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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Il glioblastoma è una forma devastante di cancro cerebrale primario e la terapia termica interstiziale laser sta emergendo come una promettente alternativa alla resezione chirurgica convenzionale per il glioblastoma inoperabile. Questo protocollo descrive un modello murino preclinico ottimizzato che può essere utilizzato per studiare gli effetti del trattamento o trattamenti adiuvanti e combinatori.

Abstract

Il glioblastoma (GB), la forma più aggressiva di cancro cerebrale primario, rappresenta circa la metà di tutti i tumori cerebrali primari di alto grado negli adulti e non ha cura. La terapia termica interstiziale laser (LITT) è un trattamento approvato dalla Food and Drug Administration (FDA) per la GB e viene utilizzato in pazienti che potrebbero non essere candidati alla resezione chirurgica convenzionale. Sebbene l'efficacia clinica della LITT sia stata stabilita, la ricerca al di là degli studi di casi clinici e delle serie di casi è limitata e ostacolata dalla mancanza di un modello animale consolidato. Questo protocollo utilizza topi C57BL/6 e una linea cellulare di glioma cancerogeno CT2A singenico per ricapitolare fedelmente il GB umano, utilizzando anche un laser a grana ittrio e alluminio drogato al neodimio (Nd:YAG) a 1064 nm, come quello utilizzato in uno dei due sistemi LITT approvati dalla FDA, fornendo un'eccellente rilevanza preclinica. Il successo dell'istituzione di questo modello murino di LITT fornirà una preziosa piattaforma per studiare le caratteristiche uniche dell'ablazione LITT e i suoi effetti sul microambiente tumorale, portando potenzialmente a migliori strategie terapeutiche.

Introduzione

Il cancro è la prima causa di morte in Canada. Il glioblastoma (GB), la forma più comune di tumore cerebrale aggressivo, rappresenta dal 48% al 60% di tutti i tumori cerebrali primari di alto grado negli adulti1. La prognosi per la GB è particolarmente infausta, con una sopravvivenza netta a 5 anni del 4,8% con trattamenti convenzionali, tra cui resezione chirurgica, chemioterapia e radioterapia 1,2.

La terapia termica interstiziale laser (LITT) è una procedura approvata dalla FDA che utilizza un laser per l'ablazione ipertermica del tumore in situ in pazienti con tumori cerebrali inoperabili e fornisce un'interessante alternativa terapeutica alla resezione chirurgica convenzionale3. Tuttavia, manca un modello murino dettagliato e ben caratterizzato per il trattamento LITT del GB, il che ostacola la ricerca preclinica.

Questo protocollo mira a mostrare un modello murino preclinico ottimizzato per il trattamento della GB con LITT. Abbiamo scelto di utilizzare topi C57BL/6 e la linea cellulare di glioma singenico CT2A per questo modello principalmente perché CT2A ricapitola fedelmente il GB umano di alto grado con caratteristiche istologiche, invasività, chemio- e radio-resistenza simili, e caratteristiche staminali con auto-rinnovamento e ri-stabilimento dei tumori4. Queste caratteristiche forniscono un'eccellente piattaforma per una varietà di studi che coinvolgono risposte immunitarie o nuove strategie terapeutiche. Inoltre, gli aspetti tecnici di questo protocollo LITT sono facilmente adattabili anche ad altri modelli murini di allo- e xenotrapianto 4,5,6, che verranno ulteriormente discussi.

I vantaggi di questo protocollo includono risultati coerenti con un paradigma di trattamento LITT semplice ma efficace. Il laser a 1064 nm drogato con grafofmio Gnnet di ittrio e alluminio (Nd:YAG) è lo stesso utilizzato clinicamente in uno dei due sistemi attualmente approvati dalla FDA, consentendo esperimenti strettamente paralleli all'applicazione clinica della LITT per il trattamento del glioma di alto grado. Lo svantaggio principale di questo protocollo è l'estrema cura che deve essere prestata sia durante l'impianto di cellule tumorali che durante il trattamento LITT per ottenere risultati riproducibili. Inoltre, a causa della natura aggressiva della linea cellulare CT2A, il protocollo è altamente sensibile al tempo. La maggior parte degli esperimenti dovrà essere conclusa in un massimo di 20 giorni, il che potrebbe limitare le indagini su alcune risposte immunitarie adattative o altri meccanismi cellulari e molecolari che si verificano in un corso di tempo più lungo.

Protocollo

L'etica animale per questo protocollo è stata approvata dal Comitato per la cura degli animali dell'Università di Manitoba in conformità con le linee guida etiche stabilite dal Canadian Council for Animal Care (CCAC). Questo protocollo ha utilizzato topi immunocompetenti C57BL/6 di 8-12 settimane e la linea cellulare di glioma singenico CT2A per un modello preclinico con un'ampia gamma di applicazioni, inclusi esperimenti incentrati sull'analisi istologica, sui cambiamenti immunologici o sugli interventi terapeutici combinatori. Il protocollo può essere facilmente adattato ad altre specie di topi o linee cellulari in base ai requisiti sperimentali.

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Figura 1: Schema grafico del disegno sperimentale di base. Creato con BioRender.com Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

1. Preparazione cellulare in breve (Giorno 0)

  1. Prima di iniziare la coltura cellulare, assicurarsi che l'armadio e tutte le pipette necessarie siano completamente sterilizzati con UV ed etanolo.
  2. Riscaldare il DMEM/F12 con il 10% di terreno FBS, soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e tripsina a temperatura ambiente (RT) utilizzando un bagno d'acqua.
  3. Pipettare il terreno dal pallone T25 e sciacquare brevemente le cellule con PBS. Aggiungere 1 mL di tripsina alle cellule e incubare per 30-60 s fino a quando le cellule non si staccano dal pallone.
  4. Confermare le cellule staccate al microscopio ottico e aggiungere 4 ml di terreno per arrestare l'attività enzimatica della tripsina.
  5. Conta le celle utilizzando un contatore di celle automatizzato.
    1. Miscelare 10 μl della sospensione cellulare con 10 μl di blu di tripano, quindi aggiungere 10 μl al vetrino di conteggio delle cellule.
    2. Inserire il vetrino nella macchina conta cellule e registrare il conteggio totale delle cellule, il conteggio delle cellule vive e la percentuale di cellule vive.

NOTA: Se non è disponibile una macchina per il conteggio automatico delle cellule, è possibile eseguire un conteggio manuale utilizzando un emocitometro.

  1. Calcolare le cellule necessarie per tutte le iniezioni programmate.
    NOTA: Per CT2A, si raccomandano 5000 cellule per 1,5 μl di volume iniettato e un minimo di 100 μl di volume totale per ogni preparazione.
  2. Centrifugare le celle a 134 x g per 5 minuti per pellettare le celle e aspirare quanto più terreno possibile.
  3. Risospendere il pellet cellulare con il 5% di estratto della membrana basale in PBS per il volume necessario in una provetta da microcentrifuga. Mentre le provette più piccole saranno più adatte per preparare la sospensione cellulare, una provetta da 2 ml è migliore per la conservazione durante l'intervento chirurgico poiché è meno probabile che le cellule si aggreghino sul fondo più arrotondato e si ridistribuiscano facilmente con un leggero sfarfallio.
  4. Tenere le cellule in ghiaccio per l'iniezione, preparando nuove sospensioni cellulari ogni 4-5 ore secondo necessità.

2. Impianto ortotopico (Giorno 0)

  1. Preparare l'area chirurgica e assicurarsi che tutti gli strumenti necessari siano sterili e pronti per l'uso.
  2. Anestetizzare il topo utilizzando isoflurano (3% vaporizzato in 1 L/min O2) in una camera monitorando la frequenza respiratoria (target 60 bpm).
  3. Ottenere e registrare il peso dell'animale per il dosaggio dei farmaci.
  4. Radere accuratamente l'area chirurgica per evitare occhi, orecchie e baffi.
  5. Trasferisci l'animale in un sistema stereotassico.
    1. Posizionare gli incisivi nel foro della barra del morso e regolare l'ogiva fino a quando non è aderente, serrando la vite di fissaggio per fissarla.
    2. Controllare la profondità dell'anestesia con pizzichi bilaterali delle dita degli arti posteriori e, se appropriato, fissare il cranio con le spine auricolari e regolare la testa dell'animale in una posizione neutra e piana.
    3. Monitora le temperature interne degli animali utilizzando una sonda di temperatura rettale lubrificata e fornisci un riscaldamento supplementare a 37 °C utilizzando un termoforo sotto il corpo.
      ATTENZIONE: Fare attenzione a non stringere eccessivamente l'ogiva, poiché anche una pressione moderata sull'osso nasale può causare l'arresto respiratorio. Se si utilizza un termoforo elettrico (ad esempio, un termoforo per un terrario), assicurarsi che le impostazioni della temperatura siano accurate e che la temperatura impostata rimanga costante.
  6. Applicare abbondantemente l'unguento oftalmico su entrambi gli occhi per prevenire la secchezza.
  7. Somministrare iniezioni profilattiche e controllare la profondità dell'anestetico.
    1. Iniettare per via sottocutanea (s.c.) meloxicam o altri farmaci antidolorifici a lunga durata d'azione secondo le linee guida locali per le strutture animali (ad es. 5,0 mg/kg di meloxicam) utilizzando una siringa da 28 G x 1/2".
    2. Somministrare un'iniezione di 20 mg/kg s.c. di soluzione fisiologica preriscaldata per il supporto profilattico del fluido durante le procedure più lunghe.
    3. Ridurre l'anestetico all'1,5%-2,0% di isoflurano per mantenere la frequenza respiratoria target.
  8. Utilizzando una tecnica asettica, drappeggiare l'animale e preparare l'area chirurgica.
    1. Utilizzando un batuffolo di cotone sterile, applicare una soluzione disinfettante di iodio povidone o clorexidina. Partendo medialmente dal sito di incisione e ruotando il tampone dopo ogni passaggio, lavorare verso l'esterno, quindi utilizzando un batuffolo di cotone sterile fresco, applicare etanolo al 70% sul sito in modo simile.
    2. Ripetere lo scrub con iodio seguito da etanolo al 70% altre due volte (3 volte in totale, ciascuna).
  9. Ricontrollare la profondità dell'anestesia prima di procedere con l'esposizione chirurgica. Monitorare attentamente la frequenza respiratoria durante la procedura e regolare l'anestetico secondo necessità.
  10. Partendo dalla linea mediana e leggermente posteriormente agli occhi, praticare un'incisione medio-sagittale di 1-1,5 cm in direzione caudale utilizzando un bisturi a lama #15. In alternativa, estendi una breve incisione del bisturi con le forbici dell'iride.
    NOTA: Le incisioni devono iniziare dalla linea mediana ma, per le iniezioni unilaterali, possono essere leggermente angolate lateralmente per facilitare la visualizzazione e l'accesso simultanei di Bregma e della posizione del foro di bava.
  11. Usando un batuffolo di cotone sterile, rifletti i bordi della ferita per visualizzare il cranio e strofina delicatamente via il tessuto connettivo dall'area.
    1. Se necessario, utilizzare un batuffolo di cotone sterile imbevuto di perossido di idrogeno per pulire la superficie del cranio e visualizzare le suture craniche.
  12. Localizzare Bregma nel punto in cui le suture coronali sinistra e destra si incontrano sulla linea mediana con la sutura sagittale (vedere Figura 2).
    1. Utilizzando una resina acrilica colorata atossica e uno stuzzicadenti sterile in legno o simili, fare un segno molto piccolo sul Bregma.
      NOTA: In alcuni casi, le suture coronali sinistra e destra non si rispecchiano a vicenda; In questi casi, utilizzare una "linea di adattamento" per approssimare il punto in cui dovrebbero intersecarsi lungo il piano sagittale medio.
  13. Assicurarsi che la posizione della testa dell'animale non sia inclinata o ruotata (cioè su un piano piatto).
    1. Zero coordinate stereotassiche a Bregma. La coordinata x si riferisce al movimento nel piano mediale-laterale (ML), la coordinata y nel piano antero-posteriore (AP) e la coordinata z nel piano dorso-ventrale (DV).
    2. Assicurarsi che Lambda si trovi sullo stesso piano DV di Bregma (ad esempio, z = 0 in entrambi i punti di riferimento). Allo stesso modo, a +2,0 mm (x = 2) e -2,0 mm (x = -2,0) lateralmente a Bregma, assicurati che il cranio sia sullo stesso piano, con la coordinata DV/z approssimativamente uguale. Assicurati che il teschio sia sicuro e non si muova dopo alcuna regolazione.
  14. Praticare un foro di fresatura a +2,0 mm (ML) e +0,5 mm (AP) da Bregma (Figura 3).
    1. Utilizzando un trapano stereotassico, abbassare con cautela la punta della punta fino a quando non entra in contatto con Bregma e azzerare le coordinate.
    2. Sollevare leggermente la punta e regolare il trapano sulle coordinate AP e ML appropriate.
    3. Abbassare lentamente il trapano, facendo attenzione a sbavare solo attraverso il cranio.
    4. In alternativa, utilizzando una siringa da microlitro nel telaio stereotassico, abbassare la punta dell'ago fino a toccare Bregma e azzerare le coordinate.
    5. Solleva leggermente l'ago e regolalo sulle coordinate AP e ML appropriate.
    6. Abbassa la punta fino a toccare il cranio e annota la posizione esatta.
    7. Sollevare leggermente l'ago e fare un piccolo segno nella posizione target con un pennarello chirurgico.
    8. Solleva o ruota il portaago in modo che non sia d'intralcio e, usando un trapano a mano, fai una sbavatura attraverso il cranio, facendo attenzione a non danneggiare il cervello sottostante. ATTENZIONE: In generale, i topi maschi più anziani hanno crani relativamente più spessi e richiedono una perforazione più estesa. La perforazione manuale deve essere eseguita con attenzione, applicando una pressione minima, poiché le rotture improvvise attraverso il cranio danneggeranno le meningi sottostanti e/o il cervello.
      NOTA: Durante la procedura LITT, è necessaria un'estensione del foro di fresatura per accogliere la sonda della termocoppia. Questo può essere fatto più facilmente durante l'intervento di iniezione iniziale e facilita un intervento chirurgico LITT più rapido e snello. In alternativa, il foro della fresa può essere esteso allo stesso modo durante l'intervento chirurgico LITT, il che può ridurre il rischio di crescita extracranica del tumore.
  15. Creare un secondo foro di bava a +3,0 mm ML e +0,5 mm AP (1,0 mm lateralmente al sito di iniezione) per la termocoppia.
    1. Seguire la procedura di foratura come descritto nel passaggio precedente.
    2. Per evitare difficoltà legate alla ricrescita ossea, rimuovere l'osso tra i due fori.
      NOTA: Si consiglia di utilizzare +2,0 mm ML, +0,5 mm AP e -2,5 mm DV di Bregma come coordinate per l'impianto del tumore. Questa posizione nello striato superiore produce una crescita tumorale costante, che è ben tollerata dagli animali, tuttavia, il protocollo può essere adattato ad altre posizioni.
  16. Preparare la sospensione di cellule di glioma di topo CT2A in una siringa da microlitri (5000 cellule in 1,5 μL).
    1. Rimuovere la provetta da microcentrifuga pre-preparata dal ghiaccio e sbattere delicatamente con la punta delle dita per ririmetterla in sospensione.
    2. Aspirare delicatamente 2 μl in una siringa da 5 μl o 10 μl, facendo attenzione a evitare bolle.
    3. Esprimere 0,5 μl per rimuovere l'aria e assicurarsi che l'ago sia innescato e funzioni correttamente.
    4. Pulire lo stelo dell'ago con un tampone imbevuto di alcol per rimuovere il liquido estratto e le eventuali cellule sulla superficie esterna (che possono causare la crescita del tumore leptomeningeo).
  17. Caricare la siringa in una pompa a siringa per microiniettore (o in un attacco stereotassico manuale) e abbassare lentamente l'ago.
    1. Abbassare lentamente l'ago fino alla profondità (z = -3,0 mm) e fare una pausa di 1 minuto.
    2. Ritrarre lentamente l'ago di 0,5 mm (z = -2,50 mm) e iniettare le cellule (≤ 0,5 μL/min). Mantenere asciutta l'area intorno alla siringa utilizzando una lancia di spugna microchirurgica, facendo attenzione a non rompere l'ago.
    3. Attendere almeno 2 minuti dopo il completamento dell'iniezione, quindi ritrarre lentamente la siringa per un periodo di 3-4 minuti. Assicurarsi che i primi 4-5 intervalli di retrazione siano di 100 μm per retrazione per evitare che le cellule vengano spostate dal sito di iniezione originale.
    4. Utilizzando un tampone imbevuto di alcol, pulire delicatamente l'esterno dell'ago da sangue o liquidi e sciacquare e pulire la siringa secondo le linee guida del produttore. Utilizzare PBS e acqua distillata tra un'iniezione e l'altra per assicurarsi che l'ago non si ostruisca. Al termine delle iniezioni, sciacquare generosamente l'ago con etanolo al 70% per rimuovere eventuali cellule rimanenti dall'ago.
      ATTENZIONE: Non lavare l'ago dopo ogni iniezione può causare un blocco. Se si inietta più di un tipo di cellula, utilizzare un ago separato per ciascun tipo per evitare ogni possibile contaminazione incrociata.
  18. Riapprossimare l'incisione, facendo attenzione a estroflesse leggermente i bordi della ferita in modo che il derma sottostante si tocchi. Chiudere la ferita utilizzando una clip per ferite o 3 punti interrotti con una sutura 5-0. Applicare la soluzione di iodio povidone sulla ferita chiusa.
  19. Togliere l'animale dal telaio stereotassico e metterlo in una gabbia di recupero rivestita di carta su un tappetino riscaldante impostato a 37 °C. Assicurarsi che la decubito sternale sia ottenuta prima di trasferire l'animale nella gabbia di casa con un piattino di cibo bagnato situato sul pavimento della gabbia.
  20. Monitorare l'animale almeno due volte al giorno, a partire dal giorno dell'intervento, per i 2 giorni successivi. Somministrare meloxicam dopo 24 ore, 48 ore e 72 ore, o secondo le linee guida dell'istituto.

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Figura 2: Illustrazione grafica di un cranio di topo e importanti punti di riferimento anatomici per la chirurgia stereotassica. Creato con BioRender.com Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Illustrazione grafica che indica la posizione dei fori di bava e dell'apparato laser. Illustrazione che mostra le posizioni relative del punto di riferimento Bregma, (A) il foro di bava iniziale per la fibra laser (A') e (B) il secondo, o esteso, foro di bava per la sonda a termocoppia (B'). A destra è mostrata una rappresentazione ritagliata delle sonde laser in fibra e della termocoppia, che illustra come le sonde sono stabilizzate in un piedino terminale stereotassico con fori preforati alla dimensione e alla spaziatura desiderate. Creato con BioRender.com Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

3. Monitoraggio del carico tumorale pre-LITT (Giorno 9)

  1. Eseguire la risonanza magnetica (MRI) pesata in T2, seguendo le linee guida istituzionali, per valutare la crescita del tumore il giorno prima della LITT.
    NOTA: I tumori devono avere un diametro di ~1,5-2,0 mm.
    1. Ottenere una scansione coronale adeguata dell'intero cervello del topo utilizzando i seguenti parametri: sequenza di eco di spin veloce, TR = 5000 ms, TE = 45 ms, treni di eco = 7, FOV = 30 x 30 mm2, dimensione della matrice = 250 x 256, fette totali = 18, spessore della fetta = 0,3 mm, medie = 2.
      NOTA: Si raccomanda inoltre di eseguire una risonanza magnetica periodica a partire dal giorno 6 circa dopo l'impianto per confermare il successo dell'allotrapianto e per monitorare la crescita del tumore, in particolare durante gli esperimenti iniziali, poiché anche lievi modifiche alla procedura possono alterare la tempistica. CT2A è altamente aggressivo e gli animali devono essere monitorati attentamente. Una scintigrafia coronale pesata in T2 funziona bene per questo scopo. L'uso di cellule CT2A marcate con fluorescenza o luciferina in combinazione con il sistema di imaging in vivo (IVIS) può essere adatto anche quando l'accesso a una risonanza magnetica di piccoli animali non è disponibile. Tuttavia, la cinetica di crescita e altre caratteristiche del tumore differiranno da questo protocollo.

4. Chirurgia LITT (giorno 10)

  1. Come sopra nel paragrafo 2, ripetere i passaggi 2.1-2.13 per preparare l'animale alla LITT.
    NOTA: La guarigione della ferita dall'intervento precedente può avvenire in fasi diverse in base alle specie e alle variazioni nella sequenza temporale sperimentale. Fai attenzione ai tessuti più sottili o più delicati quando rifai l'incisione.
  2. Utilizzando un tampone sterile con punta di cotone, pulire delicatamente il cranio, eliminando i tessuti che oscurano il Bregma o il foro di bava precedentemente praticato. Se necessario, ripraticare il foro di bava, anche se a causa della velocità di formazione del tumore CT2A, ci si aspetta poca o nessuna ricrescita ossea.
  3. Con l'attacco LITT in posizione nel telaio stereotassico, azzerare le coordinate a Bregma per la punta della fibra laser.
    ATTENZIONE: La fibra laser è molto fragile e si spezzerà se piegata. Fare attenzione a fermarsi non appena la punta della fibra laser tocca il cranio.
  4. Sollevare leggermente la punta e spostarsi sulle coordinate ML e AP desiderate, quindi abbassare lentamente le sonde fino alla coordinata DV del bersaglio per arrivare al bersaglio (2,0 mm ML, 0,5 mm AP, -2,0 mm DV).
  5. Impostare i parametri del trattamento LITT: Modalità: continua; Potenza: 1 W
  6. Spostare il laser da Standby ad Attivo e attivare il laser per 60 s utilizzando il pedale. Se la temperatura supera i 46 °C, fare una breve pausa, quindi riattivare, cercando di mantenere la temperatura il più vicino possibile a 46 °C.
  7. Ritrarre lentamente il gruppo laser e pulire delicatamente la fibra laser e la termocoppia con un tampone imbevuto di alcol. Ruotare il gruppo in modo che non sia d'intralcio, facendo attenzione che le sonde non entrino in contatto con il telaio.
  8. Chiudere la ferita e recuperare l'animale come descritto nei passaggi 2.18-2.20 dopo l'impianto del tumore sopra.

5. Valutazione post-LITT (giorno 11)

  1. Eseguire la risonanza magnetica post-LITT pesata in T2 il giorno successivo al trattamento con LITT per valutare il successo dell'ablazione del tumore LITT utilizzando la sequenza e i parametri del passaggio 3.1 sopra.
    NOTA: Inoltre, una sequenza di recupero dell'inversione attenuata dal fluido (FLAIR) può anche essere utile per valutare l'edema post-operatorio.
  2. Eseguire scansioni di follow-up prima della fine dello studio per monitorare i cambiamenti post-trattamento o la ricrescita del tumore.

6. Fine degli studi (Giorno 11/Giorno 15/Giorno 20)

  1. Eutanasia degli animali agli endpoint sperimentali scelti secondo le linee guida dell'istituto.
    NOTA: Gli endpoint successivi al giorno 20 non sono fattibili con CT2A, anche con inoculazioni con un numero di cellule estremamente basso, poiché gli animali di controllo (ad esempio, chirurgia fittizia o nessun trattamento) e alcuni animali del gruppo di trattamento possono essere moribondi e richiedere l'eutanasia. Per esperimenti più lunghi, prendere in considerazione modelli alternativi di cellule di glioma di topo.
  2. Raccogli i tessuti per il fissaggio e la lavorazione.
    1. Eseguire la perfusione cardiaca con paraformaldeide (PFA) al 4% e raccogliere i tessuti di interesse.
    2. Post-fissare il tessuto cerebrale mediante immersione in PFA al 4% per una notte a 4 °C.
    3. Elaborare i campioni utilizzando le pratiche standard per l'analisi FFPE (FFPE) o congelata in formalina.

7. Analisi

  1. Verificare il successo dell'ablazione LITT utilizzando la risonanza magnetica pesata in T2 e convalidare utilizzando tecniche istologiche di base come una colorazione con ematossilina ed eosina.
  2. Eseguire tutte le analisi aggiuntive necessarie per gli esperimenti (ad es. immunoistochimica, immunofluorescenza).

Risultati

Il successo dell'impianto di tumore CT2A e dei trattamenti LITT può essere caratterizzato utilizzando la risonanza magnetica pesata in T2, come mostrato nella Figura 4, Figura 5 e Figura 6. Le immagini RM sono state ottenute utilizzando un magnete superconduttore privo di criogeni 7T con un foro di 17 cm e una bobina di testa di topo in quadratura utilizzando i parametri di sequenz...

Discussione

C'è un corpo di letteratura in rapida espansione riguardo alla LITT; tuttavia, è principalmente limitato a studi di casi clinici sull'uomo o serie di casi. In effetti, sono stati dimostrati diversi potenziali benefici per la LITT, tra cui tassi e costi di complicanze post-operatorie più bassi, oltre a conferire una sopravvivenza libera da progressione comparabile 7,8,9,10,11.

Divulgazioni

Siamo grati per il sostegno di Monteris Medical, inclusa la donazione in natura di apparecchiature laser.

Riconoscimenti

Le fonti di finanziamento per questo progetto includono il Natural Sciences and Engineering Council of Canada (NSERC)-Alliance, Mitacs-Accelerate, Research Manitoba-IPOC, Canadian Institutes for Health Research (CIHR) CGS-M e University of Manitoba Graduate Fellowship. Linea cellulare di glioma CT2A generosamente donata dal Dr. Peter Fecci della Duke University, Durham, NC. Vorremmo anche ringraziare l'Istology Service Lab e la struttura Small Animal and Material Imaging Core dell'Università di Manitoba per la loro eccellente assistenza tecnica in questo progetto.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Absorbion SpearsFST18105-01Hemostatic sponges.
Adson tissue forcepsFST11006-12
C57BL/6 miceJackson LaboratoriesStrain #0006646 to 12 week old male and female
Cotton Tipped Applicators (6")Electron Microscopy Sciences72308
CT2A glioma cell lineGenerously donated from Dr. Peter Fecci, Duke University.
Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, PathClearBiotechne, R&D systems3433-010-01
DMEM/F-12, HEPESGibco, ThermoFisher Scientific11330032
Dual-chamber slides BIO-RAD1450003
Eppendorf Safe-Lock Tubes 2.0 mLEppendorf22363352
Ethyl Alcohol AnhydrousGreenfield GlobalP016EAANDilute to 70% with ddH2O
Fetal Bovine Serum, qualified, CanadaGibco, ThermoFisher Scientific12483020
Glad Press-n-Seal plastic wrapAmazon.ca12587704417
High speed drillKopf InstrumentsModel 1474
K & J Thermocouple temerpature meterOmegaHH509R
Metacam (meloxicam)WDDC114424
Microinjection syringe pumpWPIUMP3T-1
Microliter syringe (700 Series)Hamilton87908Custom needles are available. A steep needle bevel helps with precise delivery, and a shorter needle length helps with stability.
Needle driver/Needle HolderFST12500-12A fine tip is most suitable due to the confined working space, but many styles are suitable based on handle preference.
Opixcare Plus opthalmic ointmentWDDC135941
Phosphate Buffered Saline (10x)Fisher bioreagentsBP399-4Dilute to 1x with ddH2O
Povidone-iodineThermoFisher Scientific3955-16Aliquat into into smaller tubes for use with cotton tipped applicators.
Saline (normal)WDDC126588
Scalpel, single use (#15 Blade)FeatherFeather NO15
Scissors, fine surgicalFST91460-11Fine student scissors, Iris, or Bonn are all suitable.
Stereotactic frameKopf InstrumentsModel 940With digital display console and mouse nose-cone and ear-bars.
Stereotactic syringe holderKopf InstrumentsModel 1772-FIf not using an injection pump.
Sutures (5-0 monofilament)EthiconMCP463GMonocryl violet monofilament with reverse cutting tip
Syringe, 28 G  (0.5 mL) BDBD 329461BD Lo-Dose U-100 Insulin Syringes
TC20 Automated Cell CounterBIO-RAD1450102
Thermocouple probe, fine diameter (Type K)OmegaTJM-CA316-IM025G-150
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol redGibco, ThermoFisher Scientific25200072
Vetbond by 3M, veterinary tissue glue WDDC126125
Wahl Peanut ClippersWDDC/Wahl100963Also available directly from manufacturer.
Warming padBensen Medical70308/121873Any similar item can be used.
Webcol Alcohol prepsElectron Microscopy Sciences71005-20Alcohol prep wipe, 2-ply, medium size.

Riferimenti

  1. Canadian Cancer Society. . Cancer Statistics 2023. , (2023).
  2. . Glioblastoma Research Organization Available from: https://www.gbmresearch.org (2024)
  3. Carpentier, A., et al. Laser thermal therapy: Real-time MRI-guided and computer-controlled procedures for metastatic brain tumors. Lasers Surg Med. 43 (10), 943-950 (2011).
  4. Haddad, A. F., et al. Mouse models of glioblastoma for the evaluation of novel therapeutic strategies. Neurooncol Adv. 3 (1), vdab100 (2021).
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