אנו שואפים לפתח ולאפיין מודל מבוסס אורגנואידים כדי לחקות את מערכת העיכול ולהשוות אותה לחזירים חיים, ולהתמקד במאפייני ההובלה. השינוי מניסוי קלאסי בבעלי חיים ל. בתחום שלנו של הפיזיולוגיה של מערכת העיכול ל.
מודל in-vitro מבוסס אורגנואיד, המחקה את המצב in vivo. שילבנו את המודל שלנו של המעי הדק והגס של אורגנואידים עם. שניתן להשתמש בו כדי לחקור את מאפייני התחבורה בזמן אמת כדי לאפשר השוואה בין המודל שלנו למצב החזיר החי.
במיוחד בתחום המחקר הקשור לבעלי חיים, מודלים חלופיים לניסויים הקלאסיים בבעלי חיים הם נדירים. אנו מתגברים על מגבלה זו על ידי שימוש במודל מבוסס האורגנואידים שלנו של מערכת העיכול החזירית. אנו מתכננים להשתמש במודל המעיים מבוסס האורגנואידים שלנו כדי לחקור את ההשפעות של חיידקים פתוגניים בחזירים.
זאת במטרה להבין את מנגנוני הפתוגניות של חיידקים אלה. כדי להתחיל, מערבבים את קרום המרתף הטרי המופשר ביחס של 1:40 עם PBS סטרילי קר כקרח בצינור חרוטי. הוסף 200 מיקרוליטר מתערובת זו לתא האפיקלי של כל תוספת בתוך הלוחות הסטריליים.
החזר את מכסה צלחת הבאר ודגירה למשך 1.5 שעות לפחות בחום של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. לאחר הדגירה, שאפו בזהירות את התמיסה מבלי לגעת בקרום. הסר את המדיום האורגנואיד מהבארות המכילות אורגנואידים קריפטה תלת מימדיים.
כדי להמיס את קרום המרתף, הוסיפו לבאר מיליליטר אחד של PBS קר כקרח ופיפטה למעלה ולמטה בעזרת קצה P1000. אוספים את כל האורגנואידים המומסים בצינור של 15 מיליליטר מלא מראש ב -10 מיליליטר PBS קר כקרח. צנטריפוגה את הצינור ב -250 גרם למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס.
לאחר שאיבת הסופרנטנט, השעו מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של 0.05% טריפסין EDTA חם. דגרו את הצינור למשך חמש דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באמבט מים, ולאחר מכן הניחו אותו על קרח כדי לעצור את התגובה. עם קצה P1000, פיפטה למעלה ולמטה 20 פעמים כדי להשעות מחדש את האורגנואידים, ולאחר מכן, חזור על הפעולה עוד 15 פעמים באמצעות קצה P1000 עם קצה P200 מחובר למעלה.
כעת, הוסיפו 10 מיליליטר של DMEM קר כקרח בתוספת סרום עגל עוברי של 10%, או FCS. צנטריפוגה את הצינור ב 1000 גרם למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר השלכת הסופרנטנט, השעו מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של מדיום חד שכבתי.
באמצעות תא נויבאואר, עקוב אחר הוראות היצרן כדי לקבוע את מספר התאים החיים למיליליטר. כעת, החלף את תמיסת הציפוי מהתא האפיקלי ב -500 מיקרוליטר של המדיום החד-שכבתי, מחוסם ב -37 מעלות צלזיוס, והוסף שלושה מיליליטר מהמדיום החד-שכבתי לתא הרוחבי הבסיסי. הסר את המדיום החד-שכבתי האפיקלי.
לתרבית דו-ממדית, הוסף 500 מיקרוליטר של מדיום חד-שכבתי המכיל כמות מתאימה של תאים לתא האפיקלי של כל טרנסוול ודגר את התאים. להתנגדות חשמלית טרנס-אפיתלית, או מדידת TEAR, נקה את אלקטרודת הצ'ופסטיק עם 70% אתנול ותן לה להתייבש לחלוטין. הכניסו את הזרוע הקצרה של אלקטרודת מקלות האכילה לתא האפיקלי, ואת הזרוע הארוכה לתא הרוחבי הבסיסי של התוספות.
לאחר מכן, הפעל ותן ל. מד שיווי משקל למדידה יציבה ולאחר מכן לחץ על כפתור החנות כדי להקליט ערכי TEAR. לאחר מדידת הבאר האחרונה, לחץ על שמור כדי לאחסן נתונים בהתקן USB.
נקו את האלקטרודה לאחר כל צלחת ובסיום המדידה. הניחו לאלקטרודה להתייבש לחלוטין לפני האחסון. הפחיתו ערכי TEAR ריקים שנקבעו לפני זריעת התאים מהערכים התאיים הנמדדים.
החלף את המדיום ומדוד את ה-TEAR כל יומיים-שלושה, וודא ש-TEAR נמדד לפני החלפת המדיום. הוסף בזהירות 500 מיקרוליטר, או שלושה מיליליטר, של מדיום בידול טרי וחם לתאים האפיקליים והבסיסיים. ביום ה-18 לאורגנואידים של ג'ג'ונל, או ביום התשיעי לאורגנואידים של המעי הגס, לאחר הזריעה, המשיכו בניסויים פונקציונליים.
יש לחמם את תמיסות החיץ הריריות והסרוזליות ל-37 מעלות צלזיוס ולאוורר עם קרבוגן. הרכיבו את התאים הבודדים באמצעות תוספת ריקה לכל תא בודד, וודאו שהצדדים האפיקליים של הטרנסוולים פונים כולם לאותו כיוון. מלאו את כל התאים בחמישה מיליליטר של תמיסת חיץ רירית מחוממת מראש.
חבר את כל האלקטרודות מהמתח clamp לתאים הבודדים בהתאם להוראות היצרן. כדי לכייל את תוכנת תא Ussing, לחץ על כפתור RFDPI בכרךtagתוכנת clamp. ודא שההתנגדות של כל התוספות הריקות היא כ- 70 אוהם והזרם הוא סביב אפס מילי-וולט.
הסר את כל האלקטרודות והשליך את תמיסת החיץ המשומשת. פתח את התאים הבודדים, הסר את התוספות הריקות ושמור על סדר התאים. כעת, מתחת לארון הבטיחות, שאפו בזהירות את המדיום הבסיסי והאפיקלי מהצלחת.
שטפו את התאים עם 500 מיקרוליטר של מאגר רירי חם בתא האפיקלי, ועם שלושה מיליליטר של מאגר סרוזלי בתא הבסיסי. הסר את התוספות מהצלחת והסר בעדינות את תומכיהן. הנח את התוספות לתאי ה-Ussing, וודא שהכיוון תואם את שלב הכיול.
לאחר הרכבת התאים הבודדים, מלאו את התאים הפונים לצד הבסיסי של התאים בחמישה מיליליטר של חיץ סרוזלי, ואת אלה הפונים לצד האפיקלי בחמישה מיליליטר של מאגר רירי. חבר את האלקטרודות וצינורות האוורור לכל תא בודד, והתחל את המדידה בתוכנת Usseing. שנה את התנאים ממצב מעגל פתוח לקצר חשמלי בתוכנה.
לאחר חמש עד 10 דקות של שיווי משקל, הוסף 10 פורסקולין מיקרו-מולרי לתא הסרוזל. לאחר 15 דקות, הפסק את המדידה, הסר את צינורות האוורור והאלקטרודות מהתאים ופרק את התאים. ערכי ההתנגדות החשמלית הטרנס-אפיתל עלו בהדרגה במהלך הטיפוח, והגיעו לשיא של 150 אוהם כפול סנטימטר בריבוע עבור ג'ג'ונום לאחר 18 יום, ו-200 אוהם סנטימטר רבוע עבור אורגנואידים במעי הגס לאחר תשעה ימים.
ערכי זרם הקצר הבסיסי היו נמוכים משמעותית באורגנואידים של ג'ג'ונום מאשר באורגנואידים של המעי הגס, בעוד שערכי ההתנגדות הבסיסית לא הראו הבדלים משמעותיים. טיפולי פורסקולין הגדילו משמעותית את ערכי זרם הקצר הבסיסי באורגנואידים של ג'ג'ונל מ-0.86 ל-27.78 מיקרו-אמפר לסנטימטר מרובע, ובאורגנואידים של המעי הגס מ-3.83 ל-28.78 מיקרו-אמפר לסנטימטר מרובע.
