Imagerie par résonance magnétique (IRMf) avec une stimulation auditive chez les oiseaux chanteurs

Cet article montre une procédure optimisée pour l'imagerie des substrats neuronaux de la stimulation auditive dans le cerveau des oiseaux chanteurs en utilisant l'imagerie par résonance magnétique fonctionnelle (IRMf). Il décrit la préparation des stimuli sonores, le positionnement du sujet et de l'acquisition et de l'analyse ultérieure des données d'IRMf.

La neurobiologie de chants d'oiseaux, comme un modèle pour la parole humaine, est une zone marquée de la recherche en neurosciences comportementales. Alors que les approches électrophysiologiques et moléculaires permettent l'enquête soit de différents stimuli sur quelques neurones, ou une relance dans de grandes parties du cerveau, le niveau d'oxygénation du sang (BOLD) d'imagerie par résonance magnétique fonctionnelle (IRMf) permet de combiner les deux avantages, à savoir comparer l'activation des neurones induite par différents stimuli dans l'ensemble du cerveau à la fois. IRMf chez les oiseaux chanteurs est difficile en raison de la petite taille de leur cerveau et parce que leurs os et surtout de leur crâne comporte de nombreuses cavités d'air, ce qui induit des artefacts de susceptibilité importants. En écho de gradient (GE) IRMf BOLD a été appliquée avec succès pour les oiseaux chanteurs ^1-5 (pour une revue, voir ^6). Ces études ont porté sur les zones du cerveau auditifs primaires et secondaires, qui sont des régions exemptes d'artéfacts de susceptibilité. Toutefois, en raison processes d'intérêts peuvent survenir au-delà de ces régions, tout le cerveau IRMf BOLD est nécessaire en utilisant une séquence IRM moins sensibles à ces objets. Ceci peut être réalisé à l'aide d'écho de spin (SE) BOLD IRMf ^7,8. Dans cet article, nous décrivons comment utiliser cette technique dans les diamants mandarins (Taeniopygia guttata), qui sont de petits oiseaux chanteurs avec un poids de 15-25 g d'études approfondies en neurosciences comportementales des oiseaux. Le thème principal des études IRMf sur les oiseaux chanteurs est la perception de la chanson et de l'apprentissage du chant. La nature auditive des stimuli associés à la faible sensibilité BOLD de SE (contre GE) séquences IRMf base rend la mise en œuvre de cette technique très difficile.

1. Préparation des stimuli auditifs

1. D'abord enregistrer les sons stimuli tout en étant joué à l'intérieur de l'alésage du système MR 7T. L'alésage est un espace clos qui peut fausser les stimuli auditifs résultant dans l'amélioration de certaines fréquences sonores. Figure 1 montre les fréquences améliorées et supprimé comme indiqué par nos enregistrements de bruit blanc fait à l'endroit de la tête de l'oiseau à l'intérieur de l'aimant portaient l'aide d'un microphone à fibre optique (Optimic 1160, Optoacoustics). Pour compenser cette augmentation artificielle, une fonction égaliseur est appliqué à chaque stimulus en utilisant le logiciel WaveLab. Pour notre configuration particulière, la fonction se compose d'un noyau gaussien avec les paramètres suivants: amplitude maximale:-20dB, centré sur 3750 Hz, largeur: 0,05 octaves (correspondant à la gamme 2,500-5,000 Hz pour notre système).
2. Les stimuli de morceaux sont composés de plusieurs motifs de morceaux individuels de chaque oiseau entrelacés avec des périodes de silence. Le duration de ces périodes de silence est ajustée pour maintenir la quantité totale de bruit et de silence identique sur tous les stimuli. Ce bâtiment conserve la variabilité intra-individuelle et interindividuelle naturel de la longueur du morceau. La longueur totale de chaque stimulus est de 16 sec. L'intensité de chaque chanson est normalisée en termes de apparié racine carrée moyenne et passe-haut filtré à 400 Hz avant d'être intégré dans la relance complète (chant et périodes de silence). Ces manipulations sont effectuées en utilisant le logiciel Praat.
3. L'expérience se compose d'un ON / OFF conception alternant périodes de stimulation auditive de blocs (ON blocs) avec des périodes de repos (OFF blocs) (Figure 2). Chaque bloc (ON et OFF) dure 16 s, ce qui correspond au temps d'acquisition de deux images (voir ci-dessous pour l'acquisition). Chaque type de stimulus est présenté 25 fois, ce qui entraîne l'acquisition de 50 images par stimulus et par sujet. L'ordre de présentation des conditions doit être randomisés au sein et entresujets. Cet ordre aléatoire des stimuli peut être codée dans un logiciel de présentation.

2. Préparation sujet

2.1 Objet et taille du groupe

Nous présentons ici un protocole spécifiquement adapté à l'utilisation de (adultes) les diamants mandarins. Le choix de l'espèce dépend de la question scientifique. Cependant, d'autres considérations comme l'oiseau robustesse à l'anesthésie peuvent également être prises en compte. Les diamants mandarins (Taeniopygia guttata) devraient être logés dans des volières sous une lumière 12 h: photopériode de 12 heures sombres et avoir accès à la nourriture et de l'eau ad libitum pendant toute l'étude. Le nombre minimum d'individus par expérience est de 15. Ce chiffre tient compte de la sensibilité de l'IRMf spin-écho et le naturel variabilité inter-individuelle des phénomènes biologiques mesurés dans l'expérience.

2.2 Installation de la configuration et de la préparation de l'animal

(Pour les spécificationsde l'équipement utilisé, nous nous référons à la liste des réactifs et du matériel spécifique à la fin de cet article)

1. Installer le masque de bec sur le lit d'un système d'IRM 7T MR et le connecter à l'appareil de commande de gaz avec des tubes en plastique. Ouvrez l'oxygène et les bouteilles de gaz d'azote et l'interrupteur sur le dispositif de commande des gaz (oxygène de débit: 200 cc / min; azote: 400 cc / min).

Comme mentionné ci-dessus, un système MR 7T est utilisé dans la configuration présentée. D'autres systèmes IRM avec différentes intensités de champ sont également possibles, mais à 7T un bon compromis est atteint entre le rapport signal-sur-bruit et le degré d'artefacts de susceptibilité (voir discussion). Pour des intensités de champ supérieures du rapport signal à bruit augmente en même temps que le degré d'artéfacts de susceptibilité.

2. Mettez le système contrôlé de rétroaction et un dispositif de circulation d'air chaud.
3. Anesthésier le diamant mandarin avec 3% d'isoflurane dans un mélange d'oxygène et d'azote en introduisant son becdans le masque et tenant la tête vers le bas jusqu'à ce que l'oiseau est totalement anesthésié. Cela peut être vérifié en tirant le pied doucement: quand l'oiseau est entièrement sous sédation pied ne sera pas escamoté par l'oiseau. En outre, aux yeux de l'oiseau seront partiellement fermés.
4. Introduire la sonde de température du cloaque pour cribler la température du corps et de surveiller le taux de respiration en plaçant un capteur pneumatique sous le pinson ventre zèbre. Fermer l'enveloppe pour retenir le corps de l'oiseau (figure 3).
5. Maintenir le taux de respiration dans la plage de 40 à 100 respirations par minute et maintenir constante la température du corps au sein d'une gamme étroite de 40 ± 0,5 ° C. Lorsque la plage de la respiration est trop faible / élevé, réglez le niveau de l'anesthésie (isoflurane%) en conséquence. Quand le problème persiste, l'expérience doit être arrêté et l'animal retiré de la configuration afin de récupérer.
6. Placez les haut-parleurs dynamiques non-magnétiques de chaque côté de la tête diamant mandarin et conbrancher à l'amplificateur. Assurez-vous que les fils des haut-parleurs sont dirigés loin de la sonde de température, car elle peut influencer la lecture de la température lorsque trop près.
7. Placez la bobine RF de surface au-dessus de la tête de diamant mandarin et la position du diamant mandarin dans le centre de l'aimant (et automatiquement le centre de la bobine d'émission qui se situe dans le milieu de l'aimant).
8. Réduire le niveau d'anesthésie à 1,5% d'isoflurane mélangé avec de l'oxygène et de l'azote.

3. Acquisition de données

1. Acquérir un ensemble de 1 sagittal, 1 horizontal et 1 image scout coronale en écho de gradient (GE) (séquence tri-pilote) et des ensembles d'images multi-coupes horizontales, frontal et sagittal (pilotage T _2-pondéré rapide acquisition relaxation-enhanced ( RARE) séquence SE) pour déterminer la position du cerveau dans l'aimant (figure 4).
2. Diminuer le bruit des gradients en augmentant leur temps de rampe à 1.000 ms.
3. Préparer la séquence IRMf: RARE T de la séquence _2-pondéré, efficace TE: 60 ms, TR: 2,000 ms, facteur RARE: 8, FOV: 16 mm, taille de la matrice: 64 x 32, orientation: sagittal, l'épaisseur de la tranche: 0,75 mm, Inter-tranche épaisseur d'espace: 0,05 mm, 15 tranches couvrant presque la totalité du cerveau (Figure 4).
4. Sélectionnez le protocole auditif (des stimuli auditifs et le calendrier de livraison de relance) dans le logiciel de présentation. Ce protocole consiste en une séquence de commandes - pour l'ouverture de stimuli auditifs spécifiques - qui sont exécutées lors d'une numérisation nombre spécifique. A chaque répétition à l'intérieur de la séquence IRMf, le logiciel du scanner envoie un déclencheur pour le logiciel de présentation des informations auditives qui à son tour, enregistre le nombre de balayage et exécute la commande correspondante.
5. Afin de s'assurer que le logiciel de présentation des informations auditives ne manque pas de déclenchement du scanner, le protocole auditif est lancé en premier. Une fois le protocole est complètement chargée, la séquence IRMf est démarré.
6. Chaque expérience IRMf est précédée par l'acquisition de 12 images factices pour permettre au signal attribué au bruit du scanner pour atteindre un état stable avant de commencer la stimulation auditive.
7. Après l'acquisition zéro remplir les données de 64 x 64.
8. Jetez un premier coup d'oeil (préliminaire) sur les résultats à l'aide de l'outil fonctionnel de Paravision (option Traitement / imagerie fonctionnelle). Calculer la réponse BOLD différentiel entre tous sur des blocs et la base (rabais blocs). Cette analyse donne une première indication de la qualité de l'expérience. Si aucune activation se voit dans les aires auditives primaires, à ce stade, l'oiseau n'a probablement pas entendu / traitement des stimuli auditifs dus à des problèmes techniques avec la présentation de relance, le niveau d'anesthésie, etc L'installation doit être vérifiée et la mesure répétée.
9. Exécuter une séquence RARE 3D anatomique pondérée en T2 dans la même orientation que les scans IRMf précédentes et avec TE efficace: 60 ms, TR: 2,000 ms, facteur RARE: 8, FOV: 16 mm, taille de la matrice: 256 x 128 x 64.
10. Compléter par des zéros les données de 256 x 256 x 256.
11. Prenez le diamant mandarin du lit IRM et laissez-le se remettre de l'anesthésie dans une cage sous une lampe rouge. Normalement, la récupération d'un diamant mandarin après l'isoflurane va relativement rapide (maximum 5 min). Après seulement quelques minutes, les oiseaux vont essayer de se lever et une fois que l'oiseau est complètement rétabli, il se percher sur une branche au lieu de s'asseoir sur le fond de la cage. La durée de l'anesthésie est d'environ 2 h pour la présente expérience. La durée maximale de l'isoflurane appliqué aux diamants mandarins dans notre laboratoire est de 6 heures, après quoi les oiseaux ont également récupéré dans les 5 min.

4. Traitement des données

1. Convertir le-MR données dans Analyser ou le format Nifti.
2. Parce que SPM a été développé pour traiter les données d'IRMf acquises chez l'homme, c'est-à voxels de l'ordre de 2 mm. De nombreux paramètres de SPM sont adaptées à cette taille approximative de voxel. Si l'on ne want de changer tous ces paramètres, la façon la plus simple de procéder consiste à augmenter artificiellement la taille de voxel de données d'IRMf d'oiseaux. Ajustez la taille de voxel dans l'en-tête en multipliant la taille de voxel réel par 10 en utilisant MRIcro. Il convient de noter que cet ajustement ne modifie pas les données en soi, ré-échantillonnage ou d'autres modifications aux données est appliquée.

Une alternative à cela est l'utilisation de «SPMMouse», qui est une boîte à outils permettant SPM pour ouvrir et analyser les fichiers de toute dimension voxel. L'outil permet de «cerveaux de verre» SPM être créés à partir de n'importe quelle image et ajuste automatiquement par défaut des échelles de longueur basé sur les en-têtes de fichiers image ou des données entrées par l'utilisateur. Par conséquent, cette boîte à outils fonctionne dans le sens inverse de ce que nous proposons. Au lieu de changer la taille de voxel des images pour s'adapter à SPM, les paramètres par défaut du SPM sont modifiés pour utiliser des images avec différentes tailles de voxel.

3. Réaligner les données d'IRMf. Co-enregistrer le jeu de données 3D anatomique til séries chronologiques IRMf. Normaliser les données 3D (et la série co-recommandé temps IRMf) pour le diamant mandarin IRM cérébrale atlas. Appliquer la matrice de transformation de l'ensemble de données IRMf. Tout cela peut être fait en utilisant la cartographie statistique paramétrique (SPM) du logiciel 8.
4. Lisser les données avec une largeur noyau gaussien de 0,5 mm en utilisant SPM8.
5. Effectuer des analyses statistiques voxel en utilisant SPM8. Modéliser les données sous forme de box-car (pas de fonction de réponse hémodynamique). Estimer les paramètres du modèle avec l'algorithme de maximum de vraisemblance restreint classique. Calculer l'effet moyen de chaque stimulus auditif dans chaque matière (analyse des effets fixes), puis calculer les statistiques comme souhaité pour des analyses de groupe (analyses à effets mixtes).
6. Projeter la carte paramétrique statistique sur le diamant mandarin atlas (Figure 5) ⁹ SPM8 pour localiser les activations fonctionnelles (figure 6).

Nous avons ici présentés visuellement une séquence optimisée des procédures pour l'imagerie réussie de substrats neuronaux de stimuli auditifs chez le pinson cerveau zèbre. Tout d'abord, la procédure décrite pour la préparation des stimuli auditifs résultats de stimuli qui peut être incorporé dans un ON / OFF paradigme de bloc (Figure 2) et qui sont normalisés afin d'éliminer les différences potentielles dans le niveau de pression acoustique qui pourrait évoquer une r?...

Dans ce rapport, nous décrivons un protocole optimisé pour la fiche détaillée de la caractérisation in vivo des substrats neuronaux de la stimulation auditive en diamants mandarins anesthésiés.

En accord avec le protocole présenté, la majorité des études d'activation cérébrale fonctionnelle chez les animaux à l'aide de l'IRMf BOLD, anesthésier les animaux lors de l'acquisition. animaux de formation pour les habituer à l'environnement de l...

Aucun conflit d'intérêt déclaré.

Cette recherche a été financée par des subventions de la Fondation de la recherche - Flandre (FWO, le projet Nr G.0420.02 et G.0443.11N), la Fondation Hercules (subvention Nr AUHA0012), Actions de Recherche Concertées (financement GOA) de l'Université d'Anvers, et en partie financé par la CE - projet FP6 DiMI, LSHB-CT-2005-512146 et CE - projet FP6 EMIL LSHC-CT-2004-503569 à A.VdL. G.DG et CP sont des boursiers postdoctoraux de la Fondation de la recherche - Flandre (FWO).