בבתי החולים של AIG, אנו חוקרים כיצד ירידה בהפרשות צינורות הלבלב וירידה ב-pH משפיעות על ביטויי הגנים בתאי צינור הלבלב, במיוחד תוך התמקדות באונקוגנים, ובוחנים את האפשרות של הסתגלות תאית למיקרו-סביבות חומציות. האתגר כאן הוא ההטרוגניות של גידולי הלבלב, מה שמסבך את הטיפול כמו גם את הגישות הניסיוניות. לכן ערכנו ניתוח RNAC של תאי צינור הלבלב בתנאי pH מופחתים, ומצאנו שיש ביטוי מוגבר של שלושה אונקוגנים המדגישים את הקשרים הפוטנציאליים בין הסביבה החומצית לביטוי אונקוגנים בתאי צינור הלבלב.
המחקר שלנו שפך אור על ביטוי האונקוגן בתנאי pH מופחתים, ומערכת זו יכולה לקדם את המחקר שלנו בחקר אדנוקרצינומה של צינור הלבלב בתנאי דלקת. לכן ההיקף העתידי של מחקר זה הוא להעריך את התפקיד של ביטויים אונקוגנים מוגברים בהתחלת גידולים בתנאים דלקתיים, כגון בדלקת לבלב כרונית. כדי להתחיל, רכשו את קו תאי צינור הלבלב הרגיל האנושי.
הפשירו את התאים ב-37 מעלות צלזיוס באמבט מים. כעת מסננים מדיום שלם שהוכן טרי דרך פילטר מזרק. הוסף שישה מיליליטר של מדיום שלם לצינור חרוטי חדש של 15 מיליליטר.
לאחר מכן העבירו את תרחיף התאים המופשר לצינור וערבבו היטב. צנטריפוגה את המתלה ב -1, 800 גרם למשך שש דקות. השליכו את הסופרנטנט והוסיפו מיליליטר אחד של מדיום תרבית לגלולה לפני ערבוב עדין.
לאחר מכן, הוסיפו ארבעה מיליליטר של מדיום שלם לצלחת פטרי בגודל 60 מילימטרים. לאחר מכן פיפטה את מתלה התא טיפה לתוך הבקבוק. דגרו את התרבית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס תחת תוספת פחמן דו חמצני של 5%.
כדי לשנות את ה-pH של מדיום התרבית, ראשית, הכינו 100 מיליליטר של תמיסות מלאי חיץ נתרן פוספט מולארי עם ערכי pH של 6.0, 6.5 ו-7.0. בדוק את ה-pH עם מד pH והתאם אותו באמצעות חומצה הידרוכלורית טוחנת אחת או נתרן הידרוקסיד טוחנת אחת. לאחר מכן סנן, עקר את המאגרים במכסה זרימת אוויר למינרי באמצעות מסנן מזרק של 0.45 מיקרומטר.
לאחר מכן, הוסף 20 מיליליטר של מאגר נתרן פוספט סטרילי 0.5 מולרי של ה-pH המתאים ל-80 מיליליטר של מדיום תרבית להכנת מדיה של pH שונה. הוסף את המדיה עם ה-pH השונה לתאי צינור הלבלב האנושיים של 85 עד 90%. צפו בשינויים מורפולוגיים תחת מיקרוסקופ שדה בהיר במרווחים של שעה למשך שש שעות.
כדי לבודד RNA מהתרבית, יש לשאוף תחילה את מדיום התרבות ולשטוף את התאים במיליליטר אחד של PBS. מניחים את צלחת ה-60 מילימטר על קרח, ואז מיליליטר אחד של PBS לכלי ה-60 מילימטר ומגרדים את התאים בעזרת מגרד תאים. כעת העבירו את המתלים לצינור טרי.
צנטריפוגה בטמפרטורה של 8, 000 גרם למשך 10 דקות והשליכו את הסופרנטנט. לאחר מכן, הוסף 600 מיקרוליטר של מאגר ליזה המכיל בטא-מרקפטואתנול לגלולה. פיפטה את המתלים למעלה ולמטה במשך חמש עד 10 דקות על קרח.
הוסף נפח שווה של 70% אתנול לליזאט ופיפטה את התרחיף לערבב היטב. העבירו את התמיסה לעמוד קרום סיליקה. לאחר מכן צנטריפוגה של העמודה ביותר מ -8, 000 G למשך 30 שניות והשליכו את הזרימה דרכם.
לאחר מכן, הוסף שוב 500 מיקרוליטר של מאגר כביסה לדגימה ולצנטריפוגה. צנטריפוגה את הצינור הריק למשך דקה אחת ביותר מ -8, 000 גרם.לבסוף, הוסף 30 עד 50 מיקרוליטר מים נטולי נוקלאז לעמודה. לאחר דגירה של חמש דקות בטמפרטורת החדר, צנטריפוגה את העמוד שוב במהירויות גבוהות מ- 8,000 גרם למשך חמש דקות.
נצפתה ירידה משמעותית בגודל התא והתכווצות התאים הרקיעיים בתווך חומצי בהשוואה לתאים שנשמרו בתווך רגיל. השינויים הבולטים ביותר במוות התאים התרחשו לאחר שש שעות דגירה עם ירידה נוספת בספירת התאים וסימני לחץ תאי לאחר 22 שעות. מספר הגנים המווסתים היה הגבוה ביותר ב-pH 6.5 עם 148 גנים ואחריו pH 7 עם 109 גנים ו-pH 6 עם 90 גנים.
גנים מווסתים היו פחותים עם 20 ב-pH 6, 14 ב-pH 6.5 ו-23 ב-pH 7. שלושה אונקוגן, LCK, FGR ו-ASAP שלושה היו מווסתים בכל רמות ה-pH שנבדקו, מה שמרמז על תפקיד בהתפשטות תאים בתנאים חומציים.
