Risonanza magnetica funzionale (fMRI) con Auditory Stimulation in uccelli canori

Questo articolo mostra una procedura ottimizzata per l'imaging dei substrati neurali della stimolazione uditiva nel cervello Songbird utilizzando la risonanza magnetica funzionale (fMRI). Esso descrive la preparazione degli stimoli sonori, il posizionamento del soggetto e l'acquisizione e la successiva analisi dei dati fMRI.

La neurobiologia del canto degli uccelli, come modello per il linguaggio umano, è una zona marcata di ricerca in neuroscienze comportamentali. Considerando che l'elettrofisiologia e molecolare approcci permettono l'indagine sia stimoli differenti su alcuni neuroni, o uno stimolo in grandi parti del cervello, il livello di ossigenazione del sangue dipendente (BOLD), risonanza magnetica funzionale (fMRI) permette di combinare entrambi i vantaggi, cioè confrontare l'attivazione neurale indotta da stimoli differenti in tutto il cervello in una volta. fMRI in uccelli canori è impegnativo a causa delle piccole dimensioni del loro cervello e perché le loro ossa e soprattutto il loro cranio comprendono numerose cavità d'aria, inducendo importanti artefatti di suscettibilità. Gradient-echo (GE) fMRI BOLD è stato applicato con successo per uccelli canori ^1-5 (per una rassegna, vedi ^6). Questi studi si sono concentrati sulle aree cerebrali uditive primarie e secondarie, che sono le regioni libere di artefatti di suscettibilità. Tuttavia, poiché proccessi di interesse possono verificarsi al di là di queste regioni, è necessaria tutta la fMRI BOLD cervello utilizzando una sequenza MRI meno suscettibile a questi manufatti. Ciò può essere ottenuto utilizzando spin-echo (SE) BOLD fMRI ^7,8. In questo articolo, si descrive come utilizzare questa tecnica in diamanti mandarini (Taeniopygia guttata), che sono piccoli uccelli canori, con un peso di 15-25 g ampiamente studiato in neuroscienze comportamentali del canto degli uccelli. Il tema principale di studi fMRI su uccelli canori è percezione canzone e canzone apprendimento. La natura degli stimoli uditivi in ​​combinazione con i deboli sensibilità BOLD di SE (rispetto a GE) sequenze fMRI basati rende l'implementazione di questa tecnica molto impegnativo.

1. Preparazione degli stimoli uditivi

1. Prima di registrare il suono-stimolo, mentre in fase di riproduzione all'interno del foro del sistema MR 7T. L'alesaggio è uno spazio limitato che può distorcere gli stimoli uditivi con conseguente valorizzazione di determinate frequenze uditive. Figura 1 mostra le frequenze enfatizzate e repressa come dimostrano le nostre registrazioni di rumore bianco realizzato in corrispondenza della posizione della testa degli stessi all'interno del magnete con un microfono in fibra ottica (Optimic 1160, Optoacoustics). Per compensare questo aumento artificiale, una funzione di equalizzazione viene applicata a ogni stimolo utilizzando il software WaveLab. Per la nostra particolare configurazione, la funzione consiste di un kernel gaussiano con i seguenti parametri: ampiezza massima:-20dB, centrata su 3.750 Hz, larghezza: 0,05 ottave (corrispondente al range 2.500-5.000 Hz per il nostro sistema).
2. Gli stimoli brani sono composti da diversi singoli motivi canto di ogni uccello intercalati con periodi di silenzio. Il dfigurazione di questi periodi di silenzio viene regolata per mantenere la quantità totale di suono e silenzio identiche per tutti gli stimoli. Questa costruzione conserva la naturale variabilità intra-individuale e inter-individuale della durata del brano. La lunghezza totale di ogni stimolo è 16 sec. L'intensità di ogni canzone è normalizzato in termini di abbinamento root-mean-square e passa-alto a 400 Hz filtrata prima di essere integrato nel stimolo completo (canto e periodi di silenzio). Queste manipolazioni sono effettuate utilizzando il software Praat.
3. L'esperimento è costituito da un ON / OFF di blocco di design si alternano periodi di stimolazione uditiva (su blocchi) con periodi di riposo (OFF blocchi) (Figura 2). Ogni blocco (ON e OFF) dura 16 sec, che corrisponde al tempo di acquisizione di due immagini (vedi sotto per acquisizione). Ogni tipo di stimolo è presentato 25 volte, con la conseguente acquisizione di 50 immagini al stimolo e per ogni soggetto. L'ordine di presentazione delle condizioni dovrebbe essere randomizzati entro e trasoggetti. Questo ordine casuale degli stimoli può essere codificato in un software di presentazione.

2. Oggetto Preparazione

2.1 Oggetto e dimensione del gruppo

Qui vi presentiamo un protocollo specificamente adattate per l'uso di (adulti) diamanti mandarini. La scelta della specie dipende dalla domanda scientifica. Tuttavia, altre considerazioni come uccello robustezza per l'anestesia può anche essere presa in considerazione. Zebra fringuelli (Taeniopygia guttata) dovrebbero essere alloggiati in voliere sotto una luce 12 ore: 12 ore fotoperiodo buio e di avere accesso a cibo e acqua ad libitum per tutto lo studio. Il numero minimo di individui per esperimento è 15. Questo numero tiene conto della sensibilità di spin-echo fMRI e la naturale variabilità interindividuale dei fenomeni biologici misurati nell'esperimento.

2.2 Installazione di configurazione e preparazione dell'animale

(Per le specifichedelle attrezzature utilizzate, si fa riferimento alla lista di reagenti e attrezzature specifiche alla fine di questo articolo)

1. Installare la maschera becco sul letto risonanza magnetica di un sistema MR 7T e collegarlo al dispositivo di controllo del gas con tubi di plastica. Aprire entrambi ossigeno e bombole di gas di azoto e accendere il dispositivo di controllo del gas (portata di ossigeno: 200 cc / min di azoto: 400 cc / min).

Come detto sopra, un sistema RM 7T è utilizzato nella configurazione presentata. Altri sistemi MR con differenti intensità di campo sono possibili, ma a 7T che viene raggiunto un buon compromesso tra rapporto segnale-rumore e grado di artefatti di suscettibilità (vedi la discussione). Ad intensità di campo superiori, il rapporto segnale-rumore aumenta con il grado di artefatti di suscettibilità.

2. Accendere il sistema di controllo di feedback e dispositivo di flusso d'aria calda.
3. Anestetizzare il diamante mandarino con il 3% isoflurano in una miscela di ossigeno e azoto, introducendo il becconella maschera e tenendo la testa verso il basso fino a quando l'uccello è completamente anestetizzati. Questo può essere verificato tirando il piede dolcemente: quando l'uccello è completamente sedato il piede non sarà ritratto dalla uccello. Inoltre, gli occhi dell'uccello saranno parzialmente chiuse.
4. Introdurre la sonda di temperatura cloacale per schermare la temperatura corporea e monitorare il tasso di respirazione mettendo un sensore pneumatico sotto il diamante mandarino pancia. Chiudere la giacca per trattenere il corpo dell'uccello (Figura 3).
5. Mantenere la frequenza respiratoria nel range di 40 - 100 respiri al minuto e mantenere costante la temperatura corporea in un intervallo ristretto di 40 ± 0,5 ° C. Quando l'intervallo di respirazione è troppo basso / alto, regolare il livello di anestesia (% isoflurano) di conseguenza. Se il problema persiste, l'esperimento deve essere interrotto e l'animale rimosso dalla configurazione al fine di recuperare.
6. Posizionare i diffusori dinamici non magnetici su entrambi i lati della testa e del fringuello con zebrali collegare all'amplificatore. Assicurarsi che i cavi degli altoparlanti sono guidati dalla sonda di temperatura, perché può influenzare la lettura della temperatura, quando troppo vicino.
7. Disporre la bobina RF superficie sulla parte superiore della testa fringuello e posizionare il diamante mandarino nel centro del magnete (e automaticamente il centro della bobina di trasmissione che si trova al centro del magnete) zebra.
8. Ridurre il livello di anestesia al 1,5% isoflurano mescolato con ossigeno e azoto.

3. Acquisizione Dati

1. Acquisire una serie di 1 sagittale, 1 orizzontale e 1 coronale gradiente echo (GE) immagine Scout (tri-pilota sequenza) e set di immagini multi-slice orizzontali, coronale e sagittale (pilotaggio T _2-ponderata rapida acquisizione relax-enhanced ( RARE) sequenza SE) per determinare la posizione del cervello nel magnete (Figura 4).
2. Diminuire il rumore dei gradienti, aumentando i loro tempi di rampa a 1.000 ms.
3. Preparare la sequenza fMRI: RARE T sequenza _2-ponderata, efficace TE: 60 msec, TR: 2.000 msec, fattore RARE: 8, FOV: 16 mm, dimensione della matrice: 64 x 32, l'orientamento: sagittale, spessore di taglio: 0,75 mm, Inter-fetta spessore dello spazio: 0,05 millimetri, 15 fette che coprono quasi tutto il cervello (Figura 4).
4. Selezionare il protocollo uditivo (stimoli uditivi e tempi di consegna stimolo) nel software di presentazione. Questo protocollo è costituito da una sequenza di comandi - per l'avvio di specifici stimoli uditivi - che vengono eseguiti in una specifica scansione-numero. Ad ogni ripetizione all'interno della sequenza fMRI, il software dello scanner invierà un trigger al software di presentazione uditiva che a sua volta registra il numero di scansione ed esegue il comando corrispondente.
5. Per assicurarsi che il software di presentazione uditiva non manca qualsiasi trigger dallo scanner, il protocollo uditivo è iniziato prima. Una volta che il protocollo è completamente caricato, la sequenza fMRI viene avviato.
6. Ogni esperimento fMRI è preceduta dalla acquisizione di 12 immagini fittizie per permettere al segnale attribuita al rumore scanner per raggiungere uno stato stabile prima di iniziare la stimolazione uditiva.
7. Dopo l'acquisizione zero riempire i dati a 64 x 64.
8. Prendete un primo (preliminare) cerca i risultati utilizzando lo strumento funzionale di Paravision (opzione di elaborazione / Imaging Funzionale). Calcolare la risposta BOLD differenziale tra tutti su blocchi e la linea di base (OFF blocchi). Questa analisi fornisce una prima indicazione della qualità dell'esperimento. Se nessun attivazione è visto nelle aree uditive primarie, in questa fase, l'uccello ha probabilmente non sente / elaborati gli stimoli uditivi a causa di problemi tecnici con la presentazione dello stimolo, il livello di anestesia, ecc L'installazione deve essere verificato e la misurazione ripetuta.
9. Eseguire un 3D RARE sequenza pesata in T2 anatomica con lo stesso orientamento come le precedenti scansioni fMRI e con efficace TE: 60 msec, TR: 2.000 msec, fattore RARE: 8, FOV: 16 mm, dimensione della matrice: 256 x 128 x 64.
10. Zero riempire i dati di 256 x 256 x 256.
11. Prendete il diamante mandarino dal letto MRI e lasciarlo recuperare da anestesia in una gabbia sotto una lampada rossa. Normalmente, il recupero di un diamante mandarino dopo isoflurano va relativamente veloce (massimo 5 min). Dopo pochi minuti, gli uccelli cercheranno di alzarsi in piedi e una volta che l'uccello è completamente recuperato, sarà appollaiarsi su un ramo invece di sedersi sul fondo della gabbia. La durata dell'anestesia è di circa 2 ore per il presente esperimento. Il tempo massimo di isoflurano applicato a diamanti mandarini nel nostro laboratorio è di 6 ore, dopo di che gli uccelli anche recuperato entro 5 min.

4. Elaborazione dati

1. Convertire il MR-dati in formato Analyze o Nifti.
2. Perché SPM è stato sviluppato per elaborare dati fMRI acquisiti in esseri umani, che è per voxel di circa 2 millimetri. Numerose impostazioni SPM sono adattati a questa dimensione approssimativa voxel. Se uno non wformica per cambiare tutte queste impostazioni, il modo più semplice di procedere è quello di aumentare artificialmente la dimensione voxel di dati fMRI uccelli. Regolare la dimensione del voxel nell'intestazione moltiplicando la dimensione reale voxel da 10 utilizzando MRIcro. Va notato, che tale rettifica non influenza i dati in sé, nessun ricampionamento o altre modifiche viene applicato l'dati.

Un'alternativa a questo è l'uso di 'SPMMouse', che è una cassetta degli attrezzi che consente SPM di aprire e analizzare i file di qualsiasi dimensione voxel. Lo strumento permette SPM 'cervelli in vetro "per essere creati da qualsiasi immagine, e regola automaticamente default scale di lunghezza basate sulle intestazioni di file di immagini o dati inseriti dall'utente. Quindi, questo toolbox funziona in modo opposto di quello che noi proponiamo. Invece di cambiare la dimensione del voxel delle immagini per adattarsi in SPM, le impostazioni di default di SPM vengono modificati per utilizzare le immagini con dimensioni diverse voxel.

3. Riallineare i dati fMRI. Co-registrazione del anatomico set di dati 3D per tegli serie temporali fMRI. Normalizzare i dati 3D (e le serie storiche fMRI co-registrata) per il diamante mandarino cervello MRI atlante. Applicare la matrice di trasformazione per il set di dati fMRI. Tutto questo può essere fatto utilizzando Statistical Parametric Mapping (SPM) del software 8.
4. Lisciare i dati con una larghezza di 0,5 mm kernel gaussiano con SPM8.
5. Effettuare analisi voxel-based statistici utilizzando SPM8. Modello dei dati come un box-auto (nessuna funzione di risposta emodinamica). Stimare i parametri del modello con l'algoritmo di massima verosimiglianza ristretta classica. Calcola l'effetto medio di ogni stimolo uditivo in ogni materia (analisi a effetti fissi) e quindi calcolare le statistiche come auspicato per le analisi di gruppo (analisi mixed-effect).
6. Proiettare la mappa parametrica statistica sul diamante mandarino atlante (Figura 5) ⁹ in SPM8 di localizzare le attivazioni funzionali (Figura 6).

Siamo qui presentate visivamente una sequenza ottimizzata di procedure per l'imaging di successo di substrati neurali di stimoli uditivi nel cervello fringuello zebra. In primo luogo, la procedura descritta per la preparazione dei stimoli uditivi risultati in stimoli che può essere incorporato in un ON / OFF blocco paradigma (Figura 2) e che sono normalizzati per eliminare potenziali differenze nel livello di pressione sonora che potrebbe evocare una risposta differenziale nel cervello . Dopo...

In questo rapporto, descriviamo un protocollo ottimizzato per la dettagliata caratterizzazione in vivo di substrati neurali della stimolazione uditiva in anestetizzati diamante mandarino.

In linea con il protocollo presentato, la maggior parte degli studi di attivazione funzionale del cervello in animali utilizzando fMRI BOLD, anestetizzare gli animali durante l'acquisizione. Animali di addestramento per abituarli all'ambiente magnete e il rumore dello scanner durante i peri...

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Questa ricerca è stata sostenuta da finanziamenti della Fondazione per la Ricerca - Fiandre (FWO, progetto Nr. G.0420.02 e G.0443.11N), l'Ercole Foundation (Grant Nr. AUHA0012), concertate azioni di ricerca (finanziamento GOA) presso l'Università di Anversa, e in parte sponsorizzato dalla CE - FP6 progetto Dimi, LSHB-CT-2005-512146 e CE - FP6 progetto EMIL LSHC-CT-2004-503569 per A.VdL. G.DG e CP sono borsisti post-dottorato della Fondazione di Ricerca - Fiandre (FWO).