使用 [⁶⁸Ga]-NOTA-FAP-2286 的 PET/CT 用于大鼠跟腱损伤模型中的肌腱损伤成像

在这里，我们提出了一种利用 [⁶⁸Ga]-NOTAFAP-2286 PET/CT 成像在检测和精确定位肌腱损伤方面表现出高灵敏度的方案。

肌腱损伤，尤其是影响跟腱的肌腱损伤，是常见的运动相关疾病，会显着影响患者的生活质量。尽管现有的诊断方法（如 MRI 和超声）被广泛使用，但它们有时可能无法提供准确的病理信息。本研究旨在探讨使用 [⁶⁸Ga]-NOTA-FAP-2286 正电子发射断层扫描/计算机断层扫描 （PET/CT） 成像评估跟腱损伤实验大鼠模型的可行性。[⁶⁸Ga]-NOTA-FAP-2286 PET/CT 成像的应用在检测和精确定位肌腱损伤方面表现出高灵敏度，与传统成像技术相比，提供了更全面的病理学见解。成纤维细胞活化蛋白 （FAP） 是活化成纤维细胞的标志物，在肌腱修复过程中起着至关重要的作用。示踪剂摄取从建模后的第一周开始从受伤/破裂的一侧开始，并在第二周达到峰值。这些结果表明，由跟腱损伤和断裂激活的 FAP 表达在修复过程的第二周达到最高水平。通过利用 [⁶⁸Ga]-NOTA-FAP-2286 示踪剂的特异性，这种新颖的成像方法可以准确地可视化动物模型中肌腱损伤的程度和进展。

成纤维细胞普遍分布在几乎所有组织中，通常处于静止状态。在组织完整性被破坏时，成纤维细胞被激活并迁移到损伤部位，协调修复过程¹。一旦修复完成，成纤维细胞通常会恢复到静止状态;然而，在慢性炎症或纤维化的情况下，它们可能会保持持续激活。FAP 是一种在活化的成纤维细胞表面表达的跨膜蛋白。最近的研究表明，一种非常有前途的非侵入性方法可用于追踪 FAP 以识别各种重要的肿瘤实体，包括乳腺癌、肺癌和结直肠癌²。可以进一步探索这种方法在诊断肌腱损伤方面的潜力。

肌腱损伤是一个重要的肌肉骨骼问题，约占一般医疗实践中所有肌肉骨骼相关咨询的 30%³。这些损伤在不同年龄组和人口统计学中普遍存在，其中 30 岁或以上的个体、从事重复运动的职业群体和运动员的发病率明显更高。值得注意的例子包括肩袖损伤、跟腱断裂、髌腱病和网球肘，每种疾病都表现出不同的发病率和受影响的人群 4,5,6,7。诊断方法（如 B 超和 MRI）通常用于评估肌腱损伤。然而，鉴于肌腱的特征性愈合过程涉及成纤维细胞在伤口表面的积累，进行了一项研究以调查 Al[¹⁸F]-NOTA-FAPI-04 在肌腱损伤模型成像中的应用⁸。这些发现支持这样一个假设，即使用 FAPI 进行 PET-CT 成像可能是监测肌腱愈合进展和评估损伤严重程度的有效方法。

[⁶⁸Ga]-NOTAFAP-2286 具有在肿瘤微环境中特异性靶向 FAP 的优势，保留时间更长。它目前用于肿瘤成像。据我们所知，使用 [⁶⁸Ga]-NOTA-FAP-2286 的 PET/CT 尚未用于肌腱损伤成像。因此，我们进行了这项研究，以探讨 [⁶⁸Ga]-NOTA-FAP-2286 的 PET/CT 在肌腱损伤成像中的应用。

所有动物实验均按照浙江大学医学院附属第一医院动物实验伦理标准进行。（参考编号：20241008）。 ⁶⁸Ga 是一种放射性元素，它从衰变中发射正电子，正电子迅速与周围的电子结合以释放伽马射线。伽马射线可以穿透皮肤，对身体造成辐射损伤的风险。所有实验人员在进行相关实验前必须接受辐射安全和防护培训。实验过程中，需要佩戴辐射剂量计、屏蔽仪器等防护设备。实验产生的放射性废物需要在实验后妥善处理。

1. 动物模型的准备和建模过程

1. 制备
   1. 获得雄性 Sprague-Dawley （SD） 大鼠 （6-8 周龄，~250 g，n = 8）。在标准实验室条件下让它们适应， 随意获取食物 和水 7 天。使用它们来建立跟腱损伤和断裂的模型。
   2. 将大鼠随机分为两组：第一组：跟腱损伤模型 （n = 4）;第二组：跟腱损伤模型 （n = 4）。
2. 建模过程
   1. 准备器械：手术刀、止血钳、标准镊子、异氟醚、氧气、酒精棉签、碘伏、固定板、手术缝合线和针头。
   2. 在诱导室中用异氟醚 - 氧混合物 （1：1） 麻醉大鼠。将昏迷的大鼠固定在固定板上，并使用防毒面具保持麻醉，提供持续的异氟烷氧供应。
   3. 用酒精对手术器械进行消毒，并对手术部位进行消毒。
   4. 建立跟腱损伤模型。
      1. 将脱毛膏均匀涂抹在右后肢，等待 5 分钟，然后用剃须刀去除毛发。
      2. 用手术刀做一个纵向切口，露出跟腱。
      3. 使用止血钳压迫肌腱，直到它变平。
      4. 用缝合线闭合切口。
   5. 建立跟腱断裂的模型。
      1. 按照步骤 1.2.4.1 和 1.2.4.2 显示 Achilies 肌腱。
      2. 使用止血钳抓住跟腱，并使用手术剪刀创建一个全层中线切口（图1）。
      3. 缝合切断的肌腱并闭合皮肤切口。
   6. 监测大鼠是否有痛苦的迹象，并确保伤口正常愈合。手术后 1 周进行 PET 成像。

2. ⁶⁸ Ga-NOTA-FAP2286 的合成

注： ⁶⁸Ga（半衰期：68 分钟）由 ⁶⁷Ge/⁶⁸Ga 发生器获得。

1. 制备 50 μg 前体，将其溶解在 800 μL 无水乙腈中，并加入 3 mL 0.1 M 乙酸钠缓冲溶液，将 pH 值调节至 ~4。洗脱 ⁶⁷Ge/⁶⁸Ga 发生器（5 mL/3 min;确保注射器中没有气泡）。
2. 使用硅胶头注射器抽取 5 mL 0.1 M 盐酸，并将盐酸注入 ⁶⁷Ge/⁶⁸Ga 发生器中，以取代 ⁶⁸Ga。将 ⁶⁸Ga （∼17 mci） 洗脱到 10 mL 玻璃样品瓶中
   注意：避免盐酸与金属接触。
3. 混合溶解的前体（NOTA-FAP-2286，CAS登记号：2583823-71-4）和洗脱的 ⁶⁸Ga，并将它们置于35 °C的加热器中20分钟（标记反应如图 2所示）。
4. 要纯化产品，请用 10 mL 乙醇和 10 mL 水预活化 C18 色谱柱。将产品放在 C18 色谱柱上，用 1 mL 50% 乙醇冲洗，得到最终产品。
5. 蒸发乙醇。将最终产品瓶在 80 °C 下加热 ~20 分钟，以通过蒸发从溶液中去除多余的乙醇。
6. 使用 HPLC 进行质量控制检查：流动相：A（0.1% H₃PO₄ 水溶液），72%-52%，0-20 分钟;B （CH₃CN），28%-48%，0-20 分钟;流速：3 mL/min。

3. 小动物 PET 成像

1. 将老鼠固定在约束装置中。通过尾静脉将 ⁵⁰⁰μci 的 68 GA-NOTA-FAP2286 注入两组大鼠中。
2. 在诱导室中使用异氟醚诱导麻醉。
3. 将完全麻醉的大鼠置于扫描区域，跟腱位于扫描区域中心（图 3）。
4. 进行小动物 PET 扫描并获得成像结果。
   1. 打开连接到小动物 PET 系统的电脑。单击 CT Acquisition 以启动 CT 系统的预热过程。
   2. 预热完成后，选择 扫描协议 并打开相应的扫描工作流程（ 扫描 持续时间预设为 10 分钟）。
   3. 单击 Scout View 以确认跟腱在扫描区域中心的位置。如果位置正确，请单击 Start Workflow （开始工作流程 ） 以执行 PET 和 CT 扫描。
      1. 使用以下参数： NCT 病床视图：0-36.2-76.4 mm，CT 扫描时间：60 s/1 病床。PET：按时间获取：600 秒;511 KeV 光峰值能级;350 Kev 低级鉴别;650 KeV 上级鉴别力;3.432 ns 定时窗口。
   4. 扫描完成后，单击 Reconstruction 重建，重建扫描文件并获取成像结果。使用 Research Workplace 对图像进行后处理。

我们成功合成了 [⁶⁸Ga]-NOTA-FAP-2286，产率超过 70%（衰变校正），放射化学纯度超过 95%。HPLC 曲线如图 4 所示。通过手术建立肌腱损伤模型，静脉内给予 [⁶⁸Ga]-NOTA-FAP-2286，然后成功进行小动物 PET 成像。结果如图 5 、 图 6 和图 7 所示。如 PET 图像所示（图 5），示踪剂摄取在注射后 30 分钟从受伤/破裂的一侧开始，并在接下来的 90 分钟内继续增加，与正常的跟腱和肌肉组织相比显示出显着差异。相比之下，图 6 表明，在 CT 图像中区分受伤/断裂的跟腱和正常的跟腱具有挑战性。图 7 中的最大强度投影 （MIP） 图像显示，示踪剂摄取从建模后的第一周开始从受伤/骨折侧开始，并在第二周达到峰值，表明由跟腱损伤和断裂激活的 FAP 表达在修复过程的第二周达到最高水平。表 1 和表 2 中提供了具体的 SUV 值。表 1 表明，在注射后 30 、 60 和 90 分钟，骨折/损伤侧的最大和平均 SUV 值显著高于正常跟腱和肌肉组织，在所有三个时间点都观察到统计学显着性。表 2 进一步证实，在最初的 3 周内，骨折/损伤侧的 SUV 值与正常侧和肌肉组织的 SUV 值不同，最明显的差异发生在第二周。表 1 和表 2 中的数据证实了图 5 和图 7 中描述的成像结果。

图 1：大鼠跟腱模型。 （A） 跟腱损伤模型;（B） 跟腱断裂模型。（C） 大鼠跟腱的正常结构。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 2：标记反应。请单击此处查看此图的较大版本。

图 3：将大鼠跟腱保持在扫描野中心的特殊固定方法。请单击此处查看此图的较大版本。

图 4：[68 Ga]-NOTA-FAP-2286 的放射性 HPLC 和紫外光谱。请单击此处查看此图的较大版本。

图 5：PET 成像结果。 （A） 注射后 30 分钟、（B） 注射后 60 分钟、（C） 注射后 90 分钟的跟腱断裂模型成像。注射后 （D） 30 分钟、（E） 注射后 60 分钟、（F） 注射后 90 分钟的跟腱损伤模型成像。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 6：CT 成像结果。 （A） 7 天、（B） 14 天、（C） 21 天后跟腱断裂的 CT 成像。（D） 7 天、（E） 14 天、（F） 21 天后受伤跟腱的 CT 成像。 请单击此处查看此图的较大版本。

图 7：PET-CT 成像的 MIP 结果。 （A） 7 天、（B） 14 天、（C） 21 天后跟腱断裂的 PET-CT 成像 MIP。（D） 7 天、（E） 14 天、（F） 21 天后受伤跟腱的 PET-CT 成像 MIP。缩写： MIP = 最大强度投影。 请单击此处查看此图的较大版本。

表 1：注射后 30、60 和 90 分钟不同器官的 SUV 值。 缩写：SUV = 标准化摄取值。

表 2：建模后 1 周、 2 周和 3 周不同器官的 SUV 值。 缩写：SUV = 标准化摄取值。

图像显示了右侧和左侧之间的显著差异。小动物 PET 扫描清楚地说明了正常跟腱和受伤/断裂的跟腱之间的差异。这些差异可归因于 FAPs 在受伤/破裂侧的积累，导致显像剂的摄取增加。成像实验以及 SUV_max 和 SUV_平均值 的测量清楚地表明受伤/断裂的跟腱与正常跟腱之间的对比。使用 PET 成像可以有效地监测修复过程中 FAP 表达的变化。

该协议的成功取决于几个关键步骤。首先，[⁶⁸Ga]-NOTA-FAP-2286 放射性示踪剂的制备和质量控制至关重要。这涉及采用精确的放射化学技术来确保高放射化学纯度和比活性。其次，在大鼠模型中准确诱导跟腱损伤对于保持受试者之间的一致性至关重要。标准化的手术技术和术后护理应根据既定方案进行。第三，确定受伤后 PET/CT 成像的最佳时间对于有效捕捉愈合过程中信息最丰富的阶段至关重要。可能需要一系列时间点来准确跟踪 FAP 表达的进展。第四，需要细致的图像采集和重建协议来最大限度地提高信噪比和空间分辨率，这在小动物成像研究中尤其具有挑战性⁹。最后，对 PET/CT 数据的严格定量分析在提取有关肌腱愈合过程的有意义信息方面起着关键作用;这包括 SUV 等测量，并可能结合纹理分析。此外，放射性示踪剂在肿瘤中表现出快速摄取和延长保留时间。

可以考虑多种修改和故障排除策略来优化协议。可能需要调整放射性示踪剂剂量或成像时间点，以实现最佳信噪比，平衡足够的摄取和最小的背景信号。改进肌腱损伤模型对于确保受试者之间的一致性至关重要，可能通过标准化挤压伤中施加的力或撕裂伤的程度。运动校正技术的实施在小动物成像中可能至关重要，以最大限度地减少由呼吸或其他不自主运动引起的伪影。探索替代图像重建算法（包括迭代重建方法）有望提高空间分辨率和定量精度。此外，结合动态 PET 成像可以更深入地了解受伤肌腱中 [⁶⁸Ga]-NOTA-FAP-2286 摄取的动力学，从而提供有关愈合过程的更全面信息。NOTA-FAP-2286 在诊断和治疗各种疾病，尤其是骨科疾病方面也显示出巨大的潜力¹⁰。在恶性和良性骨肿瘤（如骨肉瘤和转移性骨肿瘤）中，NOTA-FAP-2286 对 FAP 具有高度特异性，可实现精确的 PET/CT 成像和治疗应用¹¹。此外，在关节纤维化、骨折愈合障碍和关节炎等炎症和纤维化疾病中，NOTA-FAP-2286 为病理过程和疾病活动提供了有价值的见解¹²。

尽管这种方法具有创新性，但存在一些局限性。PET 成像的空间分辨率（对于小动物扫描仪，通常在 1 毫米到 2 毫米之间）可能会限制检测肌腱愈合细微变化的能力，尤其是在早期阶段或小病变¹⁰。周围组织存在非特异性放射性示踪剂摄取的潜在风险，这可能会使结果解释复杂化，尤其是在复杂的解剖区域。此外，对放射化学和小动物成像方面的专业设备和专业知识的需求可能会限制其广泛采用。由于肌腱大小、愈合过程和损伤规模的变化，将大鼠模型的结果转化为人类应用存在挑战。此外，尽管与 PET 成像相关的辐射暴露很小，但它可能会限制对同一动物进行纵向研究的频率。

FAP 靶向 PET/CT 成像的意义在于它有可能提供肌腱愈合过程的特异性和灵敏的分子水平可视化⁹。与 MRI 或超声波等传统成像技术相比，该技术为成纤维细胞活化提供了独特的见解，成纤维细胞活化是肌腱愈合的关键过程。它允许对愈合过程随时间的变化进行定量评估，从而有可能更早地发现愈合过程中的异常或并发症。与主要反映葡萄糖代谢的其他 PET 示踪剂（如 [¹⁸F]-FDG）不同，[⁶⁸Ga]-NOTA-FAP-2286 特异性靶向 FAP，从而提供有关肌腱修复过程中成纤维细胞反应的更精确信息。这种特异性增强了区分正常愈合和病理过程的能力，从而获得更准确的病变特征。

这种方法在肌腱损伤研究中的重要性是多方面的。它提供了一种非侵入性方法来监测临床前研究中肌腱的愈合过程，便于纵向评估，而无需重复活检或在不同时间点牺牲动物。这不仅显著减少了研究所需的动物数量，而且还产生了更一致的数据。此外，这种方法通过提供治疗效果的定量测量，有望评估肌腱损伤的新型治疗干预措施。此外，它可能有助于研究肌腱修复和再生的分子机制，从而有可能确定新的治疗靶点。特别令人兴奋的是它可能转化为临床应用，因为它可以加强对人类肌腱损伤的诊断和管理。在骨科研究、运动医学和再生医学等领域，这种成像技术有可能成为理解和优化与肌腱愈合有关的策略的强大工具，最终改善患者的预后。

作者没有需要披露的利益冲突。

该研究由浙江省自然科学基金（批准号：LTG23H180014）资助的浙江省医疗卫生科技计划项目（批准号：2023KY694）。