Piezo-ICSI per ovociti umani

Qui, descriviamo un protocollo per l'iniezione intracitoplasmatica di spermatozoi in ovociti umani utilizzando una micropipetta piezoguidata.

Da quando sono state segnalate le prime gravidanze di successo ottenute con l'iniezione intracitoplasmatica di spermatozoi (ICSI), l'ICSI è diventata una tecnica essenziale nella tecnologia di riproduzione assistita (ART). L'ICSI utilizza micropipette con punta appuntita per penetrare nella zona pellucida e nella membrana. Quindi, il citoplasma viene solitamente aspirato nella micropipetta per la rottura della membrana (ICSI convenzionale). I tassi di sopravvivenza e fecondazione degli ovociti di topo dopo ICSI convenzionale erano rispettivamente del 16% e dell'8%. Kimura e Yanagimachi hanno applicato un'unità di azionamento piezoelettrica, mercurio e una micropipetta con punta piatta per ICSI del topo. La rottura della membrana potrebbe essere eseguita in modo semi-automatico combinando questi tipi di apparecchiature senza aspirazione citoplasmatica nella micropipetta (piezo-ICSI). Questi autori hanno riportato tassi di sopravvivenza e fecondazione significativamente più elevati (80% e 78%) rispetto a quelli dell'ICSI convenzionale (16% e 8%). Pertanto, la piezo-ICSI può essere efficace non solo per gli ovociti di topo ma anche per l'ICSI degli ovociti umani. Tuttavia, sono disponibili solo cinque articoli che hanno valutato l'efficacia della piezo-ICSI rispetto alla ICSI convenzionale per gli ovociti umani. Tutti e cinque questi articoli hanno riportato tassi di fecondazione significativamente più elevati rispetto a quelli dell'ICSI convenzionale. L'obiettivo del protocollo piezo-ICSI qui descritto è quello di migliorare i risultati clinici dell'ICSI rispetto all'ICSI convenzionale.

Da quando il Dr. Palermo ha riportato le prime gravidanze di successo ottenute con l'iniezione intracitoplasmatica di spermatozoi (ICSI)¹, l'ICSI è diventata una tecnica essenziale nella tecnologia di riproduzione assistita (ART). L'ICSI utilizza micropipette con punta appuntita per penetrare nella zona pellucida e nella membrana. Quindi, il citoplasma viene solitamente aspirato nella micropipetta per la rottura della membrana (ICSI convenzionale). I tassi di sopravvivenza e fecondazione degli ovociti di topo dopo ICSI convenzionale sono stati rispettivamente del 16% e dell'8%². Kimura e Yanagimachi hanno applicato un'unità di azionamento piezoelettrica, mercurio e una micropipetta con punta piatta per mouse ICSI². La rottura della membrana può essere eseguita in modo semi-automatico combinando questi tipi di apparecchiature (piezo-ICSI). Questi autori hanno riportato tassi di sopravvivenza e fecondazione significativamente più elevati (80% e 78%) della piezo-ICSI rispetto a quelli della ICSI convenzionale (16% e 8%)². Uno dei motivi dei migliori risultati ottenuti nel piezo-ICSI potrebbe essere il processo di rottura della membrana. Il piezo-ICSI è in grado di rompere in modo stabile e semiautomatico la membrana senza aspirazione citoplasmatica nella micropipetta. Questi risultati hanno suggerito che l'aspirazione citoplasmatica nella micropipetta durante la rottura della membrana è invasiva per gli ovociti di topo. Pertanto, la piezo-ICSI può essere efficace non solo per gli ovociti di topo ma anche per l'ICSI degli ovociti umani.

Tuttavia, solo cinque articoli disponibili hanno valutato l'efficacia della piezo-ICSI rispetto alla ICSI convenzionale per gli ovociti umani. Tutti e cinque questi articoli hanno riportato tassi di fecondazione significativamente più elevati con piezo-ICSI rispetto ai tassi di fecondazione con ICSI convenzionale 3,4,5,6,7 (Tabella 1). Pertanto, la piezo-ICSI può migliorare i tassi di sopravvivenza e fecondazione rispetto alla ICSI convenzionale. L'obiettivo del protocollo piezo-ICSI qui descritto è quello di migliorare i risultati clinici dell'ICSI rispetto all'ICSI convenzionale.

Il protocollo di piezo-ICSI descritto di seguito segue le linee guida del comitato etico per la ricerca umana presso il Kameda Medical Center.

1. Attrezzatura e preparazione

1. Utilizzare un sistema piezo-ICSI composto da un'unità di azionamento, una scatola operativa, un interruttore a pedale e un controller. Utilizza qualsiasi tipo di microscopio invertito o micromanipolatore a tre assi. Collegare l'unità di azionamento piezoelettrico al supporto della micropipetta e posizionare l'interruttore a pedale sul pavimento. Impostare il livello di INTENSITÀ su 2 e il livello di VELOCITÀ su 1 sulla scatola operativa.
2. Utilizzare una micropipetta piezo-ICSI disponibile in commercio con punta piatta. Riempire una micropipetta con il liquido operativo (fluido a base di fluorocarburi) fino a una lunghezza di 20 mm. Evitare di mescolare bolle d'aria nel liquido operativo. Aspirare eventuali bolle d'aria o liquido di funzionamento in eccesso verso la parte posteriore della pipetta con il dispositivo di riempimento del liquido.
3. Installare la micropipetta nel supporto per micropipette per iniezione. Se il supporto per micropipette per iniezione ha un tubo in silicone, inserire la testa della pipetta per circa 5 mm nel tubo in silicone. Serrare il tappo di supporto e fissare saldamente la micropipetta.
4. Fissare l'unità di azionamento al manipolatore e fissarla saldamente per evitare qualsiasi rotazione causata dal suo peso.
5. Posizionare la micropipetta nel campo del microscopio. Azionare l'iniettore e spingere il liquido di funzionamento verso la testa della micropipetta in modo che l'aria all'interno della testina della pipetta venga espulsa. Verificare che non vi sia più aria all'interno della testina della pipetta ad occhio nudo anziché al microscopio.
6. Preparare la capsula ICSI sulla capsula con fondo di vetro come mostrato nella Figura 1. Preparare due microgoccioline di soluzione di polivinilpirrolidone al 7% (PVP): la microgoccia più piccola è per la preparazione della micropipetta (5 μL) e l'altra è per la selezione degli spermatozoi (10 μL). Preparare un'altra goccia formata al centro del piatto con fondo di vetro dal mezzo tamponato; questa microgoccia è per l'ovocita e viene utilizzata per l'iniezione di spermatozoi (8 μL).
7. Inserire la testina della micropipetta in una gocciolina di PVP al 7% e rivestire la parete interna della micropipetta. Azionare energicamente l'iniettore, spostandolo lungo il confine interfacciale tra il liquido operativo e il PVP. Sciacquare l'interno della micropipetta con PVP a circa 800 μm dalla testa della pipetta.
   1. Ripetere questa procedura (~3 o 4 volte) fino a quando il bordo interfacciale non scorre uniformemente.

2. Immobilizzazione dello sperma

1. Impostare il livello di INTENSITÀ su 2 e il livello di VELOCITÀ su 1 sulla scatola operativa. Applicare l'impulso piezoelettrico dall'unità di azionamento collegata al supporto della micropipetta quando l'interruttore a pedale è acceso. Quando si applica l'impulso piezoelettrico durante la procedura, l'icona "Impulso piezoelettrico" appare in alto a destra del video.
2. Raccogli gli spermatozoi mobili utilizzando un gradiente di densità e trattieni gli spermatozoi mobili raccolti nel terreno tamponato. Aspirare il terreno tamponato che trattiene gli spermatozoi mobili raccolti a circa 2-3 μL utilizzando una pipetta. Quindi iniettare questo mezzo nella parte inferiore della microgoccia di PVP al 7%. Seleziona lo sperma con un ingrandimento inferiore a 400x.
   1. Collegare la punta della micropipetta alla coda dello spermatozoo selezionato, quindi azionare l'unità di azionamento piezoelettrica. In genere, ripetere la guida 3 volte per un'immobilizzazione dello sperma. Dopo l'immobilizzazione degli spermatozoi, aspirare prima gli spermatozoi nella coda della micropipetta.

3. Operazione piezo-ICSI (un ovocita con una membrana ad alta capacità di allungamento)

1. Tenere la testa dello spermatozoo in una posizione a circa un angolo di distanza tra gli spermatozoi a tutta lunghezza e la testa della micropipetta. Durante l'azionamento dell'unità di azionamento piezoelettrico (circa 5 volte per un ovocita), far avanzare la micropipetta per eseguire la puntura senza deformazioni della zona pellucida. Quando la punta della micropipetta raggiunge lo strato interno della zona pellucida e quindi il pezzo scavato della zona pellucida viene completamente aspirato nella micropipetta, la puntura della zona pellucida è completata.
2. Rimuovere il pezzo scavato della zona pellucida all'interno della micropipetta e allo stesso tempo spostare lo spermatozoo sulla testa della micropipetta. Spingere la micropipetta e allungare la membrana citoplasmatica fino a circa il 90% del diametro dell'ovocita.
3. Quando è sufficientemente teso, avviare una volta l'azionamento piezoelettrico per rompere la membrana. La rottura della membrana è completata quando viene confermato che la membrana è rimbalzata.
4. Dopo la rottura della membrana, iniettare la testa dello spermatozoo nell'ovocita. Dopo che la testa dello spermatozoo è stata sicuramente iniettata nel citoplasma, prestare attenzione a non aggiungere liquidi non necessari.

4. Operazione piezo-ICSI (un ovocita con una membrana a bassa capacità di allungamento)

NOTA: Spieghiamo come comportarsi con un ovocita con una membrana a bassa capacità di stiramento che può rompersi spontaneamente durante lo stretching.

1. Eseguire la stessa azione dell'ovocita con una membrana ad alta capacità di allungamento fino al punto di allungare la membrana citoplasmatica.
2. Se la membrana si rompe spontaneamente durante l'azione, iniettare la testa dello spermatozoo dalla posizione della micropipetta senza spingerla ulteriormente in avanti per evitare la degenerazione degli ovociti dopo l'iniezione di spermatozoi.
3. Dopo che la testa dello spermatozoo è stata sicuramente iniettata nel citoplasma, prestare attenzione a non aggiungere liquidi non necessari.

L'ICSI convenzionale e la piezo-ICSI descritte sopra sono state eseguite su 10.488 ovociti maturi (1.744 cicli) da 4 embriologi. Di questi, 3.522 ovociti (587 cicli) sono stati inseminati mediante ICSI convenzionale tra gennaio 2013 e settembre 2016 e 6.966 ovociti (1.157 cicli) sono stati inseminati mediante piezo-ICSI tra ottobre 2016 e dicembre 2020 presso il Kameda Medical Center. La Tabella 1 mostra l'età media delle donne, i tassi di fecondazione, i tassi di sopravvivenza, i tassi di degenerazione, i tassi di blastocisti al 5° giorno e il numero medio di blastocisti crioconservate per cicli di ICSI convenzionale e piezo-ICSI. Sebbene l'età media delle donne con piezo-ICSI fosse più alta rispetto a quella con ICSI convenzionale, i tassi di fecondazione, sopravvivenza e blastocisti e il numero medio di blastocisti crioconservate per cicli di piezo-ICSI erano significativamente più alti rispetto a quelli dell'ICSI convenzionale (Tabella 2).

Figura 1: Piatto ICSI utilizzato per piezo-ICSI. Il layout delle microgoccioline è descritto qui. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Confronto dei tassi di fecondazione tra ICSI convenzionale e piezo-ICSI. In tutti i rapporti, sono stati osservati tassi di fecondazione significativamente più elevati nel piezo-ICSI rispetto a quelli del convenzionale-ICSI.

Tabella 2: Risultati clinici del Kameda Medical Center che confrontano l'efficacia dell'ICSI convenzionale e del piezo-ICSI. In tutti gli elementi di confronto, sono stati osservati risultati significativamente migliori nell'ICSI piezoelettrico rispetto a quelli dell'ICSI convenzionale.

I risultati hanno dimostrato che i tassi di fecondazione, i tassi di sopravvivenza, i tassi di blastocisti al giorno 5 e il numero medio di blastocisti crioconservate della piezo-ICSI erano significativamente più alti rispetto a quelli della ICSI convenzionale.

Ci sono 2 passaggi critici nel protocollo piezo-ICSI. Il primo passo consiste nell'attorcigliare saldamente il tappo del supporto della pipetta. Il secondo passo consiste nel mantenere il volume di PVP aspirato nella micropipetta inferiore a 300 micrometri. La torsione allentata del tappo del supporto della micropipetta e l'aspirazione del PVP nella micropipetta per più di 300 micrometri (una lunghezza completa dello spermatozoo è di circa 60 micrometri) causano difficoltà nell'immobilizzazione dello sperma, nell'apertura della zona e nella rottura della membrana a causa della diminuzione della potenza piezoelettrica. In particolare, dobbiamo sempre prestare attenzione al volume di PVP aspirato nella micropipetta durante la procedura. Questo è il limite del piezo-ICSI.

È essenziale posizionare una piccola quantità di liquido pesante come liquido operativo all'interno della micropipetta per creare la potenza piezoelettrica. Nei rapporti precedenti, il mercurio è stato utilizzato come liquido operativo ^2,3,4. Tuttavia, un fluido a base di fluorocarburi può essere utilizzato al posto del mercurio per un uso sicuro^invece 5,6,7,8,9,11. Il liquido a base di fluorocarburi ha un peso specifico di 1,8 ed è incolore, trasparente e non solubile in acqua. Il liquido operativo è a diretto contatto con il PVP che trattiene lo sperma. L'esposizione del PVP al liquido dell'operazione può avere alcuni effetti negativi sullo spermatozoo o sull'ovocita. Tuttavia, i tassi di fecondazione, sopravvivenza, blastocisti al giorno 5 della piezo-ICSI erano significativamente più alti rispetto a quelli della ICSI convenzionale nel presente studio. Riteniamo che il rischio derivante dal contatto diretto tra il liquido operativo e il PVP sia piuttosto basso.

In precedenza abbiamo misurato il tempo di preparazione della micropipetta con un iniettore d'olio e un iniettore d'aria. I tempi medi per la preparazione della micropipetta dell'iniettore d'olio e dell'iniettore d'aria sono stati rispettivamente di 233 e 106 secondi (P < 0,05)⁸. Il tempo di preparazione della micropipetta con l'iniettore d'aria è inferiore perché è privo di olio. La presenza dell'olio prolunga il tempo di preparazione della micropipetta a causa della sua viscosità. Se le bolle d'aria si mescolano nell'area dell'olio all'interno della micropipetta dopo aver inserito la micropipetta nel supporto della pipetta, la pipetta deve essere scartata perché il piezo-ICSI non funzionerà. Abbiamo anche contato il numero di micropipette sprecate durante la preparazione delle micropipette. Il numero medio di micropipette sprecate per paziente per l'iniettore d'olio e l'iniettore d'aria è stato rispettivamente di 0,28 ± 0,56 e 0 ± 0 (P < 0,05^). Tuttavia, non c'era alcuna differenza significativa tra gli iniettori di olio e aria nei tassi di sopravvivenza (99% e 99%), fecondazione (89% e 90%) e embrioni di buona qualità al giorno 3 (61% e 61%) dopo piezo-ICSI⁸. Abbiamo sprecato 3,2 ore in più e 25 micropipette nel gruppo dell'iniettore d'olio (90 pazienti) rispetto al gruppo dell'iniettore d'aria (90 pazienti) durante lo studio⁸. I risultati indicano che l'utilizzo di un iniettore d'aria invece di un iniettore d'olio è una buona modifica del piezo-ICSI.

Il piezo-ICSI può rompere la membrana in modo semiautomatico senza aspirazione citoplasmatica nella micropipetta. Questa procedura di rottura della membrana è stabile e facile. Il piezo-ICSI potrebbe anche contribuire ad abbreviare il periodo di formazione ICSI. In precedenza abbiamo valutato l'effetto della piezo-ICSI sui tassi di sopravvivenza, fecondazione, blastocisti per un giovane embriologo. Il giovane embriologo ha ricevuto la pratica piezo-ICSI 30 volte prima di iniziare il trattamento clinico ICSI. Abbiamo confrontato i tassi di sopravvivenza, fecondazione e blastocisti di embriologi giovani e anziani per i loro primi 100 ovociti. I tassi di sopravvivenza, fecondazione e blastocisti degli embriologi giovani e anziani erano rispettivamente del 100% e del 97%, 87% e 91%, 47% e 57%^9. Non c'era alcuna differenza significativa tra gli embriologi giovani e quelli anziani in tutti gli elementi di confronto. Questi risultati hanno indicato che la piezo-ICSI ha un significato nella procedura di rottura della membrana che può contribuire ad accorciare il periodo di formazione ICSI di un giovane embriologo.

Alcuni ricercatori hanno riportato l'efficienza clinica dell'iniezione intracitoplasmatica di spermatozoi morfologicamente selezionati (IMSI). Setti et al. hanno confrontato gli esiti clinici tra ICSI e IMSI in uno studio di meta-analisi¹⁰. Non c'era alcuna differenza significativa nei tassi di fecondazione tra i gruppi ICSI e IMSI¹⁰. Tuttavia, il tasso di embrioni di alta qualità del gruppo IMSI era significativamente più alto rispetto a quello del gruppo ICSI¹⁰. Per quanto ne sappiamo, nessuno studio ha esaminato l'impatto dell'IMSI combinato con piezo-ICSI sulla fecondazione e sullo sviluppo embrionale. Abbiamo studiato retrospettivamente gli effetti dell'ingrandimento della selezione degli spermatozoi (400x vs. 1.200x) sulla fecondazione e sullo sviluppo embrionale in piezo-ICSI. Il tasso di fecondazione del gruppo 1.200x (92%) era significativamente più alto rispetto a quello del gruppo 400x (77%) (P = 0,0002)¹¹. Il tasso di embrioni di buona qualità al giorno 3 del gruppo 1.200x (64%) era significativamente più alto rispetto a quello del gruppo 400x (46%) (P = 0,0021)¹¹. Abbiamo cercato di selezionare lo spermatozoo senza vacuoli nella testa dello spermatozoo con un ingrandimento di 1.200x. Questa procedura potrebbe selezionare gli spermatozoi con un grado inferiore di frammentazione del DNA spermatico¹². Pertanto, l'IMSI potrebbe essere una nuova applicazione del piezo-ICSI.

Qui, abbiamo descritto un protocollo per la piezo-ICSI che può migliorare i risultati dell'ICSI senza perdere ovociti vitali nella ART umana.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.