الحقن المجهري للبويضات البشرية

هنا ، نصف بروتوكولا لحقن المنوية داخل الهيولى في البويضات البشرية باستخدام ماصة دقيقة مدفوعة بيزو.

منذ الإبلاغ عن حالات الحمل الناجحة الأولى التي تم تحقيقها عن طريق حقن المنوية داخل الهيولى (ICSI) ، أصبح الحقن المجهري أسلوبا أساسيا في تقنية المساعدة على الإنجاب (ART). يستخدم الحقن المجهري الماصات الدقيقة ذات الطرف المتصاعد لاختراق المنطقة الشفافة والغشاء. بعد ذلك ، عادة ما يتم شفط السيتوبلازم في الماصة الدقيقة لكسر الغشاء (الحقن المجهري التقليدي). كانت معدلات بقاء وتخصيب بويضات الفئران بعد الحقن المجهري التقليدي منخفضة تصل إلى 16٪ و 8٪ على التوالي. قام كيمورا وياناجيماتشي بتطبيق وحدة محرك بيزو ، والزئبق ، وماصة دقيقة ذات طرف مسطح للحقن المجهري للفأر. يمكن إجراء كسر الغشاء بشكل شبه أوتوماتيكي عن طريق الجمع بين هذه الأنواع من المعدات دون الشفط السيتوبلازمي في الماصة الدقيقة (الحقن البيزوئي). أبلغ هؤلاء المؤلفون عن معدلات بقاء وإخصاب أعلى بشكل ملحوظ (80٪ و 78٪) مقارنة بمعدلات الحقن المجهري التقليدي (16٪ و 8٪). لذلك ، قد يكون الحقن المجهري فعال ليس فقط لبويضات الفئران ولكن أيضا للحقن المجهري للبويضات البشرية. ومع ذلك ، لا تتوفر سوى خمس أوراق بحثية لتقييم فعالية الحقن المجهري الرضوخي مقارنة بالحقن المجهري التقليدي للبويضات البشرية. أبلغت جميع هذه الأوراق الخمس عن معدلات إخصاب أعلى بكثير مقارنة بتلك الموجودة في الحقن المجهري التقليدي. الهدف من بروتوكول piezo-ICSI الموصوف هنا هو تحسين النتائج السريرية للحقن المجهري مقارنة بالحقن المجهري التقليدي.

منذ أن أبلغ الدكتور باليرمو عن أول حالات حمل ناجحة تم تحقيقها عن طريق حقن المنوية داخل الهيولى ^(ICSI)1 ، أصبح الحقن المجهري تقنية أساسية في تقنية المساعدة على الإنجاب (ART). يستخدم الحقن المجهري الماصات الدقيقة ذات الطرف المتصاعد لاختراق المنطقة الشفافة والغشاء. بعد ذلك ، عادة ما يتم شفط السيتوبلازم في الماصة الدقيقة لكسر الغشاء (الحقن المجهري التقليدي). كانت معدلات البقاء على قيد الحياة والتخصيب لبويضات الفئران بعد الحقن المجهري التقليدي منخفضة تصل إلى 16٪ و 8٪ على التوالي². قام كيمورا وياناجيماتشي بتطبيق وحدة محرك بيزو ، والزئبق ، وماصة دقيقة ذات طرف مسطح للفأر ICSI². يمكن إجراء كسر الغشاء بشكل شبه أوتوماتيكي من خلال الجمع بين هذه الأنواع من المعدات (piezo-ICSI). أبلغ هؤلاء المؤلفون عن معدلات بقاء وإخصاب أعلى بكثير (80٪ و 78٪) من الحقن المجهري التفاعلي مقارنة بتلك الموجودة في الحقن المجهري التقليدي (16٪ و 8٪)². قد يكون أحد أسباب النتائج الأفضل التي تم الحصول عليها في الحقن المجهري هو عملية كسر الغشاء. يمكن للحقن المجهري بيزو أن يكسر الغشاء بثبات وشبه تلقائي دون الشفط السيتوبلازمي في الماصة الدقيقة. أشارت هذه النتائج إلى أن الشفط السيتوبلازمي في الماصة الدقيقة أثناء كسر الغشاء غازي لبويضات الفئران. لذلك ، قد يكون الحقن المجهري فعال ليس فقط لبويضات الفئران ولكن أيضا للحقن المجهري للبويضات البشرية.

ومع ذلك ، فقد قيمت خمس أوراق متاحة فقط فعالية الحقن المجهري التقليدي للبويضات البشرية. أبلغت جميع هذه الأوراق الخمس عن معدلات إخصاب أعلى بكثير باستخدام الحقن المجهري مقارنة بمعدلات الإخصاب مع الحقن المجهري^{التقليدي 3،4،5،6،7} (الجدول 1). لذلك ، قد يحسن الحقن المجهري بيزو معدلات البقاء والتخصيب مقارنة بالحقن المجهري التقليدي. الهدف من بروتوكول piezo-ICSI الموصوف هنا هو تحسين النتائج السريرية للحقن المجهري مقارنة بالحقن المجهري التقليدي.

يتبع بروتوكول piezo-ICSI الموضح أدناه إرشادات لجنة أخلاقيات البحث البشري في مركز كاميدا الطبي.

1. المعدات والتحضير

1. استخدم نظام piezo-ICSI المكون من وحدة محرك وصندوق تشغيل ومفتاح قدم ووحدة تحكم. استخدم أي نوع من المجهر المقلوب أو معالج دقيق ثلاثي المحاور. قم بتوصيل وحدة محرك بيزو بحامل الماصة الدقيقة ، وضع مفتاح القدم على الأرض. اضبط مستوى INTENSITY على 2 ومستوى SPEED إلى 1 في مربع التشغيل.
2. استخدم ماصة دقيقة بيزو الحقن المجهري متوفرة تجاريا بطرف مسطح. املأ ماصة دقيقة بسائل التشغيل (سائل قائم على الفلوروكربون) بطول 20 مم. تجنب خلط أي فقاعات هواء في سائل التشغيل. قم بشفط أي فقاعات هواء أو سائل تشغيل زائد باتجاه الجزء الخلفي من الماصة باستخدام جهاز تعبئة السائل.
3. قم بتركيب الماصة الدقيقة في حامل الماصة الدقيقة للحقن. إذا كان حامل ماصة الحقن الدقيقة يحتوي على أنبوب سيليكون ، فأدخل رأس الماصة حوالي 5 مم في أنبوب السيليكون. شد غطاء الحامل وثبت الماصة الدقيقة بإحكام.
4. قم بتوصيل وحدة القيادة بالمناور وثبتها بإحكام لتجنب أي دوران ناتج عن وزنها.
5. ضع الماصة الدقيقة في مجال المجهر. قم بتشغيل الحاقن وادفع سائل التشغيل إلى رأس الماصة الدقيقة بحيث يتم ضغط أي هواء داخل رأس الماصة للخارج. تأكد من عدم وجود هواء متبقي داخل رأس الماصة بالعين المجردة بدلا من المجهر.
6. تحضير طبق الحقن المجهري على الطبق ذو القاع الزجاجي كما هو موضح في الشكل 1. قم بإعداد قطرتين صغيرتين من محلول بولي فينيل بيروليدون بنسبة 7٪ (PVP): القطرة الدقيقة الأصغر مخصصة لتحضير الماصة الدقيقة (5 ميكرولتر) والأخرى لاختيار المنوية (10 ميكرولتر). تحضير قطرة أخرى مصنوعة في وسط الطبق ذو القاع الزجاجي من الوسط المخزن ؛ هذه القطرة الدقيقة مخصصة للبويضة وتستخدم لحقن المنوية (8 ميكرولتر).
7. أدخل رأس الماصة الدقيقة في قطرة PVP بنسبة 7٪ وقم بتغطية الجدار الداخلي للماصة الدقيقة. قم بتشغيل الحاقن بقوة ، وتحريكه على طول الحدود البينية بين سائل التشغيل و PVP. اشطف الجزء الداخلي من الماصة الدقيقة باستخدام PVP على بعد حوالي 800 ميكرومتر من رأس الماصة.
   1. كرر هذا الإجراء (~ 3 أو 4 مرات) حتى تنزلق الحدود البينية بسلاسة.

2. تجميد المنوية

1. اضبط مستوى INTENSITY على 2 ومستوى SPEED إلى 1 في مربع التشغيل. ضع نبضة بيزو من وحدة الإدارة المتصلة بحامل الماصة الدقيقة عند تشغيل مفتاح القدم. عند تطبيق نبض بيزو أثناء الإجراء ، تظهر أيقونة "نبض بيزو" في الجزء العلوي الأيمن من الفيديو.
2. اجمع المنوية المتحركة باستخدام تدرج الكثافة واحتفظ بالحيوانات المنوية المتحركة المجمعة في الوسط المخزن مؤقتا. استنشق الوسط المخزن الذي يحمل المنوية المتحركة المجمعة حوالي 2-3 ميكرولتر باستخدام ماصة. ثم قم بحقن هذا الوسيط في الجانب السفلي من قطرة PVP الدقيقة بنسبة 7٪. حدد المنوية تحت تكبير 400 ضعف.
   1. قم بتوصيل طرف الماصة الدقيقة بذيل المنوية المحددة ثم قم بتشغيل وحدة محرك البيزو. عادة ، كرر القيادة 3 مرات لتثبيت منوي واحد. بعد تثبيت المنوية، استنشق المنوية في ذيل الماصة الدقيقة أولا.

3. عملية Piezo-ICSI (بويضة ذات غشاء عالي القدرة على التمدد)

1. حافظ على رأس المنوية في وضع منوي كامل الطول تقريبا من رأس الماصة الدقيقة. أثناء قيادة وحدة محرك بيزو (حوالي 5 مرات لكل بويضة واحدة) ، قم بتطوير الماصة الدقيقة لتنفيذ الثقب دون تشوه المنطقة الشفافة. عندما يصل طرف الماصة الدقيقة إلى الطبقة الداخلية من المنطقة الشفافة ثم يتم شفط القطعة المجوفة من المنطقة الشفافة بالكامل في الماصة الدقيقة ، يكتمل ثقب المنطقة الشفافة.
2. قم بإزالة القطعة المجوفة من المنطقة الشفافة داخل الماصة الدقيقة وفي نفس الوقت انقل المنوية إلى رأس الماصة الدقيقة. ادفع الماصة الدقيقة للداخل وقم بتمديد الغشاء السيتوبلازمي حتى حوالي 90٪ من قطر البويضة.
3. عندما يتم تمديده بدرجة كافية ، ابدأ تشغيل محرك بيزو مرة واحدة لتمزيق الغشاء. يكتمل كسر الغشاء عندما يتم التأكد من انتعاش الغشاء.
4. بعد كسر الغشاء ، قم بحقن رأس المنوية في البويضة. بعد حقن رأس المنوية بالتأكيد في السيتوبلازم ، انتبه إلى عدم إضافة سائل غير ضروري.

4. عملية Piezo-ICSI (بويضة ذات غشاء منخفض القدرة على التمدد)

ملاحظة: نوضح كيفية التعامل مع البويضة ذات الغشاء منخفض القدرة على التمدد والتي قد تتمزق تلقائيا أثناء التمدد.

1. قم بنفس الإجراء مثل البويضة بغشاء عالي القدرة على التمدد حتى نقطة شد الغشاء السيتوبلازمي.
2. إذا تمزق الغشاء تلقائيا أثناء الإجراء ، فقم بحقن رأس المنوية من موضع الماصة الدقيقة دون دفعها إلى الأمام لتجنب تنكس البويضات بعد حقن المنوية.
3. بعد حقن رأس المنوية بالتأكيد في السيتوبلازم ، انتبه إلى عدم إضافة سائل غير ضروري.

تم إجراء الحقن المجهري التقليدي والحقن المجهري المزعج الموصوف أعلاه على 10،488 بويضة ناضجة (1،744 دورة) من قبل 4 علماء أجنة. من بين هذه البويضات ، تم تلقيح 3,522 بويضة (587 دورة) بواسطة الحقن المجهري التقليدي بين يناير 2013 وسبتمبر 2016 وتم تلقيح 6,966 بويضة (1,157 دورة) بواسطة الحقن المجهري بين أكتوبر 2016 وديسمبر 2020 في مركز كاميدا الطبي. يوضح الجدول 1 متوسط عمر النساء ، ومعدلات الإخصاب ، ومعدلات البقاء على قيد الحياة ، ومعدلات التنكس ، ومعدلات الكيسة الأريمية في اليوم الخامس ، ومتوسط عدد الأكياس الأريمية المحفوظة بالتبريد لكل دورة من الحقن المجهري التقليدي والحقن المجهري التفاعلي. على الرغم من أن متوسط عمر النساء للحقن المجهري كان أعلى مقارنة بالحقن المجهري التقليدي ، إلا أن معدلات الإخصاب والبقاء على قيد الحياة والكيسة الأريمية ومتوسط عدد الأكياس الأريمية المحفوظة بالتبريد لكل دورة من الحقن المجهري كان أعلى بكثير مقارنة بتلك الموجودة في الحقن المجهري التقليدي (الجدول 2).

الشكل 1: طبق الحقن المجهري المستخدم في الحقن المجهري. يتم وصف تخطيط القطرات الدقيقة هنا. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: مقارنة معدلات الإخصاب بين الحقن المجهري التقليدي والحقن المجهري التفاعلي. في جميع التقارير ، لوحظت معدلات إخصاب أعلى بكثير في الحقن المجهري مقارنة بتلك الموجودة في الحقن المجهري التقليدي.

الجدول 2: النتائج السريرية لمركز كاميدا الطبي التي تقارن فعالية الحقن المجهري التقليدي والحقن المجهري التقليدي. في جميع عناصر المقارنة ، لوحظت نتائج أفضل بشكل ملحوظ في الحقن المجهري التقليدي مقارنة بتلك الخاصة بالحقن المجهري التقليدي.

أظهرت النتائج أن معدلات الإخصاب ، ومعدلات البقاء على قيد الحياة ، ومعدلات الكيسة الأريمية في اليوم الخامس ، ومتوسط عدد الأكياس الأريمية المحفوظة بالتبريد في الحقن المجهري بيزو كانت أعلى بكثير مقارنة بتلك الموجودة في الحقن المجهري التقليدي.

هناك 2 خطوات حاسمة في بروتوكول piezo-ICSI. تتمثل الخطوة الأولى في لف غطاء حامل الماصة بإحكام. الخطوة الثانية هي الحفاظ على حجم PVP المستنشق في الماصة الدقيقة أقل من 300 ميكرومتر. يؤدي التواء غطاء حامل حامل الماصة الدقيقة بشكل فضفاض وشفط PVP إلى الماصة الدقيقة أكثر من 300 ميكرومتر (يبلغ طول المنوية بالكامل حوالي 60 ميكرومتر) في حدوث صعوبات في تثبيت المنوية وفتح المنطقة وكسر الغشاء بسبب انخفاض قوة بيزو. على وجه الخصوص ، يتعين علينا دائما الانتباه إلى حجم PVP المستنشق في الماصة الدقيقة أثناء العملية. هذا هو الحد من الحقن المجهري الشعري بيزو.

من الضروري وضع كمية صغيرة من السائل الثقيل كسائل تشغيل داخل الماصة الدقيقة لإنشاء قوة بيزو. في التقارير السابقة ، تم استخدام الزئبق كسائل تشغيلي^2،3،4. ومع ذلك ، يمكن استخدام سائل قائم على الفلوروكربون بدلا من الزئبق للاستخدام الآمن بدلا من^{5،6،7،8،9،11}. السائل القائم على الفلوروكربون له ثقل نوعي يبلغ 1.8 ، وهو عديم اللون وشفاف وغير قابل للذوبان في الماء. سائل العملية له اتصال مباشر مع PVP الذي يحمل المنوية. قد يكون لتعرض PVP لسائل العملية بعض الآثار السلبية على المنوية أو البويضة. ومع ذلك ، كانت معدلات الإخصاب والبقاء على قيد الحياة والكيسة الأريمية في اليوم 5 من الحقن المجهري الحزمي أعلى بشكل ملحوظ مقارنة بتلك الخاصة بالحقن المجهري التقليدي في هذه الدراسة. نعتقد أن المخاطر الناجمة عن الاتصال المباشر بين سائل التشغيل و PVP منخفضة للغاية.

قمنا سابقا بقياس وقت تحضير الماصة الدقيقة باستخدام حاقن زيت وحاقن هواء. كان متوسط أوقات تحضير الماصة الدقيقة لحاقن الزيت وحاقن الهواء 233 و 106 ثانية على التوالي (P < 0.05)⁸. يكون وقت تحضير الماصة الدقيقة مع حاقن الهواء أقل لأنه خال من الزيت. يؤدي وجود الزيت إلى إطالة وقت تحضير الماصة الدقيقة بسبب لزوجتها. إذا اختلطت فقاعات الهواء في منطقة الزيت داخل الماصة الدقيقة بعد إدخال الماصة الدقيقة في حامل الماصة، فيجب التخلص من الماصة لأن الحقن المجهري لن يعمل. قمنا أيضا بحساب عدد الماصات الدقيقة المهدرة أثناء تحضير الماصة الدقيقة. كان متوسط عدد الماصات الدقيقة المهدرة لكل مريض لحاقن الزيت وحاقن الهواء 0.28 ± 0.56 و0 ± 0 (P < 0.05) ، على^{التوالي 8.} ومع ذلك ، لم يكن هناك فرق كبير بين حاقنات الزيت والهواء في معدلات البقاء على قيد الحياة (99٪ و 99٪) ، والتخصيب (89٪ و 90٪) ، والأجنة ذات النوعية الجيدة في اليوم الثالث (61٪ و 61٪) بعد الحقن^{المجهري 8}. أهدرنا 3.2 ساعة إضافية و 25 ماصة دقيقة في مجموعة حاقن الزيت (90 مريضا) مقارنة بمجموعة حاقن الهواء (90 مريضا) خلال الدراسة⁸. تشير النتائج إلى أن استخدام حاقن الهواء بدلا من حاقن الزيت هو تعديل جيد للحقن المجهري الضغطي.

يمكن للحقن المجهري بيزو أن يكسر الغشاء بشكل شبه أوتوماتيكي دون الشفط السيتوبلازمي في الماصة الدقيقة. إجراء كسر الغشاء هذا مستقر وسهل. يمكن أن يساهم الحقن المجهري أيضا في تقصير فترة التدريب على الحقن المجهري. قمنا سابقا بتقييم تأثير الحقن المجهري على معدلات البقاء على قيد الحياة والتخصيب والكيسة الأريمية لعالم الأجنة الشاب. تلقى عالم الأجنة الشاب ممارسة الحقن المجهري 30 مرة قبل بدء العلاج بالحقن المجهري السريري. قارنا معدلات البقاء على قيد الحياة والتخصيب والكيسة الأريمية لعلماء الأجنة الصغار والكبار من أجل 1st 100 بويضة. كانت معدلات البقاء على قيد الحياة والتخصيب والكيسة الأريمية لعلماء الأجنة الصغار والكبار 100٪ و 97٪ و 87٪ و 91٪ و 47٪ و 57٪ على التوالي⁹. لم يكن هناك فرق كبير بين علماء الأجنة الصغار وكبار علماء الأجنة في جميع عناصر المقارنة. أشارت هذه النتائج إلى أن الحقن المجهري للحقن الحزمي له أهمية في إجراء كسر الغشاء الذي يمكن أن يساهم في تقصير فترة تدريب الحقن المجهري لعالم الأجنة الشاب.

أبلغ بعض الباحثين عن الكفاءة السريرية لحقن المنوية المختارة شكليا داخل الهيولى (IMSI). قارن Setti et al. النتائج السريرية بين الحقن المجهري و IMSI في دراسة تحليل تلوي¹⁰. لم يكن هناك فرق يعتد به في معدلات الإخصاب بين الحقن المجهري ومجموعات^{IMSI 10}. ومع ذلك ، كان معدل الجنين عالي الجودة لمجموعة IMSI أعلى بكثير مقارنة بمجموعة الحقن^{المجهري 10}. على حد علمنا ، لم تفحص أي دراسة تأثير IMSI جنبا إلى جنب مع الحقن المجهري على الإخصاب ونمو الجنين. لقد حققنا بأثر رجعي في آثار تكبير اختيار المنوية (400x مقابل 1,200x) على الإخصاب وتطور الجنين في الحقن المجهري piezo. كان معدل الإخصاب لمجموعة 1,200x (92٪) أعلى بكثير مقارنة بمجموعة 400x (77٪) (P = 0.0002)¹¹. كان معدل الجنين الجيد في اليوم الثالث لمجموعة 1,200x (64٪) أعلى بكثير مقارنة بمجموعة 400x (46٪) (P = 0.0021)¹¹. حاولنا اختيار المنوية بدون فجوات في رأس المنوية تحت تكبير 1,200 مرة. قد يختار هذا الإجراء المنوية بدرجة أقل من تجزئة الحمض النووي للحيوانات المنوية¹². لذلك ، قد يكون IMSI تطبيقا جديدا للحقن المجهري التفاعلي.

هنا ، وصفنا بروتوكولا للحقن المجهري الحقن الحزمي يمكنه تحسين نتائج الحقن المجهري دون فقدان البويضات القابلة للحياة في العلاج المضاد للفيروسات القهقرية البشرية.

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.