反映天然肠道生理特性的二维猪肠道类器官

我们的目标是开发和表征一种基于类器官的模型，以模拟胃肠道并将其与活猪进行比较，并专注于运输特性。从经典动物实验到。在我们的胃肠道生理学领域，安。

基于类器官的体外模型，模拟体内情况。我们将类器官的小肠和大肠模型结合起来。这可用于实时调查运输特性，以便比较我们的模型和活猪的情况。

特别是在与畜牧相关的研究领域，经典动物实验的替代模式很少见。我们通过使用基于类器官的猪肠道模型来克服这一限制。我们计划使用基于类器官的肠道模型来研究猪病原菌的影响。

这旨在了解这些细菌的致病机制。首先，将新鲜解冻的基底膜与冰冷的无菌 PBS 以 1：40 的比例在锥形管中混合。将 200 微升这种混合物添加到无菌板内每个插入物的顶端隔室中。

盖上孔板的盖子，在 37 摄氏度下用 5% 二氧化碳孵育至少 1.5 小时。孵育后，小心吸出溶液，不要接触膜。从含有三维隐窝类器官的孔中取出类器官培养基。

要溶解基底膜，向孔中加入 1 毫升冰冷的 PBS，然后用 P1000 吸头上下移液。将所有溶解的类器官收集在预装有 10 毫升冰冷 PBS 的 15 毫升试管中。将试管在 4 摄氏度下以 250 G 离心 10 分钟。

吸出上清液后，将沉淀重悬于一毫升温热的 0.05% 胰蛋白酶 EDTA 中。将试管在 37 摄氏度下在水浴中孵育 5 分钟，然后将其放在冰上以终止反应。使用 P1000 吸头，上下移液 20 次以彻底重新悬浮类器官，然后使用顶部附有 P200 吸头的 P1000 吸头再重复 15 次。

现在，加入 10 毫升冰冷的 DMEM，并补充 10% 胎牛血清或 FCS。将试管在 4 摄氏度下以 1000 G 离心 10 分钟。弃去上清液后，将沉淀重悬于 1 毫升单层培养基中。

使用 Neubauer 腔室，按照制造商的说明确定每毫升的活细胞数。现在，用 500 微升在 37 摄氏度下回火的单层培养基替换来自根尖隔室的涂层溶液，并将 3 毫升单层培养基添加到基底外侧隔室中。去除顶端单层培养基。

对于 2D 培养，将 500 微升含有适量细胞的单层培养基添加到每个 transwell 的顶腔中并孵育细胞。对于跨上皮电阻或 TEAR 测量，请用 70% 乙醇清洁筷子电极并使其完全干燥。将筷子电极的短臂引入根尖隔室，将长臂引入插入物的基底外侧隔室。

接下来，打开并让。仪表平衡以获得稳定的测量，然后单击存储按钮记录 TEAR 值。测量最后一个井后，单击 Save 将数据存储在 USB 设备上。

在每块板之后和测量结束时清洁电极。存放前让电极完全干燥。从测量的细胞值中减去在接种细胞之前确定的空白 TEAR 值。

更换培养基并每 2 到 3 天测量一次 TEAR，确保在更换培养基之前测量 TEAR。小心地向根尖和基底隔室中加入 500 μL 或 3 mL新鲜、温暖的分化培养基。在空肠类器官的第 18 天或结肠类器官的第 9 天，接种后，进行功能实验。

将粘膜和浆膜缓冲溶液加热至 37 摄氏度，并用碳水化合物充气。使用每个腔室的空插件组装单个腔室，确保 transwell 的顶端侧都面向同一方向。用 5 毫升预热的粘膜缓冲溶液填充所有腔室。

按照制造商的说明将电压夹的所有电极连接到各个腔室。要校准 Ussing 暗室软件，请单击电压钳软件中的 RFDPI 按钮。确认所有空插件的电阻约为 70 欧姆，电流约为 0 毫伏。

去除所有电极并丢弃用过的缓冲溶液。打开各个腔室，取出空插件，并保持腔室的顺序。现在，在安全柜下，小心地从板中吸出基底外侧和顶端介质。

在根尖腔中用 500 μL 温热的粘膜缓冲液洗涤细胞，在基底外侧腔中用 3 ml 浆膜缓冲液洗涤细胞。从板中取出插件并轻轻去除它们的支撑。将插件放入 Ussing 腔室中，确保方向与校准阶段匹配。

组装各个腔室后，用 5 毫升浆膜缓冲液填充面向细胞基底外侧的腔室，用 5 毫升粘膜缓冲液填充面向顶端侧的腔室。将电极和曝气管连接到每个单独的腔室，然后在 Ussing 软件中开始测量。在软件中将条件从开路模式更改为短路模式。

平衡 5 至 10 分钟后，向浆膜腔中加入 10 微摩尔毛喉素。15 分钟后，停止测量，从腔室中取出曝气管和电极，然后拆卸腔室。在培养过程中，跨上皮电阻值逐渐增加，空肠在 18 天后达到 150 欧姆乘以厘米平方的峰值，9 天后结肠类器官的峰值为 200 欧姆厘米平方。

空肠类器官的基础短路电流值显著低于结肠类器官，而基础电阻值没有显著差异。毛喉素治疗显着将空肠类器官的基础短路电流值从每平方厘米 0.86 微安提高到 27.78 微安，结肠类器官从每平方厘米 3.83 微安提高到 28.78 微安。