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Method Article
* Questi autori hanno contribuito in egual misura
Il glioblastoma è una forma devastante di cancro cerebrale primario e la terapia termica interstiziale laser sta emergendo come una promettente alternativa alla resezione chirurgica convenzionale per il glioblastoma inoperabile. Questo protocollo descrive un modello murino preclinico ottimizzato che può essere utilizzato per studiare gli effetti del trattamento o trattamenti adiuvanti e combinatori.
Il glioblastoma (GB), la forma più aggressiva di cancro cerebrale primario, rappresenta circa la metà di tutti i tumori cerebrali primari di alto grado negli adulti e non ha cura. La terapia termica interstiziale laser (LITT) è un trattamento approvato dalla Food and Drug Administration (FDA) per la GB e viene utilizzato in pazienti che potrebbero non essere candidati alla resezione chirurgica convenzionale. Sebbene l'efficacia clinica della LITT sia stata stabilita, la ricerca al di là degli studi di casi clinici e delle serie di casi è limitata e ostacolata dalla mancanza di un modello animale consolidato. Questo protocollo utilizza topi C57BL/6 e una linea cellulare di glioma cancerogeno CT2A singenico per ricapitolare fedelmente il GB umano, utilizzando anche un laser a grana ittrio e alluminio drogato al neodimio (Nd:YAG) a 1064 nm, come quello utilizzato in uno dei due sistemi LITT approvati dalla FDA, fornendo un'eccellente rilevanza preclinica. Il successo dell'istituzione di questo modello murino di LITT fornirà una preziosa piattaforma per studiare le caratteristiche uniche dell'ablazione LITT e i suoi effetti sul microambiente tumorale, portando potenzialmente a migliori strategie terapeutiche.
Il cancro è la prima causa di morte in Canada. Il glioblastoma (GB), la forma più comune di tumore cerebrale aggressivo, rappresenta dal 48% al 60% di tutti i tumori cerebrali primari di alto grado negli adulti1. La prognosi per la GB è particolarmente infausta, con una sopravvivenza netta a 5 anni del 4,8% con trattamenti convenzionali, tra cui resezione chirurgica, chemioterapia e radioterapia 1,2.
La terapia termica interstiziale laser (LITT) è una procedura approvata dalla FDA che utilizza un laser per l'ablazione ipertermica del tumore in situ in pazienti con tumori cerebrali inoperabili e fornisce un'interessante alternativa terapeutica alla resezione chirurgica convenzionale3. Tuttavia, manca un modello murino dettagliato e ben caratterizzato per il trattamento LITT del GB, il che ostacola la ricerca preclinica.
Questo protocollo mira a mostrare un modello murino preclinico ottimizzato per il trattamento della GB con LITT. Abbiamo scelto di utilizzare topi C57BL/6 e la linea cellulare di glioma singenico CT2A per questo modello principalmente perché CT2A ricapitola fedelmente il GB umano di alto grado con caratteristiche istologiche, invasività, chemio- e radio-resistenza simili, e caratteristiche staminali con auto-rinnovamento e ri-stabilimento dei tumori4. Queste caratteristiche forniscono un'eccellente piattaforma per una varietà di studi che coinvolgono risposte immunitarie o nuove strategie terapeutiche. Inoltre, gli aspetti tecnici di questo protocollo LITT sono facilmente adattabili anche ad altri modelli murini di allo- e xenotrapianto 4,5,6, che verranno ulteriormente discussi.
I vantaggi di questo protocollo includono risultati coerenti con un paradigma di trattamento LITT semplice ma efficace. Il laser a 1064 nm drogato con grafofmio Gnnet di ittrio e alluminio (Nd:YAG) è lo stesso utilizzato clinicamente in uno dei due sistemi attualmente approvati dalla FDA, consentendo esperimenti strettamente paralleli all'applicazione clinica della LITT per il trattamento del glioma di alto grado. Lo svantaggio principale di questo protocollo è l'estrema cura che deve essere prestata sia durante l'impianto di cellule tumorali che durante il trattamento LITT per ottenere risultati riproducibili. Inoltre, a causa della natura aggressiva della linea cellulare CT2A, il protocollo è altamente sensibile al tempo. La maggior parte degli esperimenti dovrà essere conclusa in un massimo di 20 giorni, il che potrebbe limitare le indagini su alcune risposte immunitarie adattative o altri meccanismi cellulari e molecolari che si verificano in un corso di tempo più lungo.
L'etica animale per questo protocollo è stata approvata dal Comitato per la cura degli animali dell'Università di Manitoba in conformità con le linee guida etiche stabilite dal Canadian Council for Animal Care (CCAC). Questo protocollo ha utilizzato topi immunocompetenti C57BL/6 di 8-12 settimane e la linea cellulare di glioma singenico CT2A per un modello preclinico con un'ampia gamma di applicazioni, inclusi esperimenti incentrati sull'analisi istologica, sui cambiamenti immunologici o sugli interventi terapeutici combinatori. Il protocollo può essere facilmente adattato ad altre specie di topi o linee cellulari in base ai requisiti sperimentali.
Figura 1: Schema grafico del disegno sperimentale di base. Creato con BioRender.com Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
1. Preparazione cellulare in breve (Giorno 0)
NOTA: Se non è disponibile una macchina per il conteggio automatico delle cellule, è possibile eseguire un conteggio manuale utilizzando un emocitometro.
2. Impianto ortotopico (Giorno 0)
Figura 2: Illustrazione grafica di un cranio di topo e importanti punti di riferimento anatomici per la chirurgia stereotassica. Creato con BioRender.com Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Illustrazione grafica che indica la posizione dei fori di bava e dell'apparato laser. Illustrazione che mostra le posizioni relative del punto di riferimento Bregma, (A) il foro di bava iniziale per la fibra laser (A') e (B) il secondo, o esteso, foro di bava per la sonda a termocoppia (B'). A destra è mostrata una rappresentazione ritagliata delle sonde laser in fibra e della termocoppia, che illustra come le sonde sono stabilizzate in un piedino terminale stereotassico con fori preforati alla dimensione e alla spaziatura desiderate. Creato con BioRender.com Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
3. Monitoraggio del carico tumorale pre-LITT (Giorno 9)
4. Chirurgia LITT (giorno 10)
5. Valutazione post-LITT (giorno 11)
6. Fine degli studi (Giorno 11/Giorno 15/Giorno 20)
7. Analisi
Il successo dell'impianto di tumore CT2A e dei trattamenti LITT può essere caratterizzato utilizzando la risonanza magnetica pesata in T2, come mostrato nella Figura 4, Figura 5 e Figura 6. Le immagini RM sono state ottenute utilizzando un magnete superconduttore privo di criogeni 7T con un foro di 17 cm e una bobina di testa di topo in quadratura utilizzando i parametri di sequenz...
C'è un corpo di letteratura in rapida espansione riguardo alla LITT; tuttavia, è principalmente limitato a studi di casi clinici sull'uomo o serie di casi. In effetti, sono stati dimostrati diversi potenziali benefici per la LITT, tra cui tassi e costi di complicanze post-operatorie più bassi, oltre a conferire una sopravvivenza libera da progressione comparabile 7,8,9,10,11.
Siamo grati per il sostegno di Monteris Medical, inclusa la donazione in natura di apparecchiature laser.
Le fonti di finanziamento per questo progetto includono il Natural Sciences and Engineering Council of Canada (NSERC)-Alliance, Mitacs-Accelerate, Research Manitoba-IPOC, Canadian Institutes for Health Research (CIHR) CGS-M e University of Manitoba Graduate Fellowship. Linea cellulare di glioma CT2A generosamente donata dal Dr. Peter Fecci della Duke University, Durham, NC. Vorremmo anche ringraziare l'Istology Service Lab e la struttura Small Animal and Material Imaging Core dell'Università di Manitoba per la loro eccellente assistenza tecnica in questo progetto.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Absorbion Spears | FST | 18105-01 | Hemostatic sponges. |
Adson tissue forceps | FST | 11006-12 | |
C57BL/6 mice | Jackson Laboratories | Strain #000664 | 6 to 12 week old male and female |
Cotton Tipped Applicators (6") | Electron Microscopy Sciences | 72308 | |
CT2A glioma cell line | Generously donated from Dr. Peter Fecci, Duke University. | ||
Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, PathClear | Biotechne, R&D systems | 3433-010-01 | |
DMEM/F-12, HEPES | Gibco, ThermoFisher Scientific | 11330032 | |
Dual-chamber slides | BIO-RAD | 1450003 | |
Eppendorf Safe-Lock Tubes 2.0 mL | Eppendorf | 22363352 | |
Ethyl Alcohol Anhydrous | Greenfield Global | P016EAAN | Dilute to 70% with ddH2O |
Fetal Bovine Serum, qualified, Canada | Gibco, ThermoFisher Scientific | 12483020 | |
Glad Press-n-Seal plastic wrap | Amazon.ca | 12587704417 | |
High speed drill | Kopf Instruments | Model 1474 | |
K & J Thermocouple temerpature meter | Omega | HH509R | |
Metacam (meloxicam) | WDDC | 114424 | |
Microinjection syringe pump | WPI | UMP3T-1 | |
Microliter syringe (700 Series) | Hamilton | 87908 | Custom needles are available. A steep needle bevel helps with precise delivery, and a shorter needle length helps with stability. |
Needle driver/Needle Holder | FST | 12500-12 | A fine tip is most suitable due to the confined working space, but many styles are suitable based on handle preference. |
Opixcare Plus opthalmic ointment | WDDC | 135941 | |
Phosphate Buffered Saline (10x) | Fisher bioreagents | BP399-4 | Dilute to 1x with ddH2O |
Povidone-iodine | ThermoFisher Scientific | 3955-16 | Aliquat into into smaller tubes for use with cotton tipped applicators. |
Saline (normal) | WDDC | 126588 | |
Scalpel, single use (#15 Blade) | Feather | Feather NO15 | |
Scissors, fine surgical | FST | 91460-11 | Fine student scissors, Iris, or Bonn are all suitable. |
Stereotactic frame | Kopf Instruments | Model 940 | With digital display console and mouse nose-cone and ear-bars. |
Stereotactic syringe holder | Kopf Instruments | Model 1772-F | If not using an injection pump. |
Sutures (5-0 monofilament) | Ethicon | MCP463G | Monocryl violet monofilament with reverse cutting tip |
Syringe, 28 G (0.5 mL) | BD | BD 329461 | BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes |
TC20 Automated Cell Counter | BIO-RAD | 1450102 | |
Thermocouple probe, fine diameter (Type K) | Omega | TJM-CA316-IM025G-150 | |
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco, ThermoFisher Scientific | 25200072 | |
Vetbond by 3M, veterinary tissue glue | WDDC | 126125 | |
Wahl Peanut Clippers | WDDC/Wahl | 100963 | Also available directly from manufacturer. |
Warming pad | Bensen Medical | 70308/121873 | Any similar item can be used. |
Webcol Alcohol preps | Electron Microscopy Sciences | 71005-20 | Alcohol prep wipe, 2-ply, medium size. |
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