We would like to thank Dr. Nicholas J. Ashbolt and Dr. G. Shay Fout for their review of the manuscript.

1. إعداد زجاجيات والتصفية مساكن <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ما لم يذكر خلاف ذلك، وتعقيم جميع الأواني الزجاجية، والمشاريع السكنية والحلول مرشح في 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. لضمان العقم، وتغطية جميع الفتحات أو الأسطح المكشوفة مع أي من رقائق الألومنيوم أو الورق تأمين الشريط قبل التعقيم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجميع جهاز الترشيح عن طريق ربط السكن فلتر (47 مم) إلى 1 L الذراع الجانب مخروطي قارورة. جمع الفلاتر المطلوبة: 47 مم كهربي / كهربية مرشحات القرص. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 1 L 1.5٪ مستخلص لحم البقر (المرسب، تنتج جزيئات الندف عندما يخفض الحموضة من الحل إلى 3.5، أو عدم المرسب؛ الذي لا الكلي في درجة الحموضة 3.5)، مع 0.05 M الجلايسين، عن طريق إذابة 15 غرام من لحم البقر في استخراج 1 لتر من الماء منزوع الأيونات وإضافة 3.75 ز الجلايسين. ملاحظة: سوف مقتطفات لحم البقر غير المرسب تتطلب إضافة celite قبل التركيز العالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة شطف Polyph والصوديوم المضافةosphate لاستخراج لحوم البقر بتركيز 0.1٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 M حل حمض الهيدروكلوريك، وانخفاض الحكمة، لخلط استخراج لحوم البقر، حل الرقم الهيدروجيني إلى درجة الحموضة المطلوبة. الأوتوكلاف استخراج لحوم البقر ل15-30 دقيقة في درجة حرارة 121 مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس 0.1 غرام من غرامة والمتوسطة، أو celite الجسيمات كبير (للاستخدام مع غير المرسب استخراج لحم البقر فقط). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الفراغ / شفط عن طريق ربط الأنابيب متوافق لمخروطي الجانب الذراع القارورة وبمأخذ التيار فراغ. </li></ol> 2. إعداد حلول والفيروسات المالية <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 1 لتر من 1 M حمض الهيدروكلوريك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 1 لتر من 1 M هيدروكسيد الصوديوم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حل PBS 1X (137 مم كلوريد الصوديوم، و 2.7 ملي بوكل، 1.47 ملي K 2 PO 4، و 4.3 ملي ناه 2 PO 4). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط درجة الحموضة من برنامج تلفزيوني 1X إلى 9.0 باستخدام 1 M هيدروكسيد الصوديوم. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد وتمييع الفيروس الأسهم إلى 10 -10 4 5 الرقم الأكثر احتمالا (MPN) مل -1 عن طريق خلط 1 مل من فيروس الأسهم مع 9 مل من برنامج تلفزيوني (الرقم الهيدروجيني7)، كما هو موضح سابقا 8،13. متجر في -80 ° C في 1 مل مأخوذة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعقيم المخزون الفيروس عن طريق تصفية حقنة (0.22 ميكرون حجم المسام) لإزالة الملوثات المحتملة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الكلور مياه الحنفية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مقياس 1 لتر من ماء الصنبور معقمة باستخدام معقمة تخرج اسطوانة وتصب في كوب 2 L تحتوي على شريط مغناطيسي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 0.7 غرام من الصوديوم وحمض وتخلط حتى تذوب حبيبات. ضبط الرقم الهيدروجيني للمياه الصنبور ل7-7.5 إذا لزم الأمر باستخدام 1 M حمض الهيدروكلوريك أو 1 M هيدروكسيد الصوديوم الحل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ارتفاع فيروس ذوبان الجليد (1 مل)، وإضافة حجم كامل من ارتفاع إلى 1 L من إزالة الكلور ماء الصنبور العقيمة. مزيج لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد طريقة فارغة (إزالة الكلور ماء الصنبور دون اتش) مع كل تجربة وعملية في نفس الطريقة كما العينة ارتفعت. </li></ol></li></ol> 3. إعداد ميليبور تصفية (فلترة) جهاز <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة غطاء معقم على السكن التصفية. ضمانصالح سليم بين الإسكان مرشح عاء العلوي والسفلي شاشة التصفية لتجنب تسرب عينة خلال الترشيح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة غطاء معقم من 1 L مخروطي قارورة. تأكد من أن الفلين وحدة تصفية يلائم بشكل مريح في افتتاح قمة مخروطي قارورة، وخلق ختم جيدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة وعاء كبير من حدة مرشح من انخفاض شاشة التصفية، ووضع 47 ملم القرص فلتر كهربي مباشرة على الشاشة مع ملقط معقم. إرفاق مرشح عاء الإسكان إلى أسفل الشاشة والقفل في مكانه من قبل التواء عكس اتجاه عقارب الساعة. </li></ol> 4. مياه الحنفية الترشيح (تركيز الابتدائي) <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس 100 مل من فيروس ارتفعت مياه الصنبور باستخدام تخرج عقيمة الاسطوانة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب 100 مل من فيروس ارتفعت مياه الصنبور في السكن فلتر تحتوي على إما 47 ملم الزجاج مطوي / فلتر السليلوز أو نانو الألومينا / الزجاج مرشح القرص الألياف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسمح للماء بالمرور ببطء من خلال التصفية. تطبيق فراغ لطيف لإزالة المخلفات المتبقية سماء الصنبور و من سطح المرشح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كان استخدام العلاج التربسين، إضافة 5 مل من 0.25٪ التربسين لتصفية السطح واحتضان لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل التربسين من سطح مرشح باستخدام 50 مل من الماء منزوع الأيونات معقمة. </li></ol> 5. الفيروسات شطف من تصفية (فلترة) <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة المساكن مرشح من 2 L مخروطي قارورة، ومكان على 250 مل الجانب الذراع القارورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس 100 مل من مستخلص اللحم البقري باستخدام اسطوانة تخرج. صب ببطء 100 مل من مستخلص اللحم البقري إلى مساكن التصفية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح استخراج لحوم البقر لتصب من خلال مرشح، واستولت على استخراج لحوم البقر في صغيرة (250 مل) مخروطي قارورة. تطبيق فراغ لسحب المتبقي من خلال استخراج لحوم البقر من التصفية. </li></ol> 6. Celite تركيز الثانوي <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قوارير نقل تحتوي على فيروسات مزال إلى لوحة ضجة. إضافة معقم شريط مغناطيسي ومكان على لوحة ضجة، وخلط لخلق دوامة طفيفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 0.1 غرام من celiteمسحوق إلى 100 مل من مستخلص لحم البقر والسماح celite لتفريق. وضع معقم التحقيق درجة الحموضة في استخراج لحوم البقر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة قطرة من الحكمة 1 M حمض الهيدروكلوريك لاستخراج لحوم البقر لتحقيق درجة الحموضة 4.0. السماح لخلط ببطء لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع 47 ملم ما قبل التصفية على السكن فلتر (كما هو موضح سابقا) باستخدام قارورة 2 L مخروطي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب 100 مل لحم البقر استخراج / خليط celite على ما قبل التصفية. السماح استخراج لحوم البقر لتصب من خلال. تطبيق فراغ طفيف لسحب المتبقي من خلال استخراج لحوم البقر من التصفية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع أنبوب معدني مشبك على نهاية صنبور الإسكان التصفية. نعلق معقمة 15 مل جمع البولي بروبلين أنبوب إلى أنبوب معدني كليب. وضع الإسكان مرشح مرة أخرى إلى دورق مخروطي سعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 5 مل من العازلة 1X PBS، ودرجة الحموضة 9.0 على celite جمعها على ما قبل التصفية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح PBS بالتنقيط من خلال ما قبل التصفية. تطبيق فراغ طفيف لسحب من خلال برنامج تلفزيوني المتبقية إلى 15 مل أنبوب جمع. </li></ol> 7. العضوية التلبد تركيز الثانوي <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl">نقل الأكواب التي تحتوي على الفيروس مزال إلى لوحة ضجة. إضافة معقم شريط مغناطيسي إلى 100 مل من مستخلص لحم البقر وخلط لخلق دوامة طفيفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع معقم التحقيق درجة الحموضة في استخراج لحوم البقر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 قطرة M حمض الهيدروكلوريك الحكمة لاستخراج لحوم البقر وضبط درجة الحموضة إلى 3.5. مزيج لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب شطافة إلى 250 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطية والطرد المركزي في 2،500 x ج لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخلصي طاف مع الحرص على عدم عدم تعطيل بيليه. Resuspend وبيليه في 5 مل من برنامج تلفزيوني 1X، ودرجة الحموضة 9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي تعليق على 4،000 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. تخلصي من طاف وتجاهل بيليه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط درجة الحموضة إلى 7-7.5، فلتر تعقيم من خلال 0.22 ميكرون تصفية المحاقن وتجميد في -80 ° C. </li></ol> 8. الفيروسية نوكليك حمض استخراج <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخراج الأحماض النووية الفيروسية باستخدام طقم التجارية المناسبة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. </li></ol> &lt;ص الطبقة = &quot;jove_title&quot;&gt; 9. ADV 40/41 QPCR <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الاشعال وتحقيقات، وكذلك مزيج رد فعل وملامح ركوب الدراجات الحرارية كما نشرت 8،13. ملاحظة: الحد الأقصى المقدر للكشف عن فحص ما يقرب من 5 وحدات QPCR في رد الفعل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة مكونات مخاليط PCR التضخيم في تركيزات على النحو التالي: 10 ملي تريس (الرقم الهيدروجيني 8.3)، 50 ملي بوكل، 4.5 ملي MgCl 2، 10 ملم dNTPs، 10 ميكرومتر الاشعال و 1 ميكرومتر التحقيق و 0.5 ميكرولتر من البلمرة بحيث أحجام النهائية من 45 ميكرولتر يمكن أن تضاف إلى العدد المناسب من الآبار ضمن 96-جيدا PCR لوحة رد فعل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل 45 ميكرولتر من PCR خليط التضخيم إلى كل بئر المناسب ل96-جيدا، رد فعل سريع PCR لوحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 5 ميكرولتر من عينة الحمض النووي المستخرج من الآبار المناسبة من لوحة PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطية لوحة مع حرارة ختم غطاء مقاومة، وتدور لوحة لنقل أي قطرات في قاع الآبار PCR لوحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين دورات التضخيم PCR كما الفلالدودة الحلزونية: 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، تليها 40 دورة من 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية و 60 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة. </li></ol> 10. تحليل البيانات <ol style="margin-left: 40px;;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل القياسات ثلاث نسخ من مسلسل التخفيفات 5 أضعاف من العينات التي تغطي 1: 5-1: مجموعة 625 التخفيف من أجل تحديد عدد الأكثر احتمالا (MPN) من الجسيمات الفيروسية، كما هو موضح سابقا 8،13. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل مسلسل التخفيفات 5 أضعاف من المسامير التجريبية اتش تمتد 1: 5-1: النطاق 15625 التخفيف من أجل تحديد عدد الأكثر احتمالا (MPN) من الجسيمات الفيروسية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام آلة حاسبة وكالة حماية البيئة MPN (http://www.epa.gov/nerlcwww/online.html)، وضبط آلة حاسبة لحساب نوع من التخفيف (1: 5 أو 1:10)، وعدد من التخفيفات القيام بها، وعدد من تكرار العينات في سلسلة التخفيف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء تسجيل 10 تحويل البيانات، تليها تطبيع إلى وحدة الحجم (على سبيل المثال، 1 مل، 100 مل، الخ </م&gt;). حساب المبالغ المستردة عن تجربة معينة بقسمة عدد الجسيمات الفيروسية الموجودة في عينة يركز مع عدد من الجسيمات الفيروسية الحالية في المسامير التجريبية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقييم تأثير المتغيرات التجريبية المختلفة (على سبيل المثال، أنواع مختلفة celite، ويتراوح الرقم الهيدروجيني، وأنواع مختلفة مرشح وتقنيات تركيز الثانوية مختلفة) على المبالغ المستردة ADV عن طريق إجراء الاختبارات الإحصائية المعلمية أو غير المعلمية (على سبيل المثال، تقرن اختبار t، واحد أو اثنين -way ANOVA) تبعا لتوزيع البيانات والتصميم التجريبي. </li></ol>

<ol>
	<li>Sinclair, R. G., Jones, E. L., Gerba, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viruses+in+recreational+water-borne+disease+outbreaks:+a+review.">Viruses in recreational water-borne disease outbreaks: a review.</a> Journal of Applied Microbiology. 107, 1769-1780 (2009).</li><li>WHO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guidelines for Safe Recreational Water Environments. , (2003).</li><li>Westrell, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Norovirus+outbreaks+linked+to+oyster+consumption+in+the+United+Kingdom.">Norovirus outbreaks linked to oyster consumption in the United Kingdom.</a> Euro Surveillance : Bulletin Europeen Sur les Maladies Transmissibles = European Communicable Disease Bulletin. 15, (2010).</li><li>Wong, K., Fong, T. T., Bibby, K., Molina, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+enteric+viruses+for+fecal+pollution+source+tracking+in+environmental+waters.">Application of enteric viruses for fecal pollution source tracking in environmental waters.</a> Environment International. 45, 151-164 (2012).</li><li>Cashdollar, J. L., Wymer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+primary+concentration+of+viruses+from+water+samples:+a+review+and+meta-analysis+of+recent+studies.">Methods for primary concentration of viruses from water samples: a review and meta-analysis of recent studies.</a> Journal of Applied Microbiology. 115, 1-11 (2013).</li><li>Ikner, L. A., Soto-Beltran, M., Bright, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+method+using+a+positively+charged+microporous+filter+and+ultrafiltration+for+concentration+of+viruses+from+tap+water.">New method using a positively charged microporous filter and ultrafiltration for concentration of viruses from tap water.</a> Applied and Environmental Microbiology. 77, 3500-3506 (2011).</li><li>Karim, M. R., Rhodes, E. R., Brinkman, N., Wymer, L., Fout, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+electropositive+filter+for+concentrating+enteroviruses+and+noroviruses+from+large+volumes+of+water.">New electropositive filter for concentrating enteroviruses and noroviruses from large volumes of water.</a> Applied and Environmental Microbiology. 75, 2393-2399 (2009).</li><li>McMinn, B. R., Cashdollar, J. L., Grimm, A. C., Fout, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+celite+secondary+concentration+procedure+and+an+alternate+elution+buffer+for+the+recovery+of+enteric+adenoviruses+40+and+41.">Evaluation of the celite secondary concentration procedure and an alternate elution buffer for the recovery of enteric adenoviruses 40 and 41.</a> Journal of Virological Methods. 179, 423-428 (2012).</li><li>Katzenelson, E., Fattal, B., Hostovesky, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organic+flocculation:+an+efficient+second-step+concentration+method+for+the+detection+of+viruses+in+tap+water.">Organic flocculation: an efficient second-step concentration method for the detection of viruses in tap water.</a> Applied and Environmental Microbiology. 32, 638-639 (1976).</li><li>Fout, G. S., Schaefer, F. W., Messer, J. W., Dahling, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> ICR microbial laboratory manual. 178, (1996).</li><li>Calgua, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+application+of+a+one-step+low+cost+procedure+to+concentrate+viruses+from+seawater+samples.">Development and application of a one-step low cost procedure to concentrate viruses from seawater samples.</a> Journal of Virological Methods. 153, 79-83 (2008).</li><li>Calgua, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+quantification+of+classic+and+emerging+viruses+by+skimmed-milk+flocculation+and+PCR+in+river+water+from+two+geographical+areas.">Detection and quantification of classic and emerging viruses by skimmed-milk flocculation and PCR in river water from two geographical areas.</a> Water Research. 47, 2797-2810 (2013).</li><li>McMinn, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+adenovirus+40+and+41+recovery+from+tap+water+using+small+disk+filters.">Optimization of adenovirus 40 and 41 recovery from tap water using small disk filters.</a> Journal of Virological Methods. 193 (2), 284-290 (2013).</li><li>Brinkman, N. E., Haffler, T. D., Cashdollar, J. L., Rhodes, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+methods+using+celite+to+concentrate+norovirus,+adenovirus+and+enterovirus+from+wastewater.">Evaluation of methods using celite to concentrate norovirus, adenovirus and enterovirus from wastewater.</a> Journal of Virological Methods. 193, 140-146 (2013).</li><li>Albinsson, B., Kidd, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenovirus+type+41+lacks+an+RGD+alpha(v)-integrin+binding+motif+on+the+penton+base+and+undergoes+delayed+uptake+in+A549+cells.">Adenovirus type 41 lacks an RGD alpha(v)-integrin binding motif on the penton base and undergoes delayed uptake in A549 cells.</a> Virus Research. 64, 125-136 (1999).</li><li>He, C., Lian, J. S., Jiang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electronic+structures+and+hydrogen+bond+network+of+high-density+and+very+high-density+amorphous+ices.">Electronic structures and hydrogen bond network of high-density and very high-density amorphous ices.</a> The Journal of Physical Chemistry. B. 109, 19893-19896 (2005).</li><li>Sedmak, G., Bina, D., Macdonald, J., Couillard, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nine-year+study+of+the+occurrence+of+culturable+viruses+in+source+water+for+two+drinking+water+treatment+plants+and+the+influent+and+effluent+of+a+Wastewater+Treatment+Plant+in+Milwaukee,+Wisconsin.">Nine-year study of the occurrence of culturable viruses in source water for two drinking water treatment plants and the influent and effluent of a Wastewater Treatment Plant in Milwaukee, Wisconsin.</a> 71, 1042-1050 (2005).</li><li>Soto-Beltran, M., Ikner, L. A., Bright, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effectiveness+of+poliovirus+concentration+and+recovery+from+treated+wastewater+by+two+electropositive+filter+methods.">Effectiveness of poliovirus concentration and recovery from treated wastewater by two electropositive filter methods.</a> Food and Environmental Virology. 5, 91-96 (2013).</li><li>Haramoto, E., Katayama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+acidic+elution+to+virus+concentration+using+electropositive+filters.">Application of acidic elution to virus concentration using electropositive filters.</a> Food and Environmental Virology. 5, 77-80 (2013).</li><li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+electropositive+filtration+for+recovering+norovirus+in+water.">Evaluation of electropositive filtration for recovering norovirus in water.</a> Journal of Water and Health. 9, 27-36 (2011).</li><li>Gibbons, C. D., Rodriguez, R. A., Tallon, L., Sobsey, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+positively+charged+alumina+nanofibre+cartridge+filters+for+the+primary+concentration+of+noroviruses,+adenoviruses+and+male-specific+coliphages+from+seawater.">Evaluation of positively charged alumina nanofibre cartridge filters for the primary concentration of noroviruses, adenoviruses and male-specific coliphages from seawater.</a> Journal of Applied Microbiology. 109, 635-641 (2010).</li><li>Hill, V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+rapid+method+for+simultaneous+recovery+of+diverse+microbes+in+drinking+water+by+ultrafiltration+with+sodium+polyphosphate+and+surfactants.">Development of a rapid method for simultaneous recovery of diverse microbes in drinking water by ultrafiltration with sodium polyphosphate and surfactants.</a> Applied and Environmental Microbiology. 71, 6878-6884 (2005).</li><li>Polaczyk, A. L., Roberts, J. M., Hill, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+1MDS+electropositive+microfilters+for+simultaneous+recovery+of+multiple+microbe+classes+from+tap+water.">Evaluation of 1MDS electropositive microfilters for simultaneous recovery of multiple microbe classes from tap water.</a> Journal of Microbiological Methods. 68, 260-266 (2007).</li><li>Rhodes, E. R., Hamilton, D. W., See, M. J., Wymer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+hollow-fiber+ultrafiltration+primary+concentration+of+pathogens+and+secondary+concentration+of+viruses+from+water.">Evaluation of hollow-fiber ultrafiltration primary concentration of pathogens and secondary concentration of viruses from water.</a> Journal of Virological Methods. 176, 38-45 (2011).</li><li>Melnick, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Round+robin+investigation+of+methods+for+the+recovery+of+poliovirus+from+drinking+water.">Round robin investigation of methods for the recovery of poliovirus from drinking water.</a> Applied and Environmental Microbiology. 47, 144-150 (1984).</li><li>Schwab, K. J., De Leon, R., Sobsey, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concentration+and+purification+of+beef+extract+mock+eluates+from+water+samples+for+the+detection+of+enteroviruses,+hepatitis+A+virus,+and+Norwalk+virus+by+reverse+transcription-PCR.">Concentration and purification of beef extract mock eluates from water samples for the detection of enteroviruses, hepatitis A virus, and Norwalk virus by reverse transcription-PCR.</a> Applied and Environmental Microbiology. 61, 531-537 (1995).</li></ol>

No competing financial interests. 
The views expressed in this article are those of the authors and do not necessarily reflect the views or policies of the U.S. Environmental Protection Agency. Mention of trade names or commercial products does not constitute endorsement or recommendation for use.

مرشحات كهربي مفيدة في التركيز الفيروسات من الماء. ولكن هذه الفلاتر يمكن أن تختلف في بنيتها وتكوينها والتي يمكن بدورها تغير فعاليتها. ومما يزيد هذه المشكلة، والهياكل قفيصة والرسوم تختلف بين سلالات الفيروس التي تتطلب تقنيات تركيز تكون مصممة لضمان استرداد الأمثل 15.<...

الفيروسات المعوية الإنسان هي العوامل المسببة هاما من الأمراض التي تنقلها المياه 1-3، ولكن عادة ما تكون موجودة بأعداد قليلة في المياه الملوثة البيئية، مما يجعل من الصعب الكشف عنها دون تركيز. الإجراءات المستخدمة للتركيز الفيروسات وعادة ما تشمل خطوة الترشيح، وتليها مرشح شطف، والتركيز الثانوي للشطافة التصفية. يعتمد إجراء الترشيح مشترك بشأن استخدام الأغشية المشحونة مثل مرشحات كهربي (استعرضت مؤخرا في 4،5). هذه الفلاتر تعتمد على التقاط الفيروسات العالقة في الماء باستخدام التفاعلات كهرباء بين سطح فلتر (موجبة) وجزيئات الفيروس المستهدفة (سالبة الشحنة). اثنين من المرشحات موجب الشحنة الكهربائية المتوفرة تجاريا تعتمد على هذه التكنولوجيا، والمرشحات الزجاج / السليلوز والنانو الألومينا / الألياف الزجاجية. تكاليف مرشح الزجاج / السليلوز ما يصل إلى 10 مرة من النانو الألومينا / الألياف الزجاجية، التي تحد من استخدام الزجاج / ممرشحات llulose لرصد فيروس الروتيني. وخلصت الدراسات التي أجريت مؤخرا الاختلافات الاسمية بين هذه الفلاتر اثنين في التعافي من الفيروسات المعوية من 6،7 المياه المحيطة، والتي تبرر استخدام مرشح بديل أرخص. وقد تم دراسة خيارات التصفية أخرى مثل مرشحات كهربية والزجاج والصوف، إلا أنها إما تتطلب المعالجة المسبقة لمصدر المياه (الفلاتر كهربية) أو ليست متاحة تجاريا (الفلاتر الزجاج الصوف). وضع إجراءات تركيز الفيروس قد ركزت في معظمها على تحسين تقنيات تركيز الابتدائية (الفلاتر) من أجل تحسين المستردة الفيروس من المياه. ومع ذلك، إجراءات تركيز الثانوية، والتي تقلل من حجم eluant عادة من 1 L لملليلتر مجلدات، ويمكن أيضا أن يكون لها تأثير كبير على المبالغ المستردة فيروس 8. تركيز الثانوية من الفيروسات المعوية يعتمد عادة على وكيل المرسب مثل بعض أنواع من استخراج لحوم البقر (floccu العضويةlation) أو الحليب منزوع الدسم التلبد 9-12 لإزالة جزيئات الفيروس من الأسطح التصفية. مؤخرا، والإجراءات تركيز ثانوي آخر باستخدام مستخلص اللحم البقري إلى جانب إضافة celite (الجسيمات الدقيقة) وقد أظهرت الوعد لاستعادة اتش، المعوى، ونوروفيروس 8،13،14. Celite أعمال الاعتقال وفقا لمبادئ مماثلة لتلك التي من طريقة التلبد العضوي في أن جزيئات الفيروس نعلق على ويفرج من الجسيمات (الندف أو celite) عن طريق تغيير الرقم الهيدروجيني للمحلول تعليق. تم تقييم مقارنات بين هذه التقنيات تركيز الثانوية اثنين في استرداد اتش مسنبل (ADV) أنواع 40 و 41 8. وخلصت هذه الدراسة إلى أن اثنين من تقنيات تركيز الثانوية كانت مشابهة إحصائيا في التعافي من الفيروسات الغدية. ومع ذلك، يتطلب طريقة التلبد العضوية لمدة 30 دقيقة. حضانة في درجة الحموضة 3.5، في حين أن تقنية celite تتطلب الحضانة أقصر (10 دقيقة) في درجة الحموضة 4.0. وflocculat العضويةكما يتطلب أيون استخدام المعدات المختبرية المكلفة (أجهزة الطرد المركزي) لجمع الجسيمات الندف خلال التركيز العالي، والتقنية celite في المقابل تستخدم المعدات الأساسية فقط المختبر (الترشيح فراغ) لفصل الجسيمات celite من الايقاف. تركيبات معينة من المرشحات وتقنيات شطف الثانوية يمكن أن يؤثر أيضا المستردة الفيروس. وخلصت إحدى الدراسات أن تركيبات معينة من الابتدائية (الفلاتر كهربي) وتقنيات تركيز الثانوية (celite أو التلبد العضوي) كان لها تأثير كبير على الانتعاش من اتش 13. وتشير هذه النتائج هو مطلوب أن الأمثل من أجل استرداد النحو الأمثل فيروس الهدف من مصفوفة المياه نظرا عند استخدام هذه التقنيات. الأمثل هو مضيعة للوقت، وتجنب عملية شاقة العديد من الباحثين بنشاط منذ سيتم تقييم العديد من المتغيرات (نوع مرشح / العلامة التجارية، ودرجة الحموضة حل شطف، celite / التلبد العضوي). لهذا لياليtudy، تم وضع إجراءات لتحديد الظروف المثلى لتركيز الفيروس من المياه باستخدام اتش البشري مسنبل سلالات 40 و 41. ومن المفترض، لأن كل نوع الفيروس يعرض مورفولوجية قفيصة فريدة من نوعها ورسوم قفيصة معين، قد تحتاج بروتوكولات تركيز ليكون الأمثل لكل فيروس استهداف من أجل تحقيق الانتعاش الفيروسي الأمثل. وتقدم هذه الدراسة نهجا لADV 40 و 41 تركيز من قبل: 1) تقييم المبالغ المستردة الفيروس في ماء الصنبور باستخدام أقراص فلتر كهربي تليها 2) تقييم طريقة التلبد العضوي أنشئت مقابل تقنية celite بمثابة تركيز الثانوي، و 3) تقييم مخازن شطف للتركيز العالي.

<table><tbody><tr><td>Adenovirus 40 stock</td><td>ATCC</td><td>VR-931</td><td></td></tr><tr><td>Adenovirus 41 stock</td><td>ATCC</td><td>VR-930</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Thiosulfate</td><td>Fluka Chemical Co.</td><td>72051</td><td></td></tr><tr><td>Celites #577</td><td>Fluka Chemical Co.</td><td>22142</td><td></td></tr><tr><td>NanoCeram 47 mm</td><td>Argonide</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>1MDS 47 mm</td><td>3M</td><td>6408502</td><td></td></tr><tr><td>AP-20 Prefilter 47 mm</td><td>Millipore Corp.</td><td>AP2004700</td><td></td></tr><tr><td>Glycine&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>50046-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Polyphosphate</td><td>Acros Organics</td><td>390930010</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Gibco</td><td>25200</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma</td><td>P5368</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric Acid</td><td>Fisher</td><td>A481-212</td><td></td></tr><tr><td>BBL Beef Extract</td><td>BD Biosciences</td><td>212303</td><td></td></tr><tr><td>Difco Beef Extract</td><td>BD Biosciences</td><td>211520</td><td></td></tr><tr><td>ABI 7900 Real-time PCR system</td><td>ABI</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Stainless Steel Filter Housing</td><td>Millipore Corp.</td><td>XX2004720</td><td></td></tr><tr><td>Blood DNA Extraction Kit</td><td>Qiagen&amp;nbsp;</td><td>51104</td><td></td></tr><tr><td>EPA MPN Calculator</td><td></td><td></td><td>http://www.epa.gov/nerlcwww/online.html</td></tr></tbody></table>

a small volume procedure for viral concentration from water

Small-scale concentration of viruses (sample volumes 1-10 L, here simulated with spiked 100 ml water samples) is an efficient, cost-effective way to identify optimal parameters for virus concentration. Viruses can be concentrated from water using filtration (electropositive, electronegative, glass wool or size exclusion), followed by secondary concentration with beef extract to release viruses from filter surfaces, and finally tertiary concentration resulting in a 5-30 ml volume virus concentrate. In order to identify optimal concentration procedures, two different electropositive filters were evaluated (a glass/cellulose filter [1MDS] and a nano-alumina/glass filter [NanoCeram]), as well as different secondary concentration techniques; the celite technique where three different celite particle sizes were evaluated (fine, medium and large) followed by comparing this technique with that of the established organic flocculation method. Various elution additives were also evaluated for their ability to enhance the release of adenovirus (AdV) particles from filter surfaces. Fine particle celite recovered similar levels of AdV40 and 41 to that of the established organic flocculation method when viral spikes were added during secondary concentration. The glass/cellulose filter recovered higher levels of both, AdV40 and 41, compared to that of a nano-alumina/glass fiber filter. Although not statistically significant, the addition of 0.1% sodium polyphosphate amended beef extract eluant recovered 10% more AdV particles compared to unamended beef extract.

<html> Celite اختيار تم اختبار ثلاثة أنواع مختلفة من celite قبل اختيار الخيار الأفضل أداء. Celites مع غرامة لجسيمات متوسطة الحجم تنتج أعلى المبالغ المستردة اتش. أدى استخدام celites أكبر في انخفاض المبالغ المستردة لكلا AdV40 و 41 (المدى 32٪ -100٪) (ال...

Watch this Scientific Journal Video about A Small Volume Procedure for Viral Concentration from Water at JoVE.com

A Small Volume Procedure for Viral Concentration from Water

An approach was developed for identifying optimal viral concentration conditions for small volume water samples using spikes of human adenovirus. The techniques described here are used to identify concentration parameters for other viral targets, and applied to large-scale viral concentration experimentation.

إجراء بأحجام صغيرة للتركيز الفيروسي من المياه

Small-scale concentration of viruses (sample volumes 1-10 L, here simulated with spiked 100 ml water samples) is an efficient, cost-effective way to ...

a-small-volume-procedure-for-viral-concentration-from-water

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Environment

10.0K Views.  U.S. EPA. An approach was developed for identifying optimal viral concentration conditions for small volume water samples using spikes of human adenovirus. The techniques described here are used to identify concentration parameters for other viral targets, and applied to large-scale viral concentration experimentation. 

Video: A Small Volume Procedure for Viral Concentration from Water

Estimating Virus Production Rates in Aquatic Systems

Viruses are pervasive components of marine and freshwater systems, and are known to be significant agents of microbial mortality. Developing quantitative estimates of this process is critical as we can then develop better models of microbial community structure and function as well as advance our understanding of how viruses work to alter aquatic biogeochemical cycles. The virus reduction technique allows researchers to estimate the rate at which virus particles are released from the endemic microbial community. In brief, the abundance of free (extracellular) viruses is reduced in a sample while the microbial community is maintained at near ambient concentration. The microbial community is then incubated in the absence of free viruses and the rate at which viruses reoccur in the sample (through the lysis of already infected members of the community) can be quantified by epifluorescence microscopy or, in the case of specific viruses, quantitative PCR. These rates can then be used to estimate the rate of microbial mortality due to virus-mediated cell lysis.

The turnover rate of viruses in marine and freshwater systems can be estimated by a reduction and reoccurrence technique. The data allow researchers to infer rates of virus-mediated microbial mortality in aquatic systems.

تقدير معدلات الإنتاج الفيروسات في النظم المائية

Viruses are pervasive components of marine and freshwater systems, and are known to be significant agents of microbial mortality. Developing quantitative ...

Immunology and Infection

Unraveling the Unseen Players in the Ocean - A Field Guide to Water Chemistry and Marine Microbiology

Here we introduce a series of thoroughly tested and well standardized research protocols adapted for use in remote marine environments. The sampling protocols include the assessment of resources available to the microbial community (dissolved organic carbon, particulate organic matter, inorganic nutrients), and a comprehensive description of the viral and bacterial communities (via direct viral and microbial counts, enumeration of autofluorescent microbes, and construction of viral and microbial metagenomes). We use a combination of methods, which represent a dispersed field of scientific disciplines comprising already established protocols and some of the most recent techniques developed. Especially metagenomic sequencing techniques used for viral and bacterial community characterization, have been established only in recent years, and are thus still subjected to constant improvement. This has led to a variety of sampling and sample processing procedures currently in use. The set of methods presented here provides an up to date approach to collect and process environmental samples. Parameters addressed with these protocols yield the minimum on information essential to characterize and understand the underlying mechanisms of viral and microbial community dynamics. It gives easy to follow guidelines to conduct comprehensive surveys and discusses critical steps and potential caveats pertinent to each technique.

Here, we present a comprehensive protocol to assess the organic and inorganic nutrient availability and the abundance and structure of microbial and viral communities in remote marine environments.

كشف اللاعبين غير مرئي في المحيط - دليل ميداني للكيمياء المياه وعلم الأحياء المجهرية البحرية

Here we introduce a series of thoroughly tested and well standardized research protocols adapted for use in remote marine environments. The sampling ...

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. II. Total Culturable Virus Assay

A standardized method is required when national studies on virus occurrence in environmental and drinking waters utilize multiple analytical laboratories. The U.S Environmental Protection Agency&#8217;s (USEPA) Method 1615 was developed with the goal of providing such a standard for measuring Enterovirus and Norovirus in these waters. Virus is concentrated from water using an electropositive filter, eluted from the filter surface with beef extract, and then concentrated further using organic flocculation. Herein we present the protocol from Method 1615 for filter elution, secondary concentration, and measurement of total culturable viruses. A portion of the concentrated eluate from each sample is inoculated onto ten replicate flasks of Buffalo Green Monkey kidney cells. The number of flasks demonstrating cytopathic effects is used to quantify the most probable number (MPN) of infectious units per liter. The method uses a number of quality controls to increase data quality and to reduce interlaboratory and intralaboratory variation. Laboratories must meet defined performance standards. Method 1615 was evaluated by examining virus recovery from reagent-grade and ground waters seeded with Sabin poliovirus type 3. Mean poliovirus recoveries with the total culturable assay were 111% in reagent grade water and 58% in groundwaters.

Here we present a procedure to measure total culturable viruses using the Buffalo Green Monkey kidney cell line. The procedure provides a standardized tool for measuring the occurrence of infectious viruses in environmental and drinking waters.

وكالة حماية البيئة الطريقة 1615. قياس الفيروسة المعوية وقوع نوروفيروس في المياه عن طريق الثقافة وRT-QPCR. II. مجموع زروع الفحص الفيروسات

A standardized method is required when national studies on virus occurrence in environmental and drinking waters utilize multiple analytical laboratories. ...

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. Part III. Virus Detection by RT-qPCR

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a standardized method for use in multiple analytical laboratories during monitoring period 3 of the Unregulated Contaminant Monitoring Rule. Herein we present the protocol for extraction of viral ribonucleic acid (RNA) from water sample concentrates and for quantitatively measuring enterovirus and norovirus concentrations using reverse transcription-quantitative PCR (RT-qPCR). Virus concentrations for the molecular assay are calculated in terms of genomic copies of viral RNA per liter based upon a standard curve. The method uses a number of quality controls to increase data quality and to reduce interlaboratory and intralaboratory variation. The method has been evaluated by examining virus recovery from ground and reagent grade waters seeded with poliovirus type 3 and murine norovirus as a surrogate for human noroviruses. Mean poliovirus recoveries were 20% in groundwaters and 44% in reagent grade water. Mean murine norovirus recoveries with the RT-qPCR assay were 30% in groundwaters and 4% in reagent grade water.

Here we present a procedure to quantify enterovirus and norovirus in environmental and drinking waters using reverse transcription-quantitative PCR. Mean virus recovery from groundwater with this standardized procedure from EPA Method 1615 was 20% for poliovirus and 30% for murine norovirus.

EPA الطريقة 1615. قياس الفيروسة المعوية ونوروفيروس التواجد في المياه عن طريق الثقافة وRT-QPCR. الجزء الثالث. كشف الفيروس عن طريق RT-QPCR

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a ...

Cost-effective Method for Microbial Source Tracking Using Specific Human and Animal Viruses

Microbial contamination of the environment represents a significant health risk. Classical bacterial fecal indicators have shown to have significant limitations, viruses are more resistant to many inactivation processes and standard fecal indicators do not inform on the source of contamination. The development of cost-effective methods for the concentration of viruses from water and molecular assays facilitates the applicability of viruses as indicators of fecal contamination and as microbial source tracking (MST) tools. Adenoviruses and polyomaviruses are DNA viruses infecting specific vertebrate species including humans and are persistently excreted in feces and/or urine in all geographical areas studied. In previous studies, we suggested the quantification of human adenoviruses (HAdV) and JC polyomaviruses (JCPyV) by quantitative PCR (qPCR) as an index of human fecal contamination. Recently, we have developed qPCR assays for the specific quantification of porcine adenoviruses (PAdV) and bovine polyomaviruses (BPyV) as animal fecal markers of contamination with sensitivities of 1-10 genome copies per test tube. In this study, we present the procedure to be followed to identify the source of contamination in water samples using these tools. As example of representative results, analysis of viruses in ground water presenting high levels of nitrates is shown.
Detection of viruses in low or moderately polluted waters requires the concentration of the viruses from at least several liters of water into a much smaller volume, a procedure that usually includes two concentration steps in series. This somewhat cumbersome procedure and the variability observed in viral recoveries significantly hamper the simultaneous processing of a large number of water samples.
In order to eliminate the bottleneck caused by the two-step procedures we have applied a one-step protocol developed in previous studies and applicable to a diversity of water matrices. The procedure includes: acidification of ten-liter water samples, flocculation by skimmed milk, gravity sedimentation of the flocculated materials, collection of the precipitate and centrifugation, resuspension of the precipitate in 10 ml phosphate buffer. The viral concentrate is used for the extraction of viral nucleic acids and the specific adenoviruses and polyomaviruses of interest are quantified by qPCR. High number of samples may be simultaneously analyzed using this low-cost concentration method.
The procedure has been applied to the analysis of bathing waters, seawater and river water and in this study, we present results analyzing groundwater samples. This high-throughput quantitative method is reliable, straightforward, and cost-effective.

The study describes a cost-effective method for the identification of the source of fecal/urine contamination or contamination by nitrates in water using qPCR for the specific quantification of human/porcine/bovine DNA viruses, adenoviruses and polyomaviruses, proposed as MST tools.

طريقة فعالة من حيث التكلفة لتعقب مصدر الميكروبات عن طريق محددة الفيروسات البشرية والحيوانية

Microbial contamination of the environment represents a significant health risk. Classical bacterial fecal indicators have shown to have significant ...

Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. Several downstream applications require large quantities of pure viral DNA, which is provided by this protocol. These applications include viral genome sequencing, where the removal of host DNA is crucial to optimize data output for viral sequences, and the production of new viral recombinant strains, where co-transfection of purified plasmid and linear viral DNA facilitates recombination.1,2,3 
This procedure utilizes a combination of extractions and density-based centrifugation to isolate purified linear herpesvirus nucleocapsid DNA from infected cells.4,5 The initial purification steps aim to isolate purified viral capsids, which contain and protect the viral DNA during the extractions and centrifugation steps that remove cellular proteins and DNA. Lysis of nucleocapsids then releases viral DNA, and two final phenol-chloroform steps remove remaining proteins. The final DNA captured from solution is highly concentrated and pure, with an average OD260/280 of 1.90. Depending on the quantity of infected cells used, yields of viral DNA range from 150-800 &mu;g or more. The purity of this DNA makes it stable during long-term storage at 4C. This DNA is thus ideally suited for high-throughput sequencing, high fidelity PCR reactions, and transfections. 
Prior to beginning the protocol, it is important to know the average number of cells per dish (e.g. an average of 8 x 106 PK-15 cells in a confluent 15 cm dish), and the titer of the viral stock to be used (e.g. 1 x 108 plaque-forming units per ml). These are necessary to calculate the appropriate multiplicity of infection (MOI) for the protocol.6 For instance, to infect one 15 cm dish of PK-15 cells with the above viral stock, at an MOI of 5, you would use 400 &mu;l of viral stock and dilute it with 3.6 ml of medium (total inoculation volume of 4 ml for one 15 cm plate).
Multiple viral DNA preparations can be prepared at the same time. The number of simultaneous preparations is limited only by the number of tubes held by the ultracentrifuge rotor (one per virus; see step 3.9 below). Here we describe the procedure as though being done for one virus.

We describe the process of isolating high purity herpesvirus nucleocapsid DNA from infected cells. The final DNA captured from solution is of high concentration and purity, making it ideally suited for high-throughput sequencing, high fidelity PCR reactions, and transfections to produce new viral recombinants.

إعداد الحمض النووي الفيروسي من Nucleocapsids

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. ...

Glass Wool Filters for Concentrating Waterborne Viruses and Agricultural Zoonotic Pathogens

The key first step in evaluating pathogen levels in suspected contaminated water is concentration. Concentration methods tend to be specific for a particular pathogen group, for example US Environmental Protection Agency Method 1623 for Giardia and Cryptosporidium1, which means multiple methods are required if the sampling program is targeting more than one pathogen group. Another drawback of current methods is the equipment can be complicated and expensive, for example the VIRADEL method with the 1MDS cartridge filter for concentrating viruses2. In this article we describe how to construct glass wool filters for concentrating waterborne pathogens. After filter elution, the concentrate is amenable to a second concentration step, such as centrifugation, followed by pathogen detection and enumeration by cultural or molecular methods. The filters have several advantages. Construction is easy and the filters can be built to any size for meeting specific sampling requirements. The filter parts are inexpensive, making it possible to collect a large number of samples without severely impacting a project budget. Large sample volumes (100s to 1,000s L) can be concentrated depending on the rate of clogging from sample turbidity. The filters are highly portable and with minimal equipment, such as a pump and flow meter, they can be implemented in the field for sampling finished drinking water, surface water, groundwater, and agricultural runoff. Lastly, glass wool filtration is effective for concentrating a variety of pathogen types so only one method is necessary. Here we report on filter effectiveness in concentrating waterborne human enterovirus, Salmonella enterica, Cryptosporidium parvum, and avian influenza virus.

Glass wool filters have been used to concentrate waterborne viruses by a number of research groups around the world. Here we show a simple approach for constructing glass wool filters and demonstrate the filters are also effective in concentrating waterborne viral, bacterial and protozoan pathogens.

مرشحات الصوف الزجاجي للفيروسات التي تنتقل عن طريق التركيز ومسببات الأمراض الحيوانية المنشأ الزراعي

The key first step in evaluating pathogen levels in suspected contaminated water is concentration.  Concentration methods tend to be specific for a ...

Concentration of Virus Particles from Environmental Water and Wastewater Samples Using Skimmed Milk Flocculation and Ultrafiltration

Water and wastewater-based epidemiology have emerged as alternative methods to monitor and predict the course of outbreaks in communities.&#160;The recovery of microbial fractions, including viruses, bacteria, and microeukaryotes from wastewater and environmental water samples&#160;is one of the challenging steps in these approaches. In this study, we focused on the recovery efficiency of sequential ultrafiltration and skimmed milk flocculation (SMF) methods using Armored RNA as a test virus, which is also used as a control by some other studies. Prefiltration with 0.45 &#181;m and 0.2 &#181;m membrane disc filters were applied to eliminate solid particles before ultrafiltration to prevent the clogging of ultrafiltration devices. Test samples, processed with the sequential ultrafiltration method, were centrifuged at two different speeds. An increased speed resulted in lower recovery and positivity rates of Armored RNA.&#160;On the other hand, SMF resulted in relatively consistent recovery and positivity rates of Armored RNA. Additional tests conducted with environmental water samples demonstrated the utility of SMF to concentrate other microbial fractions. The partitioning of viruses into solid particles might have an impact on the overall recovery rates, considering the prefiltration step applied before the ultrafiltration of wastewater samples. SMF with prefiltration performed better when applied to environmental water samples&#160;due to lower solid concentrations in the samples and thus lower partitioning rates to solids. In the present study, the idea of using a sequential ultrafiltration method arose from the necessity to decrease the final volume of the viral concentrates during the COVID-19 pandemic, when the supply of the commonly used ultrafiltration devices was limited, and there was a need for the development of alternative viral concentration methods.

Virus concentration from environmental water and wastewater samples is a challenging task, carried out primarily for the identification and quantification of viruses. While several virus concentration methods have been developed and tested, we demonstrate here the effectiveness of ultrafiltration and skimmed milk flocculation for RNA viruses with different sample types.

تركيز جزيئات الفيروس من عينات المياه البيئية ومياه الصرف الصحي باستخدام تلبد الحليب منزوع الدسم والترشيح الفائق

Water and wastewater-based epidemiology have emerged as alternative methods to monitor and predict the course of outbreaks in communities.&#160;The ...

Lentivirus Production

RNA interference (RNAi) is a system of gene silencing in living cells. In RNAi, genes homologous in sequence to short interfering RNAs (siRNA) are silenced at the post-transcriptional state. Short hairpin RNAs, precursors to siRNA, can be expressed using lentivirus, allowing for RNAi in a variety of cell types. Lentiviruses, such as the Human Immunodeficiency Virus, are capable to infecting both dividing and non-dividing cells. We will describe a procedure which to package lentiviruses. Packaging refers to the preparation of competent virus from DNA vectors. Lentiviral vector production systems are based on a 'split' system, where the natural viral genome has been split into individual helper plasmid constructs. This splitting of the different viral elements into four separate vectors diminishes the risk of creating a replication-capable virus by adventitious recombination of the lentiviral genome. Here, a vector containing the shRNA of interest and three packaging vectors (p-VSVG, pRSV, pMDL) are transiently transfected into human 293 cells. After at least a 48-hour incubation period, the virus containing supernatant is harvested and concentrated. Finally, virus titer is determined by reporter (fluorescent) expression with a flow cytometer.

To make lentiviruses, DNA vectors are transfected into human 293 cells. After harvest and concentrating the supernatant, virus titer is determined by fluorescence expression with a flow cytometer.

الفيروسة البطيئة الإنتاج

RNA interference (RNAi) is a system of gene silencing in living cells. In RNAi, genes homologous in sequence to short interfering RNAs (siRNA) are ...

Biology

A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis

The isolation of giant viruses is of great interest in this new era of virology, especially since these giant viruses are related to protists. Giant viruses may be potentially pathogenic for many species of protists. They belong to the recently described order of Megavirales. The new lineage Faustovirus that has been isolated from sewage samples is distantly related to the mammalian pathogen African swine fever virus. This virus is also specific to its amoebal host, Vermamoeba vermiformis, a protist common in health care water systems. It is crucial to continue isolating new Faustovirus genotypes in order to enlarge its genotype collection and study its pan-genome. We developed new strategies for the isolation of additional strains by improving the use of antibiotic and antifungal combinations in order to avoid bacterial and fungal contaminations of the amoeba co-culture and favoring the virus multiplication. We also implemented a new starvation medium to maintain V. vermiformis in optimal conditions for viruses co-culture. Finally, we used flow cytometry rather than microscopic observation, which is time-consuming, to detect the cytopathogenic effect. We obtained two isolates from sewage samples, proving the efficiency of this method and thus widening the collection of Faustoviruses, to better understand their environment, host specificity and genetic content.

A Rapid Strategy for the Isolation of New Faustoviruses from Environmental Samples Using Vermamoeba vermiformis

We describe here the latest advances in viral isolation for the characterization of new genotypes of Faustovirus, a new asfarvirus-related lineage of giant viruses. This protocol can be applied to the high throughput isolation of viruses, especially giant viruses infecting amoeba.

استراتيجية السريع لعزل Faustoviruses الجديد من العينات البيئية عن طريق<em&gt; الدودي Vermamoeba</em

The isolation of giant viruses is of great interest in this new era of virology, especially since these giant viruses are related to protists. Giant ...