 4,3 mm NaH 2 PO 4). <ol><li> Regolare il pH di 1x PBS a 9,0 con 1 M NaOH. </li></ol></li><li> Preparare e diluire magazzino virus per 10 4 -10 5 numero più probabile (MPN) ml -1 mescolando 1 ml di virus con 9 ml di PBS (pH7), come precedentemente descritto 8,13. Conservare a -80 ° C in aliquote di 1 ml. <ol><li> Sterilizzare virus magazzino filtrando siringa (0,22 micron dimensione dei pori) per rimuovere potenziali contaminanti. </li></ol></li><li> Declorata Tap Water <ol><li> Misura 1 L di acqua di rubinetto sterile utilizzando una sterile cilindro graduato e versare in un bicchiere contenente 2 L ancoretta magnetica. </li><li> Aggiungere 0,7 g di tiosolfato di sodio e mescolare fino a granuli si dissolvono. Regolare il pH dell&#39;acqua di rubinetto a 7-7,5 se necessario con 1 M HCl o soluzione 1 M NaOH. </li><li> Spike virus Thaw (1 ml) e aggiungere intero volume di picco per 1 L di acqua di rubinetto sterili senza cloro. Mescolare per 10 min. </li><li> Preparare un metodo vuoto (acqua di rubinetto declorurata senza adenovirus) con ogni esperimento e processo nello stesso modo come il campione spillo. </li></ol></li></ol> 3. Preparazione di Millipore Filtro Apparatus <ol style="margin-left: 40px;"><li> Rimuovere copertura sterile su filtro. Garantirela misura adeguata tra il corpo del filtro ciotola superiore e schermo del filtro inferiore per evitare perdite campione durante la filtrazione. </li><li> Rimuovere copertura sterile dal 1 boccetta L Erlenmeyer. Assicurarsi che il tappo del gruppo filtrante adatta comodamente in cima apertura beuta, creando una buona tenuta. </li><li> Rimuovere ciotola superiore dell&#39;unità filtrante dallo schermo del filtro inferiore e portare 47 millimetri disco filtro elettropositivo esattamente sopra lo schermo con una pinza sterile. Attaccare il filtro ciotola alloggi a schermo inferiore e bloccare in posizione ruotando in senso antiorario. </li></ol> 4. Toccare filtrazione dell&#39;acqua (concentrazione primaria) <ol style="margin-left: 40px;"><li> Misurare 100 ml di virus a spillo l&#39;acqua del rubinetto con sterile cilindro graduato. </li><li> Versare 100 ml di virus spillo l&#39;acqua del rubinetto in scatola del filtro contenente sia un / filtri di cellulosa 47 millimetri di vetro pieghettata o un filtro rigido in fibra di nano-allumina / vetro. </li><li> Consentire all&#39;acqua di passare lentamente attraverso il filtro. Applicare delicato vuoto per rimuovere residui residui oacqua di rubinetto f dalla superficie del filtro. </li><li> Se si utilizza il trattamento tripsina, aggiungere 5 ml di 0,25% tripsina per filtrare la superficie e incubare per 5 min. </li><li> Lavare tripsina dalla superficie del filtro con 50 ml di acqua deionizzata sterile. </li></ol> 5. Virus eluizione da filtro <ol style="margin-left: 40px;"><li> Smontare la scatola del filtro da 2 fiasco L Erlenmeyer, e posizionarlo sul pallone da 250 ml braccio laterale. </li><li> Misurare 100 ml di estratto di carne utilizzando cilindro graduato. Versare lentamente 100 ml di estratto di carne in scatola del filtro. </li><li> Lasciare estratto di carne bovina per versare attraverso il filtro, catturando estratto di carne in un piccolo (250 ml) beuta. Applicare il vuoto per tirare attraverso estratto di carne residuo dal filtro. </li></ol> 6. Celite Concentrazione secondaria <ol style="margin-left: 40px;"><li> Flaconi di trasferimento contengono i virus eluiti ad una piastra scalpore. Aggiungere sterile ancoretta magnetica e posto sul piatto mescolare, mescolare per creare una leggera vortice. </li><li> Aggiungere 0,1 g di celitepolvere 100 ml di estratto di carne e consentire celite per disperdere. Posizionare la sonda pH sterile in estratto di carne. </li><li> Aggiungere goccia a goccia 1 M HCl per estratto di carne per raggiungere pH 4,0. Lasciare miscelare lentamente per 10 min. </li><li> Mettere 47 millimetri di pre-filtro sul corpo del filtro (come descritto in precedenza) con un pallone 2 L Erlenmeyer. </li><li> Versare 100 ml di estratto di manzo / miscela celite over pre-filtro. Lasciare estratto di carne bovina per versare attraverso. Applicare leggero vuoto per tirare attraverso estratto di carne residuo dal filtro. </li><li> Posizionare la clip tubo metallico sulla fine del becco filtro. Attaccare sterile 15 ml tubo di raccolta in polipropilene a clip di tubo di metallo. Posizionare la scatola del filtro di nuovo in beuta. </li><li> Aggiungere 5 ml di tampone 1x PBS, pH 9.0 su celite raccolte sul pre-filtro. </li><li> Lasciare PBS goccioli attraverso pre-filtro. Applicare leggero vuoto per tirare attraverso residuo PBS in 15 ml tubo di raccolta. </li></ol> 7. Flocculazione Organic Concentrazione secondaria <ol style="margin-left: 40px;"><li>Trasferire i bicchieri contenenti il ​​virus eluito a un piatto mescolare. Aggiungere sterile ancoretta magnetica a 100 ml di estratto di carne e mescolare per creare una leggera vortice. </li><li> Posizionare la sonda pH sterile in estratto di carne. </li><li> Aggiungere 1 M HCl goccia saggio estratto di carne e aggiustare il pH a 3,5. Mescolare per 30 min. </li><li> Versare l&#39;eluato in 250 ml provette coniche e centrifugare a 2500 xg per 15 minuti a 4 ° C. </li><li> Eliminare il surnatante facendo attenzione a non a non disturbare il pellet. Risospendere il pellet in 5 ml di PBS 1x, pH 9. </li><li> Centrifugare la sospensione a 4.000 xg per 10 minuti a 4 ° C. Eliminare il surnatante e scartare il pellet. </li><li> Regolare il pH a 7-7.5, filtrare sterilizzare attraverso 0,22 micron filtro siringa e congelamento a -80 ° C. </li></ol> 8. Viral Nucleic Acid Extraction <ol style="margin-left: 40px;"><li> Estrarre gli acidi nucleici virali utilizzando un kit commerciale adeguata secondo le istruzioni del produttore. </li></ol> &lt;p class = &quot;jove_title&quot;&gt; 9. AdV 40/41 qPCR <ol style="margin-left: 40px;"><li> Utilizzare primer e sonde, nonché miscela di reazione e profili cicli termici come pubblicato 8,13. NOTA: limite stimato di rilevamento per il dosaggio è di circa 5 unità qPCR per reazione. </li><li> Aggiungere componenti di miscele di amplificazione PCR a concentrazioni come segue: Tris 10 mM (pH 8,3), 50 mM KCl, 4,5 mM MgCl 2, 10 mM dNTPs, 10 mM primer e della sonda 1 mM e 0,5 ml di polimerasi in modo che i volumi finali di 45 microlitri può essere aggiunto al numero appropriato di pozzetti in una piastra di reazione PCR da 96 pozzetti. </li><li> Carico 45 ml di miscela di amplificazione PCR per ciascun pozzetto appropriata di un pozzo 96, reazione veloce PCR piastra. </li><li> Aggiungere 5 ml di DNA estratto campione adeguati pozzetti della piastra PCR. </li><li> Coprire piastra con calore guarnizione del coperchio resistente, girare la piastra per spostare eventuali gocce di fondo dei pozzetti della piastra PCR. </li><li> Impostare PCR cicli di amplificazione come follOWS: 95 ° C per 10 minuti, seguiti da 40 cicli di 95 ° C per 15 sec e 60 ° C per 1 min. </li></ol> 10. Analisi dei dati <ol style="margin-left: 40px;"><li> Analizzare misurazioni in triplicato delle diluizioni seriali 5-fold dei campioni abbracciano 1: 5 a 1: 625 gamma di diluizione per determinare il numero più probabile (MPN) delle particelle virali, come precedentemente descritto 8,13. </li><li> Analizzare diluizioni seriali 5-fold di picchi sperimentali adenovirus abbracciano 1: 5 a 1: 15.625 serie di diluizione per determinare il numero più probabile (MPN) delle particelle virali. </li><li> Utilizzando la calcolatrice EPA MPN (http://www.epa.gov/nerlcwww/online.html), regolare la calcolatrice per spiegare il tipo di diluizione (1: 5 o 1:10), il numero di diluizioni effettuate, e il numero di replicare campioni in serie di diluizioni. </li><li> Eseguire log 10 trasformazione dei dati, seguiti normalizzando ad una unità di volume (ad esempio, 1 ml, 100 ml, etc. </em&gt;). Calcola recuperi per dato esperimento dividendo il numero di particelle virali presenti nel campione concentrati con il numero di particelle virali presenti in picchi sperimentali. </li><li> Valutare l&#39;effetto delle diverse variabili sperimentali (ad esempio, diversi tipi Celite, intervalli di pH, diversi tipi di filtro e diverse tecniche di concentrazione secondari) sui recuperi Adv eseguendo test statistici parametrici e non parametrici (es paired t-test, uno o due -way ANOVA) a seconda della distribuzione dei dati e il disegno sperimentale. </li></ol>

<ol>
	<li>Sinclair, R. G., Jones, E. L., Gerba, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viruses+in+recreational+water-borne+disease+outbreaks:+a+review.">Viruses in recreational water-borne disease outbreaks: a review.</a> Journal of Applied Microbiology. 107, 1769-1780 (2009).</li><li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guidelines for Safe Recreational Water Environments. , (2003).</li><li>Westrell, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Norovirus+outbreaks+linked+to+oyster+consumption+in+the+United+Kingdom.">Norovirus outbreaks linked to oyster consumption in the United Kingdom.</a> Euro Surveillance : Bulletin Europeen Sur les Maladies Transmissibles = European Communicable Disease Bulletin. 15, (2010).</li><li>Wong, K., Fong, T. T., Bibby, K., Molina, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+enteric+viruses+for+fecal+pollution+source+tracking+in+environmental+waters.">Application of enteric viruses for fecal pollution source tracking in environmental waters.</a> Environment International. 45, 151-164 (2012).</li><li>Cashdollar, J. L., Wymer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+primary+concentration+of+viruses+from+water+samples:+a+review+and+meta-analysis+of+recent+studies.">Methods for primary concentration of viruses from water samples: a review and meta-analysis of recent studies.</a> Journal of Applied Microbiology. 115, 1-11 (2013).</li><li>Ikner, L. A., Soto-Beltran, M., Bright, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+method+using+a+positively+charged+microporous+filter+and+ultrafiltration+for+concentration+of+viruses+from+tap+water.">New method using a positively charged microporous filter and ultrafiltration for concentration of viruses from tap water.</a> Applied and Environmental Microbiology. 77, 3500-3506 (2011).</li><li>Karim, M. R., Rhodes, E. R., Brinkman, N., Wymer, L., Fout, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+electropositive+filter+for+concentrating+enteroviruses+and+noroviruses+from+large+volumes+of+water.">New electropositive filter for concentrating enteroviruses and noroviruses from large volumes of water.</a> Applied and Environmental Microbiology. 75, 2393-2399 (2009).</li><li>McMinn, B. R., Cashdollar, J. L., Grimm, A. C., Fout, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+celite+secondary+concentration+procedure+and+an+alternate+elution+buffer+for+the+recovery+of+enteric+adenoviruses+40+and+41.">Evaluation of the celite secondary concentration procedure and an alternate elution buffer for the recovery of enteric adenoviruses 40 and 41.</a> Journal of Virological Methods. 179, 423-428 (2012).</li><li>Katzenelson, E., Fattal, B., Hostovesky, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organic+flocculation:+an+efficient+second-step+concentration+method+for+the+detection+of+viruses+in+tap+water.">Organic flocculation: an efficient second-step concentration method for the detection of viruses in tap water.</a> Applied and Environmental Microbiology. 32, 638-639 (1976).</li><li>Fout, G. S., Schaefer, F. W., Messer, J. W., Dahling, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> ICR microbial laboratory manual. 178, (1996).</li><li>Calgua, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+application+of+a+one-step+low+cost+procedure+to+concentrate+viruses+from+seawater+samples.">Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples.</a> Journal of Virological Methods. 153, 79-83 (2008).</li><li>Calgua, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+quantification+of+classic+and+emerging+viruses+by+skimmed-milk+flocculation+and+PCR+in+river+water+from+two+geographical+areas.">Detection and quantification of classic and emerging viruses by skimmed-milk flocculation and PCR in river water from two geographical areas.</a> Water Research. 47, 2797-2810 (2013).</li><li>McMinn, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+adenovirus+40+and+41+recovery+from+tap+water+using+small+disk+filters.">Optimization of adenovirus 40 and 41 recovery from tap water using small disk filters.</a> Journal of Virological Methods. 193 (2), 284-290 (2013).</li><li>Brinkman, N. E., Haffler, T. D., Cashdollar, J. L., Rhodes, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+methods+using+celite+to+concentrate+norovirus,+adenovirus+and+enterovirus+from+wastewater.">Evaluation of methods using celite to concentrate norovirus, adenovirus and enterovirus from wastewater.</a> Journal of Virological Methods. 193, 140-146 (2013).</li><li>Albinsson, B., Kidd, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus+type+41+lacks+an+RGD+alpha(v)-integrin+binding+motif+on+the+penton+base+and+undergoes+delayed+uptake+in+A549+cells.">Adenovirus type 41 lacks an RGD alpha(v)-integrin binding motif on the penton base and undergoes delayed uptake in A549 cells.</a> Virus Research. 64, 125-136 (1999).</li><li>He, C., Lian, J. S., Jiang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electronic+structures+and+hydrogen+bond+network+of+high-density+and+very+high-density+amorphous+ices.">Electronic structures and hydrogen bond network of high-density and very high-density amorphous ices.</a> The Journal of Physical Chemistry. B. 109, 19893-19896 (2005).</li><li>Sedmak, G., Bina, D., Macdonald, J., Couillard, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nine-year+study+of+the+occurrence+of+culturable+viruses+in+source+water+for+two+drinking+water+treatment+plants+and+the+influent+and+effluent+of+a+Wastewater+Treatment+Plant+in+Milwaukee,+Wisconsin.">Nine-year study of the occurrence of culturable viruses in source water for two drinking water treatment plants and the influent and effluent of a Wastewater Treatment Plant in Milwaukee, Wisconsin.</a> 71, 1042-1050 (2005).</li><li>Soto-Beltran, M., Ikner, L. A., Bright, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+of+poliovirus+concentration+and+recovery+from+treated+wastewater+by+two+electropositive+filter+methods.">Effectiveness of poliovirus concentration and recovery from treated wastewater by two electropositive filter methods.</a> Food and Environmental Virology. 5, 91-96 (2013).</li><li>Haramoto, E., Katayama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+acidic+elution+to+virus+concentration+using+electropositive+filters.">Application of acidic elution to virus concentration using electropositive filters.</a> Food and Environmental Virology. 5, 77-80 (2013).</li><li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+electropositive+filtration+for+recovering+norovirus+in+water.">Evaluation of electropositive filtration for recovering norovirus in water.</a> Journal of Water and Health. 9, 27-36 (2011).</li><li>Gibbons, C. D., Rodriguez, R. A., Tallon, L., Sobsey, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+positively+charged+alumina+nanofibre+cartridge+filters+for+the+primary+concentration+of+noroviruses,+adenoviruses+and+male-specific+coliphages+from+seawater.">Evaluation of positively charged alumina nanofibre cartridge filters for the primary concentration of noroviruses, adenoviruses and male-specific coliphages from seawater.</a> Journal of Applied Microbiology. 109, 635-641 (2010).</li><li>Hill, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+rapid+method+for+simultaneous+recovery+of+diverse+microbes+in+drinking+water+by+ultrafiltration+with+sodium+polyphosphate+and+surfactants.">Development of a rapid method for simultaneous recovery of diverse microbes in drinking water by ultrafiltration with sodium polyphosphate and surfactants.</a> Applied and Environmental Microbiology. 71, 6878-6884 (2005).</li><li>Polaczyk, A. L., Roberts, J. M., Hill, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+1MDS+electropositive+microfilters+for+simultaneous+recovery+of+multiple+microbe+classes+from+tap+water.">Evaluation of 1MDS electropositive microfilters for simultaneous recovery of multiple microbe classes from tap water.</a> Journal of Microbiological Methods. 68, 260-266 (2007).</li><li>Rhodes, E. R., Hamilton, D. W., See, M. J., Wymer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+hollow-fiber+ultrafiltration+primary+concentration+of+pathogens+and+secondary+concentration+of+viruses+from+water.">Evaluation of hollow-fiber ultrafiltration primary concentration of pathogens and secondary concentration of viruses from water.</a> Journal of Virological Methods. 176, 38-45 (2011).</li><li>Melnick, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Round+robin+investigation+of+methods+for+the+recovery+of+poliovirus+from+drinking+water.">Round robin investigation of methods for the recovery of poliovirus from drinking water.</a> Applied and Environmental Microbiology. 47, 144-150 (1984).</li><li>Schwab, K. J., De Leon, R., Sobsey, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concentration+and+purification+of+beef+extract+mock+eluates+from+water+samples+for+the+detection+of+enteroviruses,+hepatitis+A+virus,+and+Norwalk+virus+by+reverse+transcription-PCR.">Concentration and purification of beef extract mock eluates from water samples for the detection of enteroviruses, hepatitis A virus, and Norwalk virus by reverse transcription-PCR.</a> Applied and Environmental Microbiology. 61, 531-537 (1995).</li></ol>

No competing financial interests. 
The views expressed in this article are those of the authors and do not necessarily reflect the views or policies of the U.S. Environmental Protection Agency. Mention of trade names or commercial products does not constitute endorsement or recommendation for use.

Filtri electropositive sono utili nella concentrazione virus dall&#39;acqua; Tuttavia questi filtri possono differire nella loro struttura e composizione che potrebbe a sua volta alterare la loro efficacia. Ad aggravare questo problema, le strutture e le spese del capside variano tra i ceppi virali che richiedono tecniche di concentrazione essere adattati per garantire il recupero ottimale 15. Attraverso semplici modifiche delle tecniche di concentrazione esistenti (ad esempio, filtri elettropositivi, manzo estratto eluizione), la concentrazione più efficace di virus di destinazione possono essere raggiunti 16,17. La ricerca fino ad oggi si è tipicamente concentrata sul recupero di virus modificando concentrazione primaria (filtri) passi, ma poca attenzione è stata data alle procedure successiva concentrazione che potrebbe anche influenzare il recupero virus 18. È stato dimostrato che diverse tecniche di concentrazione secondarie possono influenzare recuperi virus 6,13,19,20. Celiconcentrazione te è stato dimostrato per recuperare livelli simili di virus a quella di altri metodi di concentrazione secondari 8,14 da una varietà di matrici, utilizzando semplici procedure di elaborazione del campione più veloce e. A causa variando strutture capside esterno, alcuni virus possono diventare fisicamente intrappolati all&#39;interno della matrice del filtro 21, che richiede la valutazione di diversi additivi per filtrare protocolli di eluizione. Ad esempio, l&#39;aggiunta di tensioattivo, polifosfato di sodio migliorato sia il recupero batteriche e virali durante la concentrazione primaria 6,13,22-24. D&#39;altra parte, i recuperi bassi osservati dopo aggiunta di tripsina indicano che le proteasi non aiuto nella scissione delle fibre proteiche sul capside virale esterno. Inoltre, pur non infrequente 7,25,26, è da notare che alcuni dei nostri recuperi erano superiore al 100%. Come precedentemente indicato 7,25,26, questo è probabilmente dovuto al aggregazione del laboratorio preparati virus usato come picco. Il piccolo volume (100 ml virus spillo acqua) approccio concentrazione presentato può essere un modo pratico per sviluppare e ottimizzare i metodi di concentrazione di virus, grazie alla sua semplicità e basso consumo di risorse insieme con il tempo di elaborazione del campione veloce. L&#39;uso di tali piccoli volumi di acqua, la concentrazione di inibitori della PCR nel campione è anche minimizzato, ma si raccomanda che ciascuna acqua fonte valutato per la presenza di inibitori della PCR prima sperimentazione. Poiché esistono numerose scelte di entrambi i filtri e le tecniche di concentrazione secondarie, tecniche di concentrazione del volume piccoli consentono rapide valutazioni di numerose variabili. Si spera che queste tecniche possono essere utilizzati prima che la sperimentazione su larga scala di filtrazione per aiutare a identificare quali condizioni sono ottimali per la concentrazione di virus bersaglio per date matrici acqua.

Virus enterici umani sono importanti agenti eziologici di malattie trasmesse dall&#39;acqua 1-3, ma sono generalmente presenti in numero ridotto nelle acque ambientali contaminate, rendendo la loro individuazione difficile senza concentrazione. Le procedure utilizzate per concentrare virus includono tipicamente una fase di filtrazione, seguita da filtro eluizione, e concentrazione secondaria dell&#39;eluato filtro. Una procedura di filtrazione comune si basa sull&#39;uso di membrane cariche quali filtri elettropositivi (recentemente recensito in 4,5). Questi filtri si basano sulla cattura virus sospese in acqua utilizzando interazioni elettrostatiche tra la superficie del filtro (carica positiva) e particelle di virus mirati (carica negativa). Due filtri elettropositivi che sono commercialmente disponibili si basano su questa tecnologia, i filtri di vetro / cellulosa e nano-allumina / fibra di vetro. I costi filtro di vetro / cellulosa sono fino a 10 volte quella del nano-allumina / fibra di vetro, che limitano l&#39;uso del vetro / ceFiltri llulose per il monitoraggio virus di routine. Recenti studi hanno concluso differenze sono nominali tra questi due filtri in recupero di enterovirus da 6,7 all&#39;acqua ambiente, giustificare l&#39;uso di una più economica alternativa filtro. Altre opzioni di filtro come filtri elettronegativi e lana di vetro sono stati studiati, tuttavia, richiedono sia il pretrattamento dell&#39;acqua di fonte (filtri elettronegativi) o non sono disponibili in commercio (filtri di lana di vetro). Lo sviluppo di procedure di concentrazione del virus si è prevalentemente concentrata sull&#39;ottimizzazione tecniche di concentrazione primari (filtri) al fine di migliorare i recuperi virus dall&#39;acqua. Tuttavia, le procedure di concentrazione secondarie, che riducono il volume di eluente tipicamente da 1 L a millilitro volumi, possono anche avere un impatto significativo sui recuperi virus 8. Concentrazione media di virus enterici basa tipicamente su un agente flocculante come alcuni tipi di estratto di carne (floccu organicamento) o il latte scremato flocculazione 9-12 per rimuovere particelle di virus da superfici filtranti. Recentemente, un&#39;altra procedura concentrazione secondaria con estratto di carne insieme con l&#39;aggiunta di celite (particelle fini) ha mostrato risultati promettenti per il recupero adenovirus, enterovirus e norovirus 8,13,14. Opere concentrazione Celite sotto principi simili a quella del metodo di flocculazione organica che particelle virali connettono e vengono rilasciate da particelle (floc o celite) alterando il pH della soluzione di sospensione. Il confronto tra queste due tecniche di concentrazione secondari sono stati valutati nel recupero di adenovirus spillo (ADV) i tipi 40 e 41 8. Questo studio ha concluso che le due tecniche di concentrazione secondari erano statisticamente simili nel recupero di adenovirus. Tuttavia, il metodo richiede una flocculazione organica 30 min. incubazione a pH 3,5, mentre la tecnica celite richiede una breve incubazione (10 min) a pH 4.0. Il flocculat organicaion richiede anche l&#39;uso di costose attrezzature di laboratorio (centrifughe) per raccogliere particelle Floc momento della concentrazione terziaria, la tecnica celite in contrasto utilizza solo attrezzature di laboratorio di base (filtrazione sotto vuoto) per separare particelle Celite da sospensione. Alcune combinazioni di filtri e tecniche di eluizione secondaria può colpire anche i recuperi di virus. Uno studio ha concluso che alcune combinazioni di primari (filtri elettropositivi) e tecniche di concentrazione secondari (Celite o flocculazione organica) hanno avuto un impatto significativo recupero di adenovirus 13. Questi risultati suggeriscono che l&#39;ottimizzazione è necessaria al fine di recuperare in modo ottimale virus bersaglio da una data matrice acqua quando utilizzando queste tecniche. L&#39;ottimizzazione è un dispendio di tempo, di processo arduo molti ricercatori evitare attivamente poiché numerose variabili saranno valutati (tipo di filtro / marca, soluzione di eluizione pH, celite / flocculazione organica). Per questo study, una procedura è stata sviluppata per individuare le condizioni ottimali per la concentrazione del virus da acqua utilizzando spillo adenovirus umano ceppi 40 e 41. Presumibilmente, dal momento che ogni tipo di virus visualizza una morfologia capside unica e carica capside specifico, possono avere bisogno di essere ottimizzato per ogni virus protocolli di concentrazione obiettivo per raggiungere il recupero virale ottimale. Questo studio fornisce un approccio per AdV 40 e 41 concentrazione mediante: 1) valutare recuperi virus in acqua di rubinetto utilizzando dischi filtranti elettropositivi seguiti da 2) valutazione di un metodo di flocculazione organica stabilita rispetto alla tecnica celite come concentrazione secondaria, e 3) valutazione buffer di eluizione per la concentrazione terziaria.

<table><tbody><tr><td>Adenovirus 40 stock</td><td>ATCC</td><td>VR-931</td><td></td></tr><tr><td>Adenovirus 41 stock</td><td>ATCC</td><td>VR-930</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Thiosulfate</td><td>Fluka Chemical Co.</td><td>72051</td><td></td></tr><tr><td>Celites #577</td><td>Fluka Chemical Co.</td><td>22142</td><td></td></tr><tr><td>NanoCeram 47 mm</td><td>Argonide</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>1MDS 47 mm</td><td>3M</td><td>6408502</td><td></td></tr><tr><td>AP-20 Prefilter 47 mm</td><td>Millipore Corp.</td><td>AP2004700</td><td></td></tr><tr><td>Glycine&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>50046-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Polyphosphate</td><td>Acros Organics</td><td>390930010</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Gibco</td><td>25200</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma</td><td>P5368</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric Acid</td><td>Fisher</td><td>A481-212</td><td></td></tr><tr><td>BBL Beef Extract</td><td>BD Biosciences</td><td>212303</td><td></td></tr><tr><td>Difco Beef Extract</td><td>BD Biosciences</td><td>211520</td><td></td></tr><tr><td>ABI 7900 Real-time PCR system</td><td>ABI</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Stainless Steel Filter Housing</td><td>Millipore Corp.</td><td>XX2004720</td><td></td></tr><tr><td>Blood DNA Extraction Kit</td><td>Qiagen&amp;nbsp;</td><td>51104</td><td></td></tr><tr><td>EPA MPN Calculator</td><td></td><td></td><td>http://www.epa.gov/nerlcwww/online.html</td></tr></tbody></table>

a small volume procedure for viral concentration from water

Small-scale concentration of viruses (sample volumes 1-10 L, here simulated with spiked 100 ml water samples) is an efficient, cost-effective way to identify optimal parameters for virus concentration. Viruses can be concentrated from water using filtration (electropositive, electronegative, glass wool or size exclusion), followed by secondary concentration with beef extract to release viruses from filter surfaces, and finally tertiary concentration resulting in a 5-30 ml volume virus concentrate. In order to identify optimal concentration procedures, two different electropositive filters were evaluated (a glass/cellulose filter [1MDS] and a nano-alumina/glass filter [NanoCeram]), as well as different secondary concentration techniques; the celite technique where three different celite particle sizes were evaluated (fine, medium and large) followed by comparing this technique with that of the established organic flocculation method. Various elution additives were also evaluated for their ability to enhance the release of adenovirus (AdV) particles from filter surfaces. Fine particle celite recovered similar levels of AdV40 and 41 to that of the established organic flocculation method when viral spikes were added during secondary concentration. The glass/cellulose filter recovered higher levels of both, AdV40 and 41, compared to that of a nano-alumina/glass fiber filter. Although not statistically significant, the addition of 0.1% sodium polyphosphate amended beef extract eluant recovered 10% more AdV particles compared to unamended beef extract.

<html> Selezione Celite Tre diversi tipi di celite stati testati prima della selezione della variante migliore performante. Celites con ammenda di particelle di medie dimensioni realizzati i più alti recuperi adenovirus. L&#39;uso di grandi celites comportato recuperi inferiori sia AdV40 e 41 (range 32% -100%) (Figura 1). Recuperi medi di adenovirus 40 erano 144% ± 52% (fine), 115% ± 28% (medio) e il 82% ± 53% celites (grande) di particelle e per AdV41, 132% ± 39% (fine), 83% ± 25% (medio) e 50% ± 11% (grande). Un ANOVA indicata la tecnica celite ottimizzato recuperato livelli statisticamente simili di AdV40 (P = 0,7920) e 41 (P = 0,1439) a quella del metodo di flocculazione organica, che recupera il 75% ± 19% e 109% ± 16%, rispettivamente, . La Figura 1 illustra le differenze tra le tecniche di concentrazione secondarie e tra tipi Adv. _content &quot;&gt; valutazione Tipo di filtro Un centinaio di volumi millilitro di acqua di rubinetto virus-spillo erano concentrate utilizzando un pieghe di vetro / cellulosa o di nano-allumina / vetro filtro disco fibre e sono stati elaborati utilizzando il Celite o metodo di flocculazione biologico. I filtri sono stati eluiti con estratti di carne a pH 7,5, 9,0, 9,5, 10, 11 e 12 per determinare quale sarebbe più efficace in eluendo particelle adv dai filtri. Il filtro di vetro / cellulosa accoppiato con estratto di carne a pH 10 e celite, prodotto i recuperi elevati (da qPCR / MPN) per AdV40 (52% ± 22%) e AdV41 (64% ± 4%), che sono mostrati nelle figure 2 e 3. Manzo estratto pH 10 recuperato AdV41 significativamente più elevati di tutti gli altri valori di pH (range valore P: ,0045-0,041), mentre AdV40 seguito un simile, anche se di tendenza po &#39;più debole (campo di valori P: 0,025-0,042). Un filtro di vetro / cellulosa è stata valutata anche in combinazione con il flocculatio organicaMetodo n. Per AdV40, recuperi significativamente più elevati sono stati ottenuti utilizzando estratto di carne pH 10 (40% ± 10%) (campo di valori P: 0,010-0,027), e per AdV41, sia pH 9,5 e 10 hanno superato tutti gli altri estratto di carne pH testato (campo di valori P : 0,023-0,027) (figure 2 e 3). Nel complesso, la tecnica celite con estratto di carne pH 10 è risultata essere superiore al metodo flocculazione organica confronti diretti per il recupero di entrambi i ceppi Adv. Ottimizzazioni degli additivi estratto di carne Il metodo ottimizzato (vetro / filtro di cellulosa con estratto di carne pH 10 accoppiato con celite concentrazione secondaria) è stato confrontato con altri due trattamenti: 1) aggiunta di 0,25% tripsina e 2) che completa l&#39;estratto di carne con 0,1% sodio polifosfato. L&#39;aggiunta di tripsina non sembra migliorare il recupero di AdV come solo il 16% ± 6% e 24% ± 14% di AdV40 e 41 ingressi, rispettivamente, sono stati recuperati (&lt;<html> strong&gt; Figura 4). Estratto di carne integrato con 0,1% di sodio polifosfato prodotto massimi recuperi di AdV40 e 41 rispetto a quella del precedente metodo ottimizzato. Recupero AdV40 sembra aumentare del 13%, e il recupero AdV41 aumentato del 7% rispetto al metodo precedente, ma non era statisticamente significativa (valore di P: 0.146). Uso di percentuali elevate di polifosfato di sodio 1%, 3% e 5% (dati non mostrati) è risultata inefficace, richiedono grandi quantità di acido per regolare il pH di queste soluzioni a 4,0 durante la concentrazione secondaria. <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51744/51744fig1highres.jpg" width="600" /> Figura 1: Percentuale di recupero AdV-40 e adv-41 basato su tecnica di concentrazione secondaria (Celite rispetto floc biologici) e il tipo di Celite utilizzato. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard (n = 3) 8. <html> &quot;Fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figura 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51744/51744fig2highres.jpg" width="600" /> Figura 2: recupero Percentuale di AdV-40 utilizzando due tipi di tecniche di concentrazione secondari (Celite e Floc organica) e due tipi di filtri (vetro / cellulosa e Nano-allumina / vetro) a diversi livelli di pH di estratto di carne. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard (n = 3) 13. <img alt="Figura 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51744/51744fig3highres.jpg" width="600" /> Figura 3: recupero Percentuale di AdV-41 utilizzando due tipi di tecniche di concentrazione secondari (Celite e Floc organica) e due tipi di filtri (vetro / cellulosa e Nano-allumina / vetro) a diversi livelli di pH di estratto di carne. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard (n = 3) 13. &quot;&gt; <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51744/51744fig4highres.jpg" width="600" /> Figura 4: L&#39;effetto degli additivi eluizione sul recupero della AdV 40 e 41 AdV concentrata usando Celite come tecnica di concentrazione secondaria e vetro / cellulosa. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard (n = 3) 13.

Watch this Scientific Journal Video about A Small Volume Procedure for Viral Concentration from Water at JoVE.com

A Small Volume Procedure for Viral Concentration from Water

An approach was developed for identifying optimal viral concentration conditions for small volume water samples using spikes of human adenovirus. The techniques described here are used to identify concentration parameters for other viral targets, and applied to large-scale viral concentration experimentation.

A Procedura piccolo volume per concentrazione virale da Water

Small-scale concentration of viruses (sample volumes 1-10 L, here simulated with spiked 100 ml water samples) is an efficient, cost-effective way to ...

a-small-volume-procedure-for-viral-concentration-from-water

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Environment

10.0K Views.  U.S. EPA. An approach was developed for identifying optimal viral concentration conditions for small volume water samples using spikes of human adenovirus. The techniques described here are used to identify concentration parameters for other viral targets, and applied to large-scale viral concentration experimentation. 

Video: A Small Volume Procedure for Viral Concentration from Water

Estimating Virus Production Rates in Aquatic Systems

Viruses are pervasive components of marine and freshwater systems, and are known to be significant agents of microbial mortality. Developing quantitative estimates of this process is critical as we can then develop better models of microbial community structure and function as well as advance our understanding of how viruses work to alter aquatic biogeochemical cycles. The virus reduction technique allows researchers to estimate the rate at which virus particles are released from the endemic microbial community. In brief, the abundance of free (extracellular) viruses is reduced in a sample while the microbial community is maintained at near ambient concentration. The microbial community is then incubated in the absence of free viruses and the rate at which viruses reoccur in the sample (through the lysis of already infected members of the community) can be quantified by epifluorescence microscopy or, in the case of specific viruses, quantitative PCR. These rates can then be used to estimate the rate of microbial mortality due to virus-mediated cell lysis.

The turnover rate of viruses in marine and freshwater systems can be estimated by a reduction and reoccurrence technique. The data allow researchers to infer rates of virus-mediated microbial mortality in aquatic systems.

Stimare i tassi di produzione del virus nei sistemi acquatici

Viruses are pervasive components of marine and freshwater systems, and are known to be significant agents of microbial mortality. Developing quantitative ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Unraveling the Unseen Players in the Ocean - A Field Guide to Water Chemistry and Marine Microbiology

Here we introduce a series of thoroughly tested and well standardized research protocols adapted for use in remote marine environments. The sampling protocols include the assessment of resources available to the microbial community (dissolved organic carbon, particulate organic matter, inorganic nutrients), and a comprehensive description of the viral and bacterial communities (via direct viral and microbial counts, enumeration of autofluorescent microbes, and construction of viral and microbial metagenomes). We use a combination of methods, which represent a dispersed field of scientific disciplines comprising already established protocols and some of the most recent techniques developed. Especially metagenomic sequencing techniques used for viral and bacterial community characterization, have been established only in recent years, and are thus still subjected to constant improvement. This has led to a variety of sampling and sample processing procedures currently in use. The set of methods presented here provides an up to date approach to collect and process environmental samples. Parameters addressed with these protocols yield the minimum on information essential to characterize and understand the underlying mechanisms of viral and microbial community dynamics. It gives easy to follow guidelines to conduct comprehensive surveys and discusses critical steps and potential caveats pertinent to each technique.

Here, we present a comprehensive protocol to assess the organic and inorganic nutrient availability and the abundance and structure of microbial and viral communities in remote marine environments.

Svelare i giocatori invisibili del Mare - Una guida del campo di Acqua Chimica e microbiologia marina

Here we introduce a series of thoroughly tested and well standardized research protocols adapted for use in remote marine environments. The sampling ...

Ambiente

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay

A standardized method is required when national studies on virus occurrence in environmental and drinking waters utilize multiple analytical laboratories. The U.S Environmental Protection Agency&#8217;s (USEPA) Method 1615 was developed with the goal of providing such a standard for measuring Enterovirus and Norovirus in these waters. Virus is concentrated from water using an electropositive filter, eluted from the filter surface with beef extract, and then concentrated further using organic flocculation. Herein we present the protocol from Method 1615 for filter elution, secondary concentration, and measurement of total culturable viruses. A portion of the concentrated eluate from each sample is inoculated onto ten replicate flasks of Buffalo Green Monkey kidney cells. The number of flasks demonstrating cytopathic effects is used to quantify the most probable number (MPN) of infectious units per liter. The method uses a number of quality controls to increase data quality and to reduce interlaboratory and intralaboratory variation. Laboratories must meet defined performance standards. Method 1615 was evaluated by examining virus recovery from reagent-grade and ground waters seeded with Sabin poliovirus type 3. Mean poliovirus recoveries with the total culturable assay were 111% in reagent grade water and 58% in groundwaters.

Here we present a procedure to measure total culturable viruses using the Buffalo Green Monkey kidney cell line. The procedure provides a standardized tool for measuring the occurrence of infectious viruses in environmental and drinking waters.

Metodo EPA 1615. Misura di Enterovirus e Norovirus Presenza in Water di cultura e RT-qPCR. II. Totale coltivabili Virus Assay

A standardized method is required when national studies on virus occurrence in environmental and drinking waters utilize multiple analytical laboratories. ...

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. Part III. Virus Detection by RT-qPCR

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a standardized method for use in multiple analytical laboratories during monitoring period 3 of the Unregulated Contaminant Monitoring Rule. Herein we present the protocol for extraction of viral ribonucleic acid (RNA) from water sample concentrates and for quantitatively measuring enterovirus and norovirus concentrations using reverse transcription-quantitative PCR (RT-qPCR). Virus concentrations for the molecular assay are calculated in terms of genomic copies of viral RNA per liter based upon a standard curve. The method uses a number of quality controls to increase data quality and to reduce interlaboratory and intralaboratory variation. The method has been evaluated by examining virus recovery from ground and reagent grade waters seeded with poliovirus type 3 and murine norovirus as a surrogate for human noroviruses. Mean poliovirus recoveries were 20% in groundwaters and 44% in reagent grade water. Mean murine norovirus recoveries with the RT-qPCR assay were 30% in groundwaters and 4% in reagent grade water.

Here we present a procedure to quantify enterovirus and norovirus in environmental and drinking waters using reverse transcription-quantitative PCR. Mean virus recovery from groundwater with this standardized procedure from EPA Method 1615 was 20% for poliovirus and 30% for murine norovirus.

Metodo EPA 1615. Misura di Enterovirus e Norovirus Presenza in Water di Cultura e RT-qPCR. Parte III. Rilevamento virus mediante RT-qPCR

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a ...

Cost-effective Method for Microbial Source Tracking Using Specific Human and Animal Viruses

Microbial contamination of the environment represents a significant health risk. Classical bacterial fecal indicators have shown to have significant limitations, viruses are more resistant to many inactivation processes and standard fecal indicators do not inform on the source of contamination. The development of cost-effective methods for the concentration of viruses from water and molecular assays facilitates the applicability of viruses as indicators of fecal contamination and as microbial source tracking (MST) tools. Adenoviruses and polyomaviruses are DNA viruses infecting specific vertebrate species including humans and are persistently excreted in feces and/or urine in all geographical areas studied. In previous studies, we suggested the quantification of human adenoviruses (HAdV) and JC polyomaviruses (JCPyV) by quantitative PCR (qPCR) as an index of human fecal contamination. Recently, we have developed qPCR assays for the specific quantification of porcine adenoviruses (PAdV) and bovine polyomaviruses (BPyV) as animal fecal markers of contamination with sensitivities of 1-10 genome copies per test tube. In this study, we present the procedure to be followed to identify the source of contamination in water samples using these tools. As example of representative results, analysis of viruses in ground water presenting high levels of nitrates is shown.
Detection of viruses in low or moderately polluted waters requires the concentration of the viruses from at least several liters of water into a much smaller volume, a procedure that usually includes two concentration steps in series. This somewhat cumbersome procedure and the variability observed in viral recoveries significantly hamper the simultaneous processing of a large number of water samples.
In order to eliminate the bottleneck caused by the two-step procedures we have applied a one-step protocol developed in previous studies and applicable to a diversity of water matrices. The procedure includes: acidification of ten-liter water samples, flocculation by skimmed milk, gravity sedimentation of the flocculated materials, collection of the precipitate and centrifugation, resuspension of the precipitate in 10 ml phosphate buffer. The viral concentrate is used for the extraction of viral nucleic acids and the specific adenoviruses and polyomaviruses of interest are quantified by qPCR. High number of samples may be simultaneously analyzed using this low-cost concentration method.
The procedure has been applied to the analysis of bathing waters, seawater and river water and in this study, we present results analyzing groundwater samples. This high-throughput quantitative method is reliable, straightforward, and cost-effective.

The study describes a cost-effective method for the identification of the source of fecal/urine contamination or contamination by nitrates in water using qPCR for the specific quantification of human/porcine/bovine DNA viruses, adenoviruses and polyomaviruses, proposed as MST tools.

Costo-efficace metodo per il rilevamento di origine microbica Utilizzando specifici virus umani e animali

Microbial contamination of the environment represents a significant health risk. Classical bacterial fecal indicators have shown to have significant ...

Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. Several downstream applications require large quantities of pure viral DNA, which is provided by this protocol. These applications include viral genome sequencing, where the removal of host DNA is crucial to optimize data output for viral sequences, and the production of new viral recombinant strains, where co-transfection of purified plasmid and linear viral DNA facilitates recombination.1,2,3 
This procedure utilizes a combination of extractions and density-based centrifugation to isolate purified linear herpesvirus nucleocapsid DNA from infected cells.4,5 The initial purification steps aim to isolate purified viral capsids, which contain and protect the viral DNA during the extractions and centrifugation steps that remove cellular proteins and DNA. Lysis of nucleocapsids then releases viral DNA, and two final phenol-chloroform steps remove remaining proteins. The final DNA captured from solution is highly concentrated and pure, with an average OD260/280 of 1.90. Depending on the quantity of infected cells used, yields of viral DNA range from 150-800 &mu;g or more. The purity of this DNA makes it stable during long-term storage at 4C. This DNA is thus ideally suited for high-throughput sequencing, high fidelity PCR reactions, and transfections. 
Prior to beginning the protocol, it is important to know the average number of cells per dish (e.g. an average of 8 x 106 PK-15 cells in a confluent 15 cm dish), and the titer of the viral stock to be used (e.g. 1 x 108 plaque-forming units per ml). These are necessary to calculate the appropriate multiplicity of infection (MOI) for the protocol.6 For instance, to infect one 15 cm dish of PK-15 cells with the above viral stock, at an MOI of 5, you would use 400 &mu;l of viral stock and dilute it with 3.6 ml of medium (total inoculation volume of 4 ml for one 15 cm plate).
Multiple viral DNA preparations can be prepared at the same time. The number of simultaneous preparations is limited only by the number of tubes held by the ultracentrifuge rotor (one per virus; see step 3.9 below). Here we describe the procedure as though being done for one virus.

We describe the process of isolating high purity herpesvirus nucleocapsid DNA from infected cells. The final DNA captured from solution is of high concentration and purity, making it ideally suited for high-throughput sequencing, high fidelity PCR reactions, and transfections to produce new viral recombinants.

Estrazione di DNA virale da nucleocapsidi

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. ...

Glass Wool Filters for Concentrating Waterborne Viruses and Agricultural Zoonotic Pathogens

The key first step in evaluating pathogen levels in suspected contaminated water is concentration. Concentration methods tend to be specific for a particular pathogen group, for example US Environmental Protection Agency Method 1623 for Giardia and Cryptosporidium1, which means multiple methods are required if the sampling program is targeting more than one pathogen group. Another drawback of current methods is the equipment can be complicated and expensive, for example the VIRADEL method with the 1MDS cartridge filter for concentrating viruses2. In this article we describe how to construct glass wool filters for concentrating waterborne pathogens. After filter elution, the concentrate is amenable to a second concentration step, such as centrifugation, followed by pathogen detection and enumeration by cultural or molecular methods. The filters have several advantages. Construction is easy and the filters can be built to any size for meeting specific sampling requirements. The filter parts are inexpensive, making it possible to collect a large number of samples without severely impacting a project budget. Large sample volumes (100s to 1,000s L) can be concentrated depending on the rate of clogging from sample turbidity. The filters are highly portable and with minimal equipment, such as a pump and flow meter, they can be implemented in the field for sampling finished drinking water, surface water, groundwater, and agricultural runoff. Lastly, glass wool filtration is effective for concentrating a variety of pathogen types so only one method is necessary. Here we report on filter effectiveness in concentrating waterborne human enterovirus, Salmonella enterica, Cryptosporidium parvum, and avian influenza virus.

Glass wool filters have been used to concentrate waterborne viruses by a number of research groups around the world. Here we show a simple approach for constructing glass wool filters and demonstrate the filters are also effective in concentrating waterborne viral, bacterial and protozoan pathogens.

Filtri di lana di vetro per la raccolta virus a base acquosa e agricole agenti patogeni zoonotici

The key first step in evaluating pathogen levels in suspected contaminated water is concentration.  Concentration methods tend to be specific for a ...

Concentration of Virus Particles from Environmental Water and Wastewater Samples Using Skimmed Milk Flocculation and Ultrafiltration

Water and wastewater-based epidemiology have emerged as alternative methods to monitor and predict the course of outbreaks in communities.&#160;The recovery of microbial fractions, including viruses, bacteria, and microeukaryotes from wastewater and environmental water samples&#160;is one of the challenging steps in these approaches. In this study, we focused on the recovery efficiency of sequential ultrafiltration and skimmed milk flocculation (SMF) methods using Armored RNA as a test virus, which is also used as a control by some other studies. Prefiltration with 0.45 &#181;m and 0.2 &#181;m membrane disc filters were applied to eliminate solid particles before ultrafiltration to prevent the clogging of ultrafiltration devices. Test samples, processed with the sequential ultrafiltration method, were centrifuged at two different speeds. An increased speed resulted in lower recovery and positivity rates of Armored RNA.&#160;On the other hand, SMF resulted in relatively consistent recovery and positivity rates of Armored RNA. Additional tests conducted with environmental water samples demonstrated the utility of SMF to concentrate other microbial fractions. The partitioning of viruses into solid particles might have an impact on the overall recovery rates, considering the prefiltration step applied before the ultrafiltration of wastewater samples. SMF with prefiltration performed better when applied to environmental water samples&#160;due to lower solid concentrations in the samples and thus lower partitioning rates to solids. In the present study, the idea of using a sequential ultrafiltration method arose from the necessity to decrease the final volume of the viral concentrates during the COVID-19 pandemic, when the supply of the commonly used ultrafiltration devices was limited, and there was a need for the development of alternative viral concentration methods.

Virus concentration from environmental water and wastewater samples is a challenging task, carried out primarily for the identification and quantification of viruses. While several virus concentration methods have been developed and tested, we demonstrate here the effectiveness of ultrafiltration and skimmed milk flocculation for RNA viruses with different sample types.

Concentrazione di particelle virali da campioni di acqua ambientale e acque reflue mediante flocculazione e ultrafiltrazione del latte scremato

Water and wastewater-based epidemiology have emerged as alternative methods to monitor and predict the course of outbreaks in communities.&#160;The ...

Lentivirus Production

RNA interference (RNAi) is a system of gene silencing in living cells. In RNAi, genes homologous in sequence to short interfering RNAs (siRNA) are silenced at the post-transcriptional state. Short hairpin RNAs, precursors to siRNA, can be expressed using lentivirus, allowing for RNAi in a variety of cell types. Lentiviruses, such as the Human Immunodeficiency Virus, are capable to infecting both dividing and non-dividing cells. We will describe a procedure which to package lentiviruses. Packaging refers to the preparation of competent virus from DNA vectors. Lentiviral vector production systems are based on a 'split' system, where the natural viral genome has been split into individual helper plasmid constructs. This splitting of the different viral elements into four separate vectors diminishes the risk of creating a replication-capable virus by adventitious recombination of the lentiviral genome. Here, a vector containing the shRNA of interest and three packaging vectors (p-VSVG, pRSV, pMDL) are transiently transfected into human 293 cells. After at least a 48-hour incubation period, the virus containing supernatant is harvested and concentrated. Finally, virus titer is determined by reporter (fluorescent) expression with a flow cytometer.

To make lentiviruses, DNA vectors are transfected into human 293 cells. After harvest and concentrating the supernatant, virus titer is determined by fluorescence expression with a flow cytometer.

Lentivirus Produzione

RNA interference (RNAi) is a system of gene silencing in living cells. In RNAi, genes homologous in sequence to short interfering RNAs (siRNA) are ...

Biologia

A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis

The isolation of giant viruses is of great interest in this new era of virology, especially since these giant viruses are related to protists. Giant viruses may be potentially pathogenic for many species of protists. They belong to the recently described order of Megavirales. The new lineage Faustovirus that has been isolated from sewage samples is distantly related to the mammalian pathogen African swine fever virus. This virus is also specific to its amoebal host, Vermamoeba vermiformis, a protist common in health care water systems. It is crucial to continue isolating new Faustovirus genotypes in order to enlarge its genotype collection and study its pan-genome. We developed new strategies for the isolation of additional strains by improving the use of antibiotic and antifungal combinations in order to avoid bacterial and fungal contaminations of the amoeba co-culture and favoring the virus multiplication. We also implemented a new starvation medium to maintain V. vermiformis in optimal conditions for viruses co-culture. Finally, we used flow cytometry rather than microscopic observation, which is time-consuming, to detect the cytopathogenic effect. We obtained two isolates from sewage samples, proving the efficiency of this method and thus widening the collection of Faustoviruses, to better understand their environment, host specificity and genetic content.

A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis

We describe here the latest advances in viral isolation for the characterization of new genotypes of Faustovirus, a new asfarvirus-related lineage of giant viruses. This protocol can be applied to the high throughput isolation of viruses, especially giant viruses infecting amoeba.

Una strategia rapido per l&#39;isolamento di nuovi Faustoviruses da campioni ambientali Utilizzando<em&gt; vermiformis Vermamoeba</em

The isolation of giant viruses is of great interest in this new era of virology, especially since these giant viruses are related to protists. Giant ...