PET/CT con [⁶⁸Ga]-NOTA-FAP-2286 per l'imaging di lesioni tendinee in modelli di lesioni del tendine d'Achille di ratto

Qui, presentiamo un protocollo per utilizzare l'imaging PET/CT [⁶⁸Ga]-NOTAFAP-2286 per mostrare un'elevata sensibilità nel rilevare e localizzare con precisione le lesioni tendinee.

Le lesioni tendinee, in particolare quelle che colpiscono il tendine d'Achille, sono condizioni comuni legate allo sport che hanno un impatto significativo sulla qualità della vita dei pazienti. Sebbene i metodi diagnostici esistenti come la risonanza magnetica e l'ecografia siano ampiamente utilizzati, a volte possono non fornire informazioni patologiche accurate. Questo studio mirava a studiare la fattibilità dell'utilizzo di [⁶⁸Ga]-NOTA-FAP-2286 tomografia a emissione di positroni/tomografia computerizzata (PET/CT) per valutare un modello sperimentale di ratto di lesione del tendine d'Achille. L'applicazione dell'imaging PET/CT [⁶⁸Ga]-NOTA-FAP-2286 ha dimostrato un'elevata sensibilità nel rilevare e localizzare con precisione le lesioni tendinee, offrendo informazioni patologiche più complete rispetto alle tecniche di imaging convenzionali. La proteina di attivazione dei fibroblasti (FAP), un marcatore per i fibroblasti attivati, svolge un ruolo cruciale nel processo di riparazione dei tendini. L'assorbimento del tracciante è iniziato sul lato ferito/rotto dalla prima settimana dopo la modellazione e ha raggiunto il picco durante la seconda settimana. Questi risultati mostrano che l'espressione di FAP, attivata dalla lesione e dalla rottura del tendine d'Achille, ha raggiunto il suo livello più alto durante la seconda settimana del processo di riparazione. Sfruttando la specificità del tracciante [⁶⁸Ga]-NOTA-FAP-2286, questo nuovo approccio di imaging visualizza accuratamente l'entità e la progressione delle lesioni tendinee nel modello animale.

I fibroblasti sono distribuiti in modo ubiquitario in quasi tutti i tessuti e in genere risiedono in uno stato quiescente. In caso di interruzione dell'integrità tissutale, i fibroblasti si attivano e migrano verso il sito della lesione, orchestrando il processo di riparazione¹. Una volta completata la riparazione, i fibroblasti generalmente tornano al loro stato quiescente; Tuttavia, in condizioni di infiammazione cronica o fibrosi, possono rimanere attivati in modo persistente. La FAP è una proteina transmembrana espressa sulla superficie dei fibroblasti attivati. Studi recenti hanno dimostrato un metodo non invasivo molto promettente per il monitoraggio della FAP per identificare varie entità tumorali importanti, tra cui i tumori al seno, ai polmoni e al colon-retto². Questo approccio potrebbe essere ulteriormente esplorato per il suo potenziale nella diagnosi delle lesioni tendinee.

Le lesioni tendinee costituiscono un problema muscoloscheletrico significativo, che comprende circa il 30% di tutte le consultazioni muscoloscheletriche nella pratica medica generale³. Queste lesioni sono prevalenti in varie fasce d'età e dati demografici, con un'incidenza notevolmente più elevata tra gli individui di età pari o superiore a 30 anni, i gruppi professionali impegnati in movimenti ripetitivi e gli atleti. Esempi degni di nota includono lesioni della cuffia dei rotatori, rotture del tendine d'Achille, tendinopatia rotulea e gomito del tennista, ciascuno con tassi di incidenza distinti e popolazioni colpite 4,5,6,7. Le modalità diagnostiche, come l'ecografia B e la risonanza magnetica, sono comunemente impiegate per valutare le lesioni tendinee. Tuttavia, dato il caratteristico processo di guarigione dei tendini che comporta l'accumulo di fibroblasti attorno alla superficie della ferita, è stato condotto uno studio per valutare l'uso di Al[¹⁸F]-NOTA-FAPI-04 per l'imaging dei modelli di lesioni tendinee⁸. I risultati supportano l'ipotesi che l'imaging PET-CT con FAPI possa servire come metodo efficace per monitorare i progressi della guarigione del tendine e valutare la gravità della lesione.

[⁶⁸Ga]-NOTAFAP-2286 esemplifica il vantaggio di mirare specificamente alla FAP nel microambiente tumorale con un tempo di ritenzione prolungato. Attualmente è utilizzato per l'imaging dei tumori. Per quanto ne sappiamo, la PET/CT con [⁶⁸Ga]-NOTA-FAP-2286 non è stata utilizzata per l'imaging delle lesioni tendinee. Pertanto, abbiamo condotto questo studio per esplorare l'applicazione della PET/CT con [⁶⁸Ga]-NOTA-FAP-2286 nell'imaging delle lesioni tendinee.

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con gli standard etici per la sperimentazione animale dal Primo Ospedale Affiliato della Scuola di Medicina dell'Università di Zhejiang. (Numero di riferimento: 20241008). ⁶⁸Ga è un elemento radioattivo che emette positroni dal decadimento, che si combinano rapidamente con gli elettroni circostanti per rilasciare raggi gamma. I raggi gamma possono penetrare nella pelle, con il rischio di danni da radiazioni al corpo. Tutto il personale sperimentale deve seguire una formazione sulla sicurezza e la protezione dalle radiazioni prima di condurre esperimenti correlati. Durante gli esperimenti, è necessario indossare dosimetri di radiazione, strumenti di schermatura e altri dispositivi di protezione. Le scorie radioattive prodotte nell'esperimento devono essere smaltite in modo appropriato dopo l'esperimento.

1. Processo di preparazione e modellazione di modelli animali

1. Preparazione
   1. Procurarsi ratti maschi di Sprague-Dawley (SD) (6-8 settimane di età, ~250 g, n = 8). Acclimatarli in condizioni standard di laboratorio con accesso ad libitum a cibo e acqua per 7 giorni. Usali per stabilire i modelli di lesione e rottura del tendine d'Achille.
   2. Dividi casualmente i ratti in due gruppi: gruppo uno: modello di lesione del tendine d'Achille (n = 4); gruppo due: modello di lesione del tendine d'Achille (n = 4).
2. Processo di modellazione
   1. Prepara gli strumenti: bisturi, pinza emostatica, pinza standard, isoflurano, ossigeno, tamponi imbevuti di alcol, iodoforo, piastra di fissaggio, suture chirurgiche e aghi.
   2. Anestetizzare il ratto in una camera di induzione con una miscela di isoflurano-ossigeno (1:1). Fissare il ratto incosciente su una tavola di fissaggio e mantenere l'anestesia utilizzando una maschera antigas che eroga un apporto continuo di isoflurano-ossigeno.
   3. Sterilizzare gli strumenti chirurgici con alcool e disinfettare il sito chirurgico.
   4. Stabilire il modello di lesione del tendine d'Achille.
      1. Applicare la crema depilatoria in modo uniforme sull'arto posteriore destro, attendere 5 minuti e rimuovere i peli con un rasoio.
      2. Usa un bisturi per praticare un'incisione longitudinale per esporre il tendine d'Achille.
      3. Comprimere il tendine con una pinza emostatica fino a quando non è appiattito.
      4. Chiudere l'incisione con punti di sutura.
   5. Stabilire il modello di rottura del tendine d'Achille.
      1. Seguire i passaggi 1.2.4.1 e 1.2.4.2 per esporre il tendine di Achilies.
      2. Afferrare il tendine d'Achille usando una pinza emostatica e creare un'incisione della linea mediana a tutto spessore usando le forbici chirurgiche (Figura 1).
      3. Sutura il tendine reciso e chiudi l'incisione cutanea.
   6. Monitora i ratti per segni di sofferenza e assicurati che la ferita sia guarita correttamente. Eseguire l'imaging PET 1 settimana dopo l'intervento.

2. Sintesi di ⁶⁸ Ga-NOTA-FAP2286

NOTA: ⁶⁸Ga (emivita: 68 min) si ottiene da un generatore ^{da 67}Ge/⁶⁸Ga.

1. Preparare 50 μg del precursore, scioglierlo in 800 μL di acetonitrile anidro e aggiungere 3 mL di soluzione tampone di acetato di sodio 0,1 M per regolare il pH a ~4. Eluire il generatore ⁶⁷Ge/⁶⁸Ga (5 mL/3 min; assicurarsi che non vi siano bolle d'aria nella siringa).
2. Aspirare 5 mL di acido cloridrico 0,1 M utilizzando una siringa con testa in gel di silice e iniettare il cloridrico nel generatore ⁶⁷Ge/⁶⁸Ga per sostituire il ⁶⁸Ga. Eluire ⁶⁸Ga (∼17 mci) in un flaconcino di vetro da 10 mL
   NOTA: Evitare il contatto dell'acido cloridrico con il metallo.
3. Miscelare il precursore disciolto (NOTA-FAP-2286, CAS Registry Number: 2583823-71-4) e ^{il 68}Ga eluito e metterli in un riscaldatore a 35 °C per 20 minuti (la reazione di marcatura è mostrata nella Figura 2).
4. Per purificare il prodotto, preattivare la colonna C18 con 10 mL di etanolo e 10 mL di acqua. Posizionare il prodotto sulla colonna C18 e sciacquarlo con 1 mL di etanolo al 50% per ottenere il prodotto finale.
5. Far evaporare l'etanolo. Riscaldare il flacone del prodotto finale a 80 °C per ~20 minuti per rimuovere l'etanolo in eccesso dalla soluzione mediante evaporazione.
6. Eseguire un controllo di qualità mediante HPLC: Fase mobile: A (0,1% H₃PO₄ Soluzione acquosa), 72%-52%, 0-20 min; B (CH₃CN), 28%-48%, 0-20 min; Portata: 3 mL/min.

3. Imaging PET di piccoli animali

1. Fissa il topo in un sistema di contenzione. Somministrare 500 μci di ⁶⁸GA-NOTA-FAP2286 attraverso la vena caudale nei ratti di entrambi i gruppi.
2. Indurre l'anestesia utilizzando l'isoflurano in una camera di induzione.
3. Posizionare il ratto completamente anestetizzato nel campo di scansione con il tendine d'Achille al centro del campo di scansione (Figura 3).
4. Esegui la scansione PET di piccoli animali e ottieni i risultati dell'imaging.
   1. Accendere il computer collegato al sistema PET per piccoli animali. Fare clic su Acquisizione CT per avviare il processo di preriscaldamento del sistema CT.
   2. Una volta completato il preriscaldamento, selezionare il protocollo di scansione e aprire il flusso di lavoro di scansione corrispondente (la durata della scansione è preimpostata su 10 min).
   3. Fare clic su Scout View per confermare il posizionamento del tendine d'Achille al centro del campo di scansione. Se la posizione è corretta, fare clic su Avvia flusso di lavoro per eseguire le scansioni PET e TC.
      1. Utilizzare i seguenti parametri: Vista del letto NCT: 0-36,2-76,4 mm, tempo di scansione TC: 60 s/un letto. PET: Acquisisci a tempo: 600 s; 511 KeV Livello di Energia di Picco; 350 Kev Discriminazione di livello inferiore; 650 KeV Discriminazione di Livello Superiore; Finestra di temporizzazione di 3,432 ns.
   4. Al termine della scansione, fare clic su Ricostruzione per ricostruire i file di scansione e ottenere i risultati dell'imaging. Utilizza l'area di lavoro di ricerca per la post-elaborazione delle immagini.

Abbiamo sintetizzato con successo [⁶⁸Ga]-NOTA-FAP-2286 con una resa superiore al 70% (decadimento corretto), raggiungendo una purezza radiochimica superiore al 95%. Il profilo HPLC è mostrato nella Figura 4. I modelli di lesioni tendinee sono stati stabiliti chirurgicamente e [⁶⁸Ga]-NOTA-FAP-2286 è stato somministrato per via endovenosa, seguito da un imaging PET di piccoli animali di successo. I risultati sono presentati nelle Figure 5, 6 e 7. Come illustrato nell'immagine PET (Figura 5), l'assorbimento del tracciante è iniziato sul lato leso/rotto a 30 minuti dopo l'iniezione e ha continuato ad aumentare nei successivi 90 minuti, mostrando una differenza significativa rispetto al normale tendine d'Achille e al tessuto muscolare. Al contrario, la Figura 6 dimostra che distinguere tra il tendine d'Achille danneggiato/rotto e il tendine d'Achille normale nelle immagini TC è difficile. L'immagine di proiezione della massima intensità (MIP) nella Figura 7 mostra che l'assorbimento del tracciante è iniziato sul lato ferito/rotto dalla prima settimana dopo la modellazione e ha raggiunto il picco durante la seconda settimana, indicando che l'espressione di FAP, attivata dalla lesione e dalla rottura del tendine d'Achille, raggiunge il suo livello più alto durante la seconda settimana del processo di riparazione. I valori specifici dei SUV sono riportati nella Tabella 1 e nella Tabella 2. La Tabella 1 indica che a 30, 60 e 90 minuti dopo l'iniezione, i valori massimi e medi di SUV sul lato della frattura/lesione erano significativamente più alti di quelli del normale tendine d'Achille e del tessuto muscolare, con una significatività statistica osservata in tutti e tre i punti temporali. La Tabella 2 conferma inoltre che durante le prime 3 settimane, i valori di SUV sul lato della frattura/lesione differivano da quelli del lato normale e del tessuto muscolare, con la differenza più pronunciata che si verificava nella seconda settimana. I dati nella Tabella 1 e nella Tabella 2 confermano i risultati dell'imaging illustrati nella Figura 5 e nella Figura 7.

Figura 1: Modelli di tendine d'Achille di ratto. (A) Modello di lesione del tendine d'Achille; (B) Modello di rottura del tendine d'Achille. (C) Struttura normale del tendine d'Achille nei ratti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: La reazione di etichettatura. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Lo speciale metodo di fissazione per mantenere il tendine d'Achille del ratto al centro del campo di scansione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: L'HPLC radioattivo e gli spettri ultravioletti di [⁶⁸Ga]-NOTA-FAP-2286. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Risultati dell'imaging PET. Imaging del modello di rottura del tendine d'Achille a (A) 30 minuti dopo l'iniezione, (B) 60 minuti dopo l'iniezione, (C) 90 minuti dopo l'iniezione. Imaging del modello di lesione del tendine d'Achille a (D) 30 minuti dopo l'iniezione, (E) 60 minuti dopo l'iniezione, (F) 90 minuti dopo l'iniezione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Risultati dell'imaging TC. Imaging TC del tendine d'Achille rotto dopo (A) 7 giorni, (B) 14 giorni, (C) 21 giorni. Imaging TC del tendine d'Achille ferito dopo (D) 7 giorni, (E) 14 giorni, (F) 21 giorni. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: Risultati della MIP dell'imaging PET-CT. MIP dell'imaging PET-CT del tendine d'Achille rotto dopo (A) 7 giorni, (B) 14 giorni, (C) 21 giorni. MIP dell'imaging PET-CT del tendine d'Achille ferito dopo (D) 7 giorni, (E) 14 giorni, (F) 21 giorni. Abbreviazione: MIP = proiezione di massima intensità. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: I valori SUV di diversi organi 30, 60 e 90 minuti dopo l'iniezione. Abbreviazione: SUV = valore di assorbimento standardizzato.

Tabella 2: Il valore SUV di diversi organi 1 settimana, 2 settimane e 3 settimane dopo la modellazione. Abbreviazione: SUV = valore di assorbimento standardizzato.

Le immagini mostrano notevoli differenze tra il lato destro e quello sinistro. Le scansioni PET di piccoli animali illustrano chiaramente le differenze tra i tendini d'Achille normali e quelli feriti/rotti. Queste differenze possono essere attribuite all'accumulo di FAP sul lato danneggiato/rotto che porta ad un aumento dell'assorbimento dell'agente di imaging. Gli esperimenti di imaging insieme alle misurazioni di SUV_max e SUV_dimostrano chiaramente il contrasto tra il tendine d'Achille ferito/rotto e il tendine d'Achille normale. Le alterazioni dell'espressione di FAP durante il processo di riparazione possono essere monitorate efficacemente utilizzando l'imaging PET.

Il successo di questo protocollo si basa su diversi passaggi critici. In primo luogo, la preparazione e il controllo di qualità del radiotracciante [⁶⁸Ga]-NOTA-FAP-2286 sono fondamentali. Ciò comporta l'impiego di precise tecniche radiochimiche per garantire un'elevata purezza radiochimica e un'attività specifica. In secondo luogo, indurre con precisione le lesioni del tendine d'Achille nei modelli di ratto è fondamentale per mantenere la coerenza tra i soggetti. Le tecniche chirurgiche standardizzate e l'assistenza postoperatoria devono essere conformi ai protocolli stabiliti. In terzo luogo, determinare il momento ottimale per l'imaging PET/CT dopo l'infortunio è essenziale per catturare efficacemente le fasi più informative del processo di guarigione. Una serie di punti temporali può essere necessaria per tracciare con precisione la progressione dell'espressione di FAP. In quarto luogo, sono necessari meticolosi protocolli di acquisizione e ricostruzione delle immagini per massimizzare sia il rapporto segnale/rumore che la risoluzione spaziale, che può essere particolarmente difficile negli studi di imaging su piccoli animali⁹. Infine, una rigorosa analisi quantitativa dei dati PET/CT svolge un ruolo fondamentale nell'estrazione di informazioni significative sul processo di guarigione del tendine; ciò include misurazioni come il SUV e potenzialmente l'incorporazione dell'analisi della texture. Inoltre, il radiotracciante mostra un rapido assorbimento e una ritenzione prolungata nei tumori.

Per ottimizzare il protocollo, è possibile prendere in considerazione diverse modifiche e strategie di risoluzione dei problemi. Possono essere necessari aggiustamenti della dose del radiotracciante o dei punti temporali di imaging per ottenere un rapporto segnale/rumore ottimale, bilanciando un assorbimento sufficiente con un segnale di fondo minimo. Il perfezionamento del modello di lesione tendinea è essenziale per garantire la coerenza tra i soggetti, potenzialmente attraverso la standardizzazione della forza applicata nelle lesioni da schiacciamento o l'entità della lacerazione. L'implementazione di tecniche di correzione del movimento potrebbe essere cruciale nell'imaging di piccoli animali per ridurre al minimo gli artefatti causati da movimenti respiratori o altri movimenti involontari. L'esplorazione di algoritmi alternativi di ricostruzione delle immagini, compresi i metodi di ricostruzione iterativa, è promettente per migliorare la risoluzione spaziale e l'accuratezza quantitativa. Inoltre, l'incorporazione dell'imaging PET dinamico potrebbe fornire informazioni più approfondite sulla cinetica dell'assorbimento di [⁶⁸Ga]-NOTA-FAP-2286 nei tendini lesionati, offrendo così informazioni più complete sul processo di guarigione. NOTA-FAP-2286 ha anche dimostrato un notevole potenziale nella diagnosi e nel trattamento di varie malattie, in particolare le condizioni ortopediche¹⁰. Nei tumori ossei maligni e benigni, come l'osteosarcoma e i tumori ossei metastatici, NOTA-FAP-2286 offre un'elevata specificità per la FAP, consentendo l'imaging PET/CT preciso e applicazioni terapeutiche¹¹. Inoltre, in condizioni infiammatorie e fibrotiche come la fibrosi articolare, i disturbi della guarigione delle fratture e l'artrite, NOTA-FAP-2286 fornisce preziose informazioni sui processi patologici e sull'attività della malattia¹².

Sebbene innovativo, questo metodo presenta diverse limitazioni. La risoluzione spaziale dell'imaging PET, tipicamente compresa tra 1 mm e 2 mm per gli scanner per piccoli animali, può limitare la capacità di rilevare sottili cambiamenti nella guarigione dei tendini, in particolare durante le fasi iniziali o per piccole lesioni¹⁰. Esiste un potenziale rischio di captazione di radiotraccianti non specifici nei tessuti circostanti, che potrebbe complicare l'interpretazione dei risultati, specialmente nelle regioni anatomiche complesse. Inoltre, la necessità di attrezzature specializzate e competenze in radiochimica e imaging di piccoli animali può limitarne l'adozione diffusa. La traduzione dei risultati dai modelli di ratto alle applicazioni umane presenta sfide a causa delle variazioni nelle dimensioni dei tendini, nei processi di guarigione e nell'entità delle lesioni. Inoltre, sebbene l'esposizione alle radiazioni associate all'imaging PET sia minima, può limitare la frequenza degli studi longitudinali sullo stesso animale.

L'importanza dell'imaging PET/CT mirato alla FAP risiede nel suo potenziale di fornire una visualizzazione specifica e sensibile a livello molecolare dei processi di guarigione dei tendini⁹. Rispetto alle tecniche di imaging convenzionali come la risonanza magnetica o l'ecografia, questa tecnica offre informazioni uniche sull'attivazione dei fibroblasti, un processo cruciale nella guarigione dei tendini. Consente una valutazione quantitativa della progressione della guarigione nel tempo, consentendo potenzialmente una diagnosi precoce di anomalie o complicanze nel processo di guarigione. A differenza di altri traccianti PET come [¹⁸F]-FDG, che riflette principalmente il metabolismo del glucosio, [⁶⁸Ga]-NOTA-FAP-2286 si rivolge specificamente alla FAP, fornendo così informazioni più precise sulla risposta fibroblastica durante la riparazione del tendine. Questa specificità migliora la capacità di discernere tra la normale guarigione e i processi patologici, portando a una caratterizzazione più accurata delle lesioni.

Il significato di questo metodo nella ricerca sulle lesioni tendinee è sfaccettato. Fornisce un approccio non invasivo per monitorare i processi di guarigione dei tendini negli studi preclinici, facilitando la valutazione longitudinale senza la necessità di biopsie ripetute o di sacrificare animali in vari punti temporali. Ciò non solo riduce significativamente il numero di animali necessari per la ricerca, ma produce anche dati più coerenti. Inoltre, questo metodo è promettente per la valutazione di nuovi interventi terapeutici per le lesioni tendinee, offrendo una misura quantitativa dell'efficacia del trattamento. Inoltre, potrebbe essere determinante per studiare i meccanismi molecolari alla base della riparazione e della rigenerazione tendinea, identificando potenzialmente nuovi bersagli terapeutici. Particolarmente interessante è la sua potenziale traduzione in applicazioni cliniche, in quanto potrebbe migliorare la diagnosi e la gestione delle lesioni tendinee nell'uomo. Nei campi della ricerca ortopedica, della medicina dello sport e della medicina rigenerativa, questa tecnica di imaging ha il potenziale per diventare un potente strumento per comprendere e ottimizzare le strategie relative alla guarigione dei tendini, portando in ultima analisi a migliori risultati per i pazienti.

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Lo studio è stato finanziato dal programma di scienze e tecnologie mediche e sanitarie di Zhejiang (sovvenzione n. 2023KY694), dalla Zhejiang Natural Science Foundation (numero di sovvenzione: LTG23H180014).