The authors acknowledge funding sources from D&#8217;Youville College School of Pharmacy, Buffalo, NY.

1. Preparare i supporti differenti e componenti aggiuntivi <ol><li> Prima di sperimentare, preparare supporti costituito da DMEM o altri supporti specificati con l&#39;aggiunta di una normale FBS, carbone spogliato FBS, o carbone spogliato FBS più il componente da testare. Si noti che più componenti possono essere testati in ogni esperimento. </li><li> Pesare e diluire gli ormoni, fattori di crescita, citochine o opportunamente essere disciolti nel siero carbone spogliato alla concentrazione fisiologica. </li></ol> 2. Preparare il collagene Matrix on Ice <ol><li> Preparare 2 ml di collagene I matrice a 2,2 mg / ml aggiungendo i seguenti componenti filtrati sterili su ghiaccio: 200 ml 10x PBS (pH 7.4), 5,4 ml 1 N NaOH, 600 ml di doppia H 2 O distillata e 1,2 ml di collagene I (a 3,63 mg / ml). </li><li> Tenere soluzione collagene I in ghiaccio fino alla piastra. </li></ol> 3. Preparare piatti Migration / Invasion per test &lt;/ P&gt; <ol><li> Per ciascuna linea cellulare da testare, utilizzare una piastra camera 24 pozzetti in cui 12-pozzetti contengono inserti. Utilizzare aggiuntivi 12 pozzetti che non contengono inserti per aggiungere i media chemiotattico e trasferire gli inserti per il set up sperimentale. NOTA: una matrice di collagene su piastre con un polietilene teraphthalate (PET) di membrana e 8 micron dimensione dei pori è ottimale per le linee di cellule usano qui. Tuttavia, una matrice matrigel in lastre pretrattata può anche essere sostituito con la dimensione dei pori diminuita secondo la linea cellulare indagato. </li><li> Chiaramente etichettare il piatto, con 3 pozzi per condizione di essere analizzati (migrazione FBS, migrazione CS-FBS, FBS invasione, e CS-FBS invasione e FBS-migrazione per un controllo, linea cellulare non invasiva). Migrazione Assay dal movimento attraverso i pori in una membrana PET, e dosaggio invasione di movimento attraverso una matrice di collagene o matrigel e poi attraverso i pori nella membrana. Utilizzare diversi marcatori di colore per ogni condizione cella a unaid nel processo di placcatura. </li></ol> 4. Distribuire l&#39;invasione Matrix <ol><li> Pipettare attentamente 75 microlitri della soluzione di matrice di collagene negli inserti da utilizzare per saggi di invasione. Usare cautela per evitare le bolle. Disperse bolle applicando una punta della pipetta invertita alla superficie. </li><li> Trasferire la piastra con inserti collagene rivestite a CO 2 incubatore 37 ° C e 5% per 30 minuti per consentire il gel a solidificare. </li></ol> 5. Piatto celle sulla membrana o Invasion Matrix <ol><li> Nel frattempo, trypsinize cellule e aggiungono media con il 10% FBS. Celle Spin a 200 xg per 5 minuti in una centrifuga da tavolo e risciacquo 3x in media liberi di siero. </li><li> Risospendere in media liberi siero. Contare le cellule con un emocitometro o contatore presentazione automatica. Aggiungi mezzi di comunicazione liberi di siero a una concentrazione finale di 5 x 10 4 cellule / ml. </li><li> Quando la matrice di collagene è solidificato (dopo 30 min), aggiungere 700 ml di media con entrambi2% FBS o definiti carbone-spogliati FBS a ciascun bene. Dei 12 inserti per piastra: <ul><li> 3 inserti hanno collagene e pozzi con i media + 2% FBS </li><li> 3 inserti hanno collagene e pozzi con i media + 2% CS-FBS </li><li> 3 inserti non hanno collagene e pozzi con i media + 2% FBS </li><li> 3 inserti non hanno collagene e pozzi con i media + 2% CS-FBS </li></ul><ol><li> Utilizzare piastre aggiuntive a seconda del numero di fattori da testare e con un controllo senza collagene corrispondente a ciascuna condizione. </li></ol></li><li> Aggiungi sospensione cellulare agli inserti a 5 x 10 4 cellule / ml, placcatura 500 cellule microlitri per inserto in tutti gli inserti di migrazione e invasione. </li><li> Incubare le cellule per 22 ore a 37 ° C. </li></ol> 6. quantificare il numero di Migrazione e cellule invasori <ol><li> Impostare colorazione dei pozzetti con metanolo fissante, eosina, e hemotoxylin, in pozzetti separati. </li><li> Usare tamponi di cotone per rimuovere le cellule e la matrice di ogni bene.Rrepeat con seconda domanda tampone per ogni bene. </li><li> Con pinze, immergere ogni inserto 5 volte per 1 sec in ciascuna delle 3 soluzioni in successione. </li><li> Lasciare asciugare inserti O / N. </li><li> Entrambi i) rimuovere i filtri con un bisturi, tagliare con cura intorno ai bordi e montare su un vetrino con coprioggetto e immersione in olio, o ii) consentire gli inserti asciugare O / N invertita e utilizzare gli inserti direttamente per la microscopia. </li><li> Il giorno successivo, visualizzare diapositive o inserti al microscopio con un obiettivo 20X e prendere 5 immagini provenienti da diverse regioni del filtro. Per migliorare la coerenza, prendere 4 campi esterni e uno centrale. </li><li> Contare le cellule per tutte le condizioni utilizzando il software ImageJ e applicare le formule seguenti. </li><li> Determinare la percentuale invasione come segue: Media # di cellule che invadono attraverso collagene inserisco = a Media # di cellule che migrano attraverso inserti di controllo = b Invasion% = (a / b) * 100 </li><li> Determinare l&#39;Indice Invasion in 2% FBS come segue: % Invasione delle cellule essere analizzato (in 2% FBS) = c % Invasione delle cellule non invasivi di controllo in (2% FBS) = d Invasion Index (FBS) = (c / d) </li><li> Determinare l&#39;indice Invasion in 2% CS-FBS come segue: % Invasione delle cellule essere analizzato (in 2% CS-FBS) = e % Invasione delle cellule di controllo non invasivi in ​​(2% CS-FBS) = f Invasion Index (CS-FBS) = (E / F) </li></ol> 7. Ripetere protocollo sperimentale Paragonando Charcoal-spogliato FBS a FBS Charcoal-stripped + X n con più fattori combinati <ol><li> Ripetere la procedura più volte necessario utilizzando diversi componenti per &quot;X&quot; o una combinazione di componenti. </li><li> Applicare i calcoli per determinare il contributo di ciascun fattore &quot;X&quot; per gli effetti di migrazione e invasione. </li></ol>

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</ol>

The authors have nothing to disclose.

Metastasi tumorali è un processo a più fasi. Le cellule devono attraversare la membrana basale, intravasate in nessuna delle due il sistema linfatico o di sangue microvasi, in cui sono trasportati in siti distanti. Le cellule tumorali quindi stravaso e colonizzano in un macrometastasis 12. La progressione attraverso l&#39;epitelio di transizione mesenchimale (EMT), invasione tumorale, e metastasi è stato migliorato dagli ormoni steroidei 13,14, fattori di crescita 15-18, e 19-21 citochine. Queste molecole sono così importanti per affrontare il percorso di segnalazione di progressione del tumore, che lo sviluppo di un test per affrontare il loro ruolo nel tumore potenziale invasivo è un passo importante verso decifrare le vie di segnalazione intricati. Questo test di utilizzo di siero carbone-spogliato ha un vantaggio rispetto ai metodi esistenti perché mira a identificare la forza trainante per cui il tumore delle cellule migrano. Un test precedente hastato pubblicato utilizzando normali fibroblasti mammari primari in camere invasione. In questo studio, gli autori hanno usato mezzi carbone-spogliato e ha aggiunto di nuovo in camera di estrogeni Matrigel che non causano invasione come previsto dal momento che le cellule non erano cancerogeno. Tuttavia, la presenza di mezzi-macrofagi condizionata in presenza o assenza di estrogeni aumentato significativamente invasione e in misura simile 22. Mentre questo test era simile che ha usato saggi di invasione con siero carbone-spogliato in assenza o presenza di estrogeni, non era un saggio di tumore ed è stato diretto allo studio delle interazioni tra paracrini macrofagi e fibroblasti 22. Un altro test utilizzato supporti carbone-spogliato per mostrare che l&#39;aggiunta di bassi livelli di estrogeni aumenta la proliferazione delle cellule del cancro al seno, ma ha causato resistenza agli inibitori delle chinasi 23. Il nostro studio è unico in quanto è un saggio di invasione applicabile a vari tipi di cellule tumorali progettati per studiare laeffetto dei singoli ormoni, fattori di crescita e citochine, da soli o in combinazione. Inoltre, fatta salva la letteratura disponibile, abbiamo determinato le concentrazioni di ormone necessario per aggiungere al siero carbone-spogliato di raggiungere livelli fisiologicamente rilevanti (Tabella 1). L&#39;aggiunta del componente singolo, &quot;X&quot; a livelli normalmente presenti nel siero è un parametro critico del saggio. Mentre questo test può sembrare essere limitato dai livelli pubblicati di ormoni, fattori di crescita e citochine nel siero, il ricercatore può utilizzare saggi ELISA per determinare i livelli di fattori addizionali. Mentre il protocollo è specifico per l&#39;utilizzo di collagene I, matrigel potrebbe anche essere sostituito se il ricercatore è stato sempre utilizzato quella matrice. La ragione preferiamo utilizzare collagene I è perché è un singolo componente che è definita ed è il principale componente del derma. Inoltre, utilizziamo 75 ml di 100 μg / ml di collagene per rendere la matrice invasione. Questo può anche essere modificato per ottenere i risultati desiderati. È migliore per ottimizzare la concentrazione in modo che un numero ragionevole di cellule può essere contato sui filtri. Se le cellule sono altamente invasiva, può essere meglio usare 100 ml di collagene I per la matrice o per aumentare la concentrazione di collagene. Anche se questa tecnica può aiutare lo sperimentatore di ottenere informazioni importanti, che è utile solo se le cellule tumorali invadono verso un chemoattractant che viene rimosso dal carbone-strippaggio del siero. Se non vi è alcuna differenza tra i risultati di controllo e siero di carbone-spogliato, quindi il test non varrebbe la pena perseguire. Il saggio affronta anche i risultati per chemioattrattanti individuali e soppressori di chemiotassi. Inoltre, nel confronto dei possibili risultati (figura 3), abbiamo utilizzato la deviazione standard come il livello di errore sperimentale accettato per ogni esperimento. Tuttavia, l&#39;attuale values possono essere determinate dallo sperimentatore in base alla deviazione standard o errore standard e un valore significativo p. Inoltre, le informazioni raccolte da questo test potrebbe rivelarsi utile nella progettazione di inibitori farmacologici a determinate vie di segnalazione. Per esempio, se una o più ormoni, fattori di crescita, citochine e / o si trova ad essere implicati nel meccanismo di invasione per una particolare mutazione cellula tumorale, che un agente farmacologico esistente può essere usato o un nuovo farmaco progettato per inibire quel percorso. Il test è anche uno strumento efficace per lo studio della particolare mutazione tumore e se modifica il residuo amminoacidico o la sua posizione mantiene la stessa affinità per il fattore chemiotattico che è stato identificato da questo test. In questo modo, la nostra dosaggio offre un nuovo approccio per fornire indizi al meccanismo invasione delle cellule tumorali e possibilmente metodi per prevenire l&#39;invasione tumorale.

Un test invasione romanzo è stato sviluppato con l&#39;obiettivo di individuare il coinvolgimento di specifici ormoni, citochine e / o fattori di crescita come fattori chemiotattici di invasione delle cellule del cancro. La capacità delle cellule tumorali di invadere attraverso la matrice extracellulare (ECM) è una caratteristica del fenotipo metastatico 1-3. Camere Invasion sono stati ampiamente utilizzati come strumenti in vitro per studiare l&#39;invasione delle cellule tumorali e la migrazione e possono fornire conoscenze ai meccanismi di in vivo invasione tumorale e metastasi. Le camere sono costituiti da inserti di coltura cellulare cilindrici annidati all&#39;interno dei pozzetti di piastre di coltura cellulare. Le parti inferiori degli inserti sono policarbonato o polistirolo membrane semi-permeabili di dimensioni dei pori definiti. Nel saggio di invasione di serie, le cellule vengono seminate su membrana inserto con siero media liberi e collocati in pozzetti di coltura cellulare che sono pieni di siero o siero-come fattori chemiotattici per set una forza chemoattractive. Questa unità forza cellule di muoversi attraverso la membrana (migrazione) semipermeabile o in alternativa, attraverso un rivestimento di matrice extracellulare (invasione), che possono poi essere colorato con coloranti convenzionali per rilevare e quantificare il numero di cellule. Il numero di cellule viene quindi normalizzato secondo l&#39;entità della migrazione e l&#39;invasione in una linea cellulare non invasivo. Questo metodo consente un investigatore di valutare il potenziale invasivo di tipi cellulari diversi sotto una varietà di condizioni, tra manipolazioni genetiche. Ormoni, citochine e fattori di crescita sono componenti critici di siero e sono sempre più dimostrato di essere associato con la guida del fenotipo invasivo 4. Tuttavia, la natura, il ruolo e la specificità di queste molecole siero chemoattractive a mediare invasione rimangono ancora sfuggente. La sfida rimane per determinare quali fattori specifici nel siero o siero-like chemioattrattanti sono responsabili per la guidal&#39;invasione delle cellule del cancro così come quello che le molecole possono inibire il processo di invasione. In questo rapporto, si descrive un metodo per valutare il potenziale coinvolgimento di ormoni, citochine e / o fattori di crescita presenti nel siero, come molecole guida la chemiotassi e l&#39;invasione delle cellule tumorali. In questo protocollo modificato proposto, carbone strippaggio viene utilizzato per rimuovere ormoni, citochine e fattori di crescita da siero bovino fetale 2% (FBS) per generare 2% carbone spogliato FBS (CS-FBS). Entrambi 2% FBS e 2% CS-FBS sono usati come agenti per impostare la forza chemoattractive di guidare l&#39;invasione delle cellule di cancro. Utilizzando 2% CS-FBS come agente chemoattractive rispetto al normale 2% FBS offre diversi vantaggi tra cui in primo luogo e più prominente, la capacità di studiare il fenotipo cancro invasione nel ridotto / relativa assenza di ormoni, citochine e fattori di crescita. Consente inoltre il ricercatore di valutare se la rimozione collettiva di ormoni, fattori di crescita, e cytokines provoca un aumento o una diminuzione nell&#39;indice invasiva. Il saggio viene quindi progettato per determinare se l&#39;aggiunta di un singolo componente, designato come &quot;X&quot; può inibire, riduzione o aumento o ripristinare l&#39;indice invasivo al suo valore originale (vedi figure 2 e 3). Anche se questo metodo è specifico per raggiungere i livelli fisiologici del componente che viene rimosso dal siero durante carbone strippaggio, va anche notato che il carbone strippaggio può anche compromettere le vie di trasduzione del segnale. Ad esempio, è stato riportato che il carbone strippaggio può diminuire l&#39;attività della fosfatasi alcalina di cellule osteoprogenitrici e indurre adipogenesi attraverso la riduzione di attivatori MAPK 5. Carbone supporti spogliato sono disponibili in commercio e sono basate sul protocollo delineato che combina con carbone destrano e incubate con siero fetale bovino O / N 6. Questo test è stato sviluppato in RESPONSE ad un risultato riportato da Zucker et al. 7 Gli autori hanno dimostrato che un fenotipo mutante colpisce comunicazione gap junction dimostrato un aumento dell&#39;indice di invasione durante la migrazione verso media con normale 2% FBS. Tale aumento è stato eliminato con la sostituzione di siero carbone-spogliato. Da questo risultato, gli autori hanno concluso che la migrazione interessato mutante verso una molecola lipofila (più specificamente, un ormone, fattore di crescita o citochine) 7. È ben noto che gli ormoni, fattori di crescita e citochine mediano vie di segnalazione coinvolte nella promozione del tumore e l&#39;invasione 4. Pertanto, è importante per gli investigatori scientifici per determinare quale fattore (s) stanno guidando l&#39;invasione tumorale dei loro particolari cellule tumorali o mutanti sotto studio. Il saggio è progettato per affrontare il ruolo dei singoli componenti al loro concentrazioni fisiologiche come determinato in base alla differenza tra la concentrazione del componente &amp;# 8220; X &quot;in normale FBS e il CS-FBS. Attraverso lo sviluppo di questo test, i ricercatori possono ottenere un quadro più chiaro il percorso invasivo specifica che disciplina il loro sistema. Ormoni, fattori di crescita e citochine sono stati spesso classificati come promotori tumorali 8. Alcuni di questi fattori come EGF sono utilizzati come fonti dirette per chemioattrattanti in camere invasione 9. Così, sembra probabile che questi rappresentano i principali componenti del siero che invasione tumorale diretta. Questo protocollo propone una semplice, ma significativa, modifica convenzionale vitro invasione test in cui consente un investigatore di valutare il coinvolgimento di ormoni, fattori di crescita e citochine nel mediare il potenziale invasivo delle cellule tumorali. Tuttavia, il saggio è progettato per fornire il ricercatore una risposta se il procedimento sarà efficace per il loro studio in un primo passo nell&#39;analisi, per non usare tempo prezioso e risorse se ritenute inutili. Questo metodo utilizza CS-FBS e si basa sulla discrezionalità investigatori su quale molecole di perseguire come candidati di piombo che potenzialmente mediano invasione delle cellule di cancro. I risultati di queste analisi dovrebbero rivelarsi utili per individuare quali componenti del siero servono come fattori chemiotattici o inibitori per la particolare linea cellulare o mutante in fase di studio. Inoltre, questo approccio può aiutare il ricercatore a identificare vie di segnalazione chiave o che promuovono o inibiscono l&#39;invasione delle cellule di cancro; indirizzando in tal modo il futuro sviluppo di farmaci.

<table><tbody><tr><td>BioCoat Control Inserts with 8.0 &amp;micro;m PET membrane</td><td>Corning</td><td>354578</td><td>12 in each of two 24-well plates. PET = polyethylene teraphthalate</td></tr><tr><td>Collagen I, rat tail</td><td>Corning</td><td>354236</td><td>Source = rat tail tendon, purity = 90%</td></tr><tr><td>Fixative; Diff-Quick</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NC9844047</td><td>Methanol-based fixative, hematoxylin/eosin</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Life Technologies</td><td>16000</td><td>Designated as FBS</td></tr><tr><td>Charcoal stripped fetal bovine serum</td><td>Life Technologies</td><td>12676</td><td>Designated as CS-FBS</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Thermo Scientific Hyclone</td><td>SH30070</td><td>Designated as FBS</td></tr><tr><td>Charcoal stripped fetal bovine serum</td><td>Thermo Scientific Hyclone</td><td>SH30068</td><td>Designated as CS-FBS</td></tr></tbody></table>

a modified in vitro invasion assay to determine the potential role of hormones, cytokines and/or growth factors in mediating cancer cell invasion

Siero del sangue funge da chemoattractant verso il quale le cellule tumorali migrano e invadono, facilitando il loro intravasation in microvasi. Tuttavia, le molecole reali verso cui le cellule migrano rimangono sfuggente. Questo test invasione modificato è stato sviluppato per identificare gli obiettivi che guidano la migrazione delle cellule e l&#39;invasione. Questa tecnica confronta l&#39;indice invasione in tre condizioni per determinare se un ormone specifico, fattore di crescita, citochine o gioca un ruolo nel mediare il potenziale invasivo di una cellula tumorale. Queste condizioni includono i) normale siero fetale bovino (FBS), ii), carbone-spogliato FBS (CS-FBS), che rimuove gli ormoni, fattori di crescita e citochine e iii) CS-FBS + molecola (denotato &quot;X&quot;). Un cambiamento significativo nella invasione delle cellule con CS-FBS rispetto al FBS, indica il coinvolgimento di ormoni, citochine e fattori di crescita nel mediare il cambiamento. Molecole individuali possono essere aggiunti nuovamente al CS-FBS per saggiare la capacità di riversetto o salvare il fenotipo invasione. Inoltre, due o più fattori possono essere combinati per valutare la effetti additivi o sinergici di più molecole in guida o inibire l&#39;invasione. In generale, questo metodo consente al ricercatore di determinare se ormoni, citochine e / o fattori di crescita svolgono un ruolo nella invasione delle cellule servendo come fattori chemiotattici o inibitori di invasione per un particolare tipo di cellula tumorale o un mutante specifica. Identificando chemioattrattanti e inibitori specifici, questo test invasione modificato può aiutare a chiarire vie di segnalazione che dirigono l&#39;invasione delle cellule tumorali.

L&#39;indice di invasione viene calcolato per ogni condizione secondo la normalizzazione di una linea cellulare non invasivo. Per i nostri esperimenti, utilizziamo la linea cellulare di melanoma 1205Lu e linee cellulari stabili varianti affermata come nostre linee invasive nonché la variante non invasivo premaligne, WM793 da cui le cellule sono state derivate 1205Lu 10 che serve da controllo logica. Utilizziamo anche il collagene I come la matrice invasione perché è la componente primaria del derma. Ciò è in accordo con uno studio precedente in cui la matrice ottimale invasione varia in base alla linea cellulare e il grado di concordanza con in vivo risultati 11. Questo test invasione è delineato schematicamente in base ai possibili risultati l&#39;investigatore potrebbe ottenere. Inizialmente, l&#39;indice di invasione per 2% FBS dovrebbe essere significativamente superiore o inferiore all&#39;indice invasione per CS-FBS al fine di perseguire questo dosaggio (figure 1 e 2). Se un incr significativofacilità o diminuzione nell&#39;indice invasione è evidente con carbone-spogliato FBS, questo test non è utile per il ricercatore (figure 2 e 3). Se questo aumento viene eliminato con carbone-spogliato FBS, l&#39;investigatore ha già la consapevolezza che l&#39;invasione maggiore è diretto verso un ormone, il fattore di crescita, o citochine (figure 2 e 3). Quindi, il ricercatore deve utilizzare le informazioni sul tipo di tumore specifico e la mutazione per determinare quale candidato (s) presentano meccanismi plausibili come chemoattractants. Il ricercatore può iniziare provando uno o più componenti singolarmente alla concentrazione fisiologica aggiungendo la componente alla differenza di concentrazione tra il 2% FBS e 2% CS-FBS (Tabella 1). Se un componente aggiunto siero carbonella-spogliato aumenta significativamente della diminuisce il potenziale invasione rispetto al siero carbone-spogliato soli, che candidato, &quot;X&quot;, può servire come un parziale osoccorritore completa, a seconda del grado di aumento (figure 2 e 3). Due o più componenti possono essere combinati per ottenere un aumento additivi o sinergici, (indicato come X 1 + X 2 + X 3 ...) (Figura 3). Un fattore che diminuisce il grado di invasione sarebbe classificato come un fattore inibitorio (figure 2 - 4). Nei nostri esperimenti, abbiamo dimostrato che l&#39;uso di una linea cellulare di melanoma mutante (1205Lu T154A) migrazione verso un chemiotattico con i suoi ormoni, fattori di crescita e citochine rimossi causato una diminuzione del tumore invasività. Tre ormoni sono stati testati per identificare un possibile &quot;X&quot;. Questi includono gli estrogeni (estradiolo), progesterone, e ormone tiroideo (T4). Due di questi ormoni non ha avuto effetto sull&#39;indice di invasione (progesterone e ormone tiroideo), mentre gli estrogeni è stato identificato come fattore inibitorio (Figura 4). Secondo i potenziali risultati di cui alFigura 3, i risultati sperimentali di questo esempio prova di una diminuzione della Condizione 2 e un&#39;inibizione della Condizione 3. È probabile che gli estrogeni sarà utilizzato ulteriormente in questo test, in quanto può essere importante nella identificazione di vie che sequestra alcuni fattori segnalazione per le future strategie di progettazione di droga. Ulteriori esperimenti saranno dirette a fattori di crescita e citochine per identificare altri componenti che possono servire come &quot;fenotipo di salvataggio&quot; chemioattrattanti pro-invasione. Identificazione di entrambe le molecole pro-invasive e inibitori possono collettivamente chiarire il potenziale invasivo per le linee cellulari e varianti mutanti sotto inchiesta. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/51480/51480fig1.jpg" /> Figura 1. Apparato sperimentale e la progettazione. Modello di set up per il processo sperimentale che mostra cellule placcato o sulla membrana PET direttamente o cstrato ollagen in media liberi siero. Le cellule sono o migrando o invadere attraverso la matrice di collagene verso un chemoattractant che viene modificato secondo il protocollo e descritto come Condizione 1, 2, e 3. Le celle migrati o invaso vengono poi fissate e colorate. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/51480/51480fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una più grande versione di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/51480/51480fig2.jpg" /> Figura 2. Potenziali risultati da una membrana risultato del test di invasione standard. Questo modello dimostra i potenziali risultati che il ricercatore può incontrare per il dosaggio invasione e come interpretare questi risultati. Ogni cerchio è risultato rappresentativo per un filtro colorato utilizzando le stesse condizioni che sono 3 illustrato in figura 1. Ogni punto rappresenta una cella che è passata attraverso l&#39;invasionematrice e macchiato sul fondo della membrana. Le cellule saranno adeguatamente quantificati e analizzati conseguenza. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/51480/51480fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/51480/51480fig3.jpg" /> Figura 3. interpretazione dati per l&#39;invasione con CS-FBS ± X. Questo schema illustra come i calcoli dell&#39;Indice Invasion determinano le conclusioni sperimentali. CS-FBS è il siero carbone-spogliato e X si riferisce alle singole componenti aggiunti ai media CS-FBS descritti nel testo. Gli autori impostare la deviazione standard (sd), come la variabilità accettato causa di un errore sperimentale nelle nostre condizioni. Tuttavia, a seconda delle condizioni in osservazione e il numero di repliche, questo fattore può essere regolata per essere nell&#39;intervallo statalistaimportanza iCal per il ricercatore. L&#39;esperimento può essere ripetuto con più molecole &quot;X&quot;, (indicata come X 1 + X 2 + X 3 ...). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/51480/51480fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/51480/51480fig4.jpg" /> Figura 4. i risultati del test di invasione. Il grafico mostra i risultati sperimentali ottenuti con un mutante linea cellulare variante 3 stabilito dal 1205Lu cellule di melanoma metastatico. Le concentrazioni degli ormoni aggiunti sono le seguenti: estrogeno (0,566 pg / ml), progesterone (0,001 ng / ml), l&#39;ormone tiroideo (0,283 mg / dl). Il controllo, linea cellulare non invasivo utilizzato per questi esperimenti era WM793B. Questo esperimento è stato ripetuto 3 volte con risultati simili, e un grafico rappresentativo è mostrato. <tableborder = cellpadding &quot;0&quot; = &quot;0&quot; cellspacing = &quot;0&quot;&gt; <tbody><tr><td colspan="2" style="padding-left:2px;padding-right:2px"></td><td style="width:41px"> Unità </td><td style="width:52px;padding-left:4px;padding-right:4px"> Definito FBS </td><td> CS FBS </td><td style="padding-left:4px;padding-right:2px"> Differenza </td><td style="width:70px"> [2% FBS] - [2% CS-FBS] </td><td style="width:85px"> Fonte </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td rowspan="5" style="padding-left:4px;padding-right:2px"> Ormoni </td><td style="padding-left:7px;padding-right:4px"> Estrogeni (estradiolo) </td><td> pg / ml </td><td> 28.30 </td><td> 8.76 </td><td> 19,540 </td><td> 0,566 </td><td rowspan="5"> Life Technologies FBS cat # 16000 cs FBS cat # 12676 </td><td> Sigma E2257 </td></tr><tr><td> Insulina </td><td> uiu / ml </td><td> 8.61 </td><td style="padding-left:4px;padding-right:2px"> inosservato </td><td> 8,610 </td><td> 0,172 </td><td> Sigma I3536 </td></tr><tr><td> Progesterone </td><td> ng / ml </td><td> 0.05 </td><td style="padding-left:4px;padding-right:2px"> inosservato </td><td> 0.050 </td><td> 0.001 </td><td> Sigma P8783 </td></tr><tr><td> Testosterone </td><td> ng / ml </td><td> 0.10 </td><td style="padding-left:4px;padding-right:2px"> inosservato </td><td> 0,100 </td><td> 0,002 </td><td> Sigma T1500 </td></tr><tr><td> Thyroid Hormone (T4) </td><td> ug / dl </td><td> 14.14 </td><td style="padding-left:4px;padding-right:2px"> inosservato </td><td> 14,140 </td><td> 0.283 </td><td> Sigma T1775 </td></tr><tr><td rowspan="3"> Fattori di crescita </td><td> IGF </td><td> ng / ml </td><td> 111.00 </td><td> 49.30 </td><td> 61.70 </td><td> 1.23 </td><td rowspan="3"> Thermo Scientific Hyclone <br/&gt; FBS Cat # SH30070 cs FBS Cat # SH30068 </td><td> Sigma I3769 </td></tr><tr><td> TGF-β </td><td> ng / ml </td><td> 12.60 </td><td> 7.30 </td><td> 5.30 </td><td> 0.11 </td><td> Sigma SRP3170 </td></tr><tr><td> FGF-2 </td><td> pg / ml </td><td> 37.30 </td><td> 32.70 </td><td> 4.60 </td><td> 0.09 </td><td> Sigma SRP4037 </td></tr><tr><td colspan="2"></td><td> Unità </td><td style="padding-left:6px;padding-right:2px"> Sieri umani </td><td colspan="3"></td><td> Fonte </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td rowspan="4" style="padding-left:4px;padding-right:2px"> Le citochine </td><td> G-CSF </td><td> pg / ml </td><td> 14.7 ± 13.2 </td><td colspan="3" rowspan="4"> N / A </td><td rowspan="4"> PMID: 21774806 </td><td> Sigma SRP3331 </td></tr><tr><td> GM-CSF </td><td> pg / ml </td><td> 40.9 ± 108,6 </td><td> Sigma SRP3201 </td></tr><tr><td> MCP 1 </td><td> pg / ml </td><td style="padding-left:7px;padding-right:4px"> 213,5 ± 100.7 </td><td> Sigma SRP3109 </td></tr><tr><td> TGF-α </td><td> pg / ml </td><td> 3.2 ± 4.0 </td><td> Sigma T7924 </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Esempi di intervalli di concentrazione di selezionare ormoni, fattori di crescita e citochine nei bovini e sieri umani. La differenza di concentrazione tra il 2% e il 2% FBS CS-FBS rappresenta la quantità aggiunta di raggiungere concentrazioni fisiologiche.

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A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion

This video article describes a modified in vitro method to examine the role of hormones, cytokines and/or growth factors in driving cancer cell invasion.

A Modified<em&gt; In vitro</em&gt; Invasion test per determinare il ruolo potenziale di ormoni, citochine e / o fattori di crescita nella mediazione Cancer Invasion cellulare

Blood serum serves as a chemoattractant towards which cancer cells migrate and invade, facilitating their intravasation into microvessels. However, the ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Medicine

A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion

10.7K Views.  Roswell Park Cancer Institute. This video article describes a modified in vitro method to examine the role of hormones, cytokines and/or growth factors in driving cancer cell invasion.

Video: A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. Traditional 3D assays such as the Boyden Chamber require that cells are displaced from the original culture location and moved to a new environment. Not only does this disrupt the cellular processes that are intrinsic to the microenvironment, but it often results in a loss of cells. These problems are especially challenging when dealing with cells that are either rare, or extremely sensitive to their microenvironment. Here, we describe the development of a 3D invasion assay that avoids both concerns. In this assay, cells are plated within a small well and an ECM matrix containing a chemoattractant is laid atop the cells. This requires no cell displacement, and allows the cells to invade upwards into the matrix. In this assay, cell invasion as well as cell morphology can be assessed within the collagen gel. Using this assay, we characterize the invasive capacity of rare and sensitive cells; the hybrid cells resulting from fusion between breast cancer cells MCF7 and mesenchymal/multipotent stem/stroma cells (MSCs).

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

This protocol describes an inverted vertical invasion assay that could be used to quantify the migration and invasion capabilities of cells in a three-dimensional setting while preserving the cell microenvironment. This assay is suitable for rare and/or sensitive cells.

Lo spostamento verso l'alto: Un semplice e flessibile In Vitro tridimensionale invasione protocollo di analisi

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

Spheroid Assay to Measure TGF-&#946;-induced Invasion

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis at later stage1,2. Moreover, TGF-&beta; is frequently overexpressed in breast cancer and its expression correlates with poor prognosis and metastasis 3,4. The mechanisms by which TGF-&beta; induces invasion are not well understood.
TGF-&beta; elicits its cellular responses via TGF-&beta; type II (T&beta;RII) and type I (T&beta;RI) receptors. Upon TGF-&beta;-induced heteromeric complex formation, T&beta;RII phosphorylates the T&beta;RI. The activated T&beta;RI initiates its intracellular canonical signaling pathway by phosphorylating receptor Smads (R-Smads), i.e. Smad2 and Smad3. These activated R-Smads form heteromeric complexes with Smad4, which accumulate in the nucleus and regulate the transcription of target genes5. In addition to the previously described Smad pathway, receptor activation results in activation of several other non-Smad signaling pathways, for example Mitogen Activated Protein Kinase (MAPK) pathways6.
To study the role of TGF-&beta; in different stages of breast cancer, we made use of the MCF10A cell system. This system consists of spontaneously immortalized MCF10A1 (M1) breast epithelial cells7, the H-RAS transformed M1-derivative MCF10AneoT (M2), which produces premalignant lesions in mice8, and the M2-derivative MCF10CA1a (M4), which was established from M2 xenografts and forms high grade carcinomas with the ability to metastasize to the lung9. This MCF10A series offers the possibility to study the responses of cells with different grades of malignancy that are not biased by a different genetic background.
For the analysis of TGF-&beta;-induced invasion, we generated homotypic MCF10A spheroid cell cultures embedded in a 3D collagen matrix in vitro (Fig 1). Such models closely resemble human tumors in vivo by establishing a gradient of oxygen and nutrients, resulting in active and invasive cells on the outside and quiescent or even necrotic cells in the inside of the spheroid10. Spheroid based assays have also been shown to better recapitulate drug resistance than monolayer cultures11. This MCF10 3D model system allowed us to investigate the impact of TGF-&beta; signaling on the invasive properties of breast cells in different stages of malignancy.

An assay to quantitatively measure Transforming Growth Factor (TGF)-&#x03B2;-induced invasion in 3-dimensional collagen gels is described. This assay takes advantage of the MCF10A series of cell lines, which represent different stages of breast cancer development. This method can be adopted to be used with other cell lines and might be used to investigate other potential activators or inhibitors of invasion.

Saggio sferoide Misura TGF-β-indotta Invasion

TGF-&beta; has opposing roles in breast cancer progression by acting as a tumor suppressor in the initial phase, but stimulating invasion and metastasis ...

Medicina

The Use of Mouse Mammary Tumor Cells in an In Vitro Invasion Assay as a Measure of Oncogenic Cell Behavior

The in vitro invasion assay uses a protein-rich matrix in a Boyden chamber to measure the ability of cultured cells to pass through the matrix and a porous membrane in a process analogous to the initial steps of cancer cell metastasis. The tested cells can be altered for the gene expression or treated with inhibitors to test for changes in the invasion potential. This experiment tests the aggressive phenotype of the mouse mammary tumor cells to discover and characterize the potential oncogenes that promote cell invasion. This technique, however, can be versatile and adapted to many different applications. The experiment itself can be done in one day and the results are acquired by light microscopy in less than a day. The results include counts of the number of invading cells for comparison and analysis. The in vitro invasion assay is a rapid, inexpensive, and clear-cut method for determining cell behavior in a culture that can be used as an initial assessment before more involved in vivo assays.

The in vitro cell invasion assay is used to measure the potential of cancer metastasis by quantifying the cellular potential for invasion and migration using cell culture inserts containing protein matrix. Cells are challenged to migrate through the protein matrix and a porous membrane, towards a chemoattractant, and then quantified by light microscopy.

L'uso di cellule tumorali mammarie del topo in un saggio di invasione in vitro come misura del comportamento cellulare oncogeno

The in vitro invasion assay uses a protein-rich matrix in a Boyden chamber to measure the ability of cultured cells to pass through the matrix and a ...

Genetica

Monitoring Cancer Cell Invasion and T-Cell Cytotoxicity in 3D Culture

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited number of assays allow for direct monitoring and mechanistic insights into the interactions between tumor and immune cells, amongst which, T-cells play a significant role in executing the cytotoxic response of the adaptive immune system to cancer cells. Most assays are based on two-dimensional (2D) co-culture of cells due to the relative ease of use but with limited representation of the invasive growth phenotype, one of the hallmarks of cancer cells. Current three-dimensional (3D) co-culture systems either require special equipment or separate monitoring for invasion of co-cultured cancer cells and interacting T-cells.
Here we describe an approach to simultaneously monitor the invasive behavior in 3D of cancer cell spheroids and T-cell cytotoxicity in co-culture. Spheroid formation is driven by enhanced cell-cell interactions in scaffold-free agarose microwell casts with U-shaped bottoms. Both T-cell co-culture and cancer cell invasion into type I collagen matrix are performed within the microwells of the agarose casts without the need to transfer the cells, thus maintaining an intact 3D co-culture system throughout the assay. The collagen matrix can be separated from the agarose cast, allowing for immunofluorescence (IF) staining and for confocal imaging of cells. Also, cells can be isolated for further growth or subjected to analyses such as for gene expression or fluorescence activated cell sorting (FACS). Finally, the 3D co-culture can be analyzed by immunohistochemistry (IHC) after embedding and sectioning. Possible modifications of the assay include altered compositions of the extracellular matrix (ECM) as well as the inclusion of different stromal or immune cells with the cancer cells.

The presented approach simultaneously evaluates cancer cell invasion in 3D spheroid assays and T-cell cytotoxicity. Spheroids are generated in a scaffold-free agarose multi-microwell cast. Co-culture and embedding in type I collagen matrix are performed within the same device which allows to monitor cancer cell invasion and T-cell mediated cytotoxicity.

Monitoraggio dell'invasione delle cellule tumorali e della citotossicità delle cellule T nella cultura 3D

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited ...

Assessment of Ovarian Cancer Spheroid Attachment and Invasion of Mesothelial Cells in Real Time

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not accurately model the behaviors of cancer cells within a nonadherent environment, as cancer cells inherently aggregate into multicellular structures which contribute to the metastatic process by attaching to and invading the peritoneal lining to form secondary tumors. To model this important stage of ovarian cancer metastasis, multicellular aggregates, or spheroids, can be generated from established ovarian cancer cell lines maintained under nonadherent conditions. To mimic the peritoneal microenvironment encountered by tumor cells in vivo, a spheroid-mesothelial co-culture model was established in which preformed spheroids are plated on top of a human mesothelial cell monolayer, formed over an extracellular matrix barrier. Methods were then developed using a real-time cell analyzer to conduct quantitative real time measurements of the invasive capacity of different ovarian cancer cell lines grown as spheroids. This approach allows for the continuous measurement of invasion over long periods of time, which has several advantages over traditional endpoint assays and more laborious real time microscopy image analyses. In short, this method enables a rapid, determination of factors which regulate the interactions between ovarian cancer spheroid cells invading through mesothelial and matrix barriers over time.

Ovarian cancer cell invasion into the mesothelial lining of the peritoneum is a dynamic process over time. Utilizing a real time analyzer, the invasive capacity of ovarian cancer cells in a spheroid-mesothelial cell co-culture model can be quantified over prolonged time periods, providing insights into factors regulating the metastatic process.

Valutazione del cancro ovarico Spheroid attaccamento e l&#39;invasione delle cellule mesoteliali in tempo reale

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not ...

Modelli 3D in Biologia del Cancro: Dinamiche di Invasione negli Eterosferoidi

Alternative Strategy to Analyze In Vitro Cell Invasion of 3D Cultures

Spheroid culture is a 3D model that provides an improved replication of the in vivo microenvironment compared to traditional two-dimensional (2D) cultures. Invasion is a cellular outcome of utmost interest in cancer biology. In this protocol, we have devised an alternative strategy for evaluating cancer cell invasion in vitro, employing heterospheroids comprised of oral squamous cell carcinoma (OSCC), cancer-associated fibroblasts (CAF), and monocytes. These heterospheroids aim to mimic the tumor microenvironment (TME), including two relevant non-neoplastic cell types alongside the cancer cells. Each cell type was labeled with vital fluorescent markers emitting in distinct wavelengths before spheroid formation. Once formed, heterospheroids were seeded onto a layer of human leiomyoma-derived extracellular matrix in the upper compartment of a microporous membrane. Invasion was assessed in the z-axis using confocal microscopy. Digital images were obtained in the corresponding fluorescent channels at 10 &#181;m intervals, covering a depth of 90 &#181;m in the z-axis. Analysis was performed using freeware image software by calculating the integrated fluorescence intensity in each image and fluorescence channel. This approach enables a more dynamic analysis of cell invasion patterns in a multilayered context, as well as the examination of spatial co-localization of different cell types during invasion.

Autore in primo piano: Decifrare il crosstalk tra cancro e cellule immunitarie durante la progressione del cancro della testa e del collo

Invasion is a major biological phenomenon in the development and progression of cancer. This process is influenced by non-neoplastic cells and components of the tumor microenvironment. The purpose of this study is to describe an alternative method for analyzing tumor cell invasion in vitro using three-dimensional (3D) cultures.

Strategia alternativa per analizzare l'invasione cellulare in vitro di colture 3D

Spheroid culture is a 3D model that provides an improved replication of the in vivo microenvironment compared to traditional two-dimensional (2D) ...

Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in particular (e.g., brain tumors such as glioblastoma multiforme and squamous cell carcinoma of the head and neck &#8211; SCCHN) it is a cause of severe morbidity and can be life-threatening even in the absence of distant metastases. In addition, cancers which have relapsed following treatment unfortunately often present with a more aggressive phenotype. Therefore, there is an opportunity to target the process of invasion to provide novel therapies that could be complementary to standard anti-proliferative agents. Until now, this strategy has been hampered by the lack of robust, reproducible assays suitable for a detailed analysis of invasion and for drug screening. Here we provide a simple micro-plate method (based on uniform, self-assembling 3D tumor spheroids) which has great potential for such studies. We exemplify the assay platform using a human glioblastoma cell line and also an SCCHN model where the development of resistance against targeted epidermal growth factor receptor (EGFR) inhibitors is associated with enhanced matrix-invasive potential. We also provide two alternative methods of semi-automated quantification: one using an imaging cytometer and a second which simply requires standard microscopy and image capture with digital image analysis.

Three-Dimensional 3D Tumor Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is a defining characteristic of malignant tumors. We provide here a simple, semi-automated micro-plate assay of invasion into a natural 3D biomatrix that has been exemplified with a number of models of advanced human cancers.

Tridimensionale (3D) Tumore Spheroid Invasion Assay

Invasion of surrounding normal tissues is generally considered to be a key hallmark of malignant (as opposed to benign) tumors. For some cancers in ...

Chick Heart Invasion Assay for Testing the Invasiveness of Cancer Cells and the Activity of Potentially Anti-invasive Compounds

The goal of the chick heart assay is to offer a relevant organ culture method to study tumor invasion in three dimensions. The assay can distinguish between invasive and non-invasive cells, and enables study of the effects of test compounds on tumor invasion. Cancer cells - either as aggregates or single cells - are confronted with fragments of embryonic chick heart. After organ culture in suspension for a few days or weeks the confronting cultures are fixed and embedded in paraffin for histological analysis. The three-dimensional interaction between the cancer cells and the normal tissue is then reconstructed from serial sections stained with hematoxylin-eosin or after immunohistochemical staining for epitopes in the heart tissue or the confronting cancer cells. The assay is consistent with the recent concept that cancer invasion is the result of molecular interactions between the cancer cells and their neighbouring stromal host elements (myofibroblasts, endothelial cells, extracellular matrix components, etc.). Here, this stromal environment is offered to the cancer cells as a living tissue fragment. Supporting aspects to the relevance of the assay are multiple. Invasion in the assay is in accordance with the criteria of cancer invasion: progressive occupation and replacement in time and space of the host tissue, and invasiveness and non-invasiveness in vivo of the confronting cells generally correlates with the outcome of the assay. Furthermore, the invasion pattern of cells in vivo, as defined by pathologists, is reflected in the histological images in the assay. Quantitative structure-activity relation (QSAR) analysis of the results obtained with numerous potentially anti-invasive organic congener compounds allowed the study of structure-activity relations for flavonoids and chalcones, and known anti-metastatic drugs used in the clinic (e.g., microtubule inhibitors) inhibit invasion in the assay as well. However, the assay does not take into account immunological contributions to cancer invasion.

Here, we present a protocol to study the invasion of tumor cells into living normal tissue fragments in three dimensions. This organ culture technique is mainly applied to test potentially anti-invasive drugs in vitro.

Invasione Chick Cuore Saggio per il test l&#39;invasività delle cellule tumorali e l&#39;attività di composti potenzialmente anti-invasive

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A Modified

Riepilogo

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Strategia alternativa per analizzare l'invasione cellulare in vitro di colture 3D

Strategia alternativa per analizzare l'invasione cellulare in vitro di colture 3D

Strategia alternativa per analizzare l'invasione cellulare in vitro di colture 3D

Tridimensionale (3D) Tumore Spheroid Invasion Assay

Invasione Chick Cuore Saggio per il test l'invasività delle cellule tumorali e l'attività di composti potenzialmente anti-invasive