מודלים של פציעות הם הכרחיים לחקר התחדשות in vivo, עם זאת, חקירת התחדשות במעי הוכחה כאתגר טכני. היעדר פרוטוקולי הדמיה אורכיים מנע תובנה עמוקה יותר לגבי הדינמיקה בקנה מידה של תאים ורקמות המתזמרת התחדשות מעיים. בפרוטוקול זה, אנו מתארים שיטת מיקרוסקופיה תוך-חיונית הגורמת באופן מקומי נזק לרקמות בקנה מידה של קריפטה יחידה, ועוקבת אחר התגובה הרגנרטיבית של אפיתל המעי בעכבר החי לנזקי אבלציה בלייזר מבוססי פוטונים של קריפטה בודדת או שדות מעיים גדולים יותר באופן מבוקר זמן ומרחב.
הדמיה תוך-חיונית עוקבת, ארוכת טווח וחוזרת מאפשרת מעקב אחר האזור הפגוע לאורך זמן, ומאפשרת ניטור של דינמיקת הקריפטה במהלך התאוששות הרקמה לאורך תקופה של מספר שבועות. לגרום לעכברים על ידי הזרקת טמוקסיפן מומס בשמן חמניות לתוך ארבעה עד שישה שבועות לפני הניתוח. החל שיכוך כאבים, להזריק 200 מיקרוליטר של buprenorphine תת עורית 30 דקות לפני הניתוח.
יש לתת קרפרופן במי שתייה 24 שעות לפני הניתוח. הציגו כלי ניתוח סטריליים אוטוקלאביים בארון הסיכונים הביולוגיים. הפעל את כרית החימום, וקבע את הטמפרטורה על 37 מעלות צלזיוס.
הפעל את תא בקרת הטמפרטורה של המיקרוסקופ לפחות ארבע שעות לפני ההדמיה. שמרו על טמפרטורה יציבה בתוך תא האקלים על 37 מעלות צלזיוס. הפעל את שני מיקרוסקופ הפוטון, הסורק והלייזר.
הפעל את תוכנת ההדמיה. כוונן את אורך הגל של הלייזר ל- 960 ננומטר ופתח את התריס. מרדימים את העכבר באמצעות שניים עד 3% איזופלורן, ומניחים אותו על כרית חימום מכוסה במטלית סטרילית.
בדוק את עומק ההרדמה על ידי הערכת התדירות ואיכות הנשימה נשימה אחת בשנייה, ועל ידי בדיקת הרפלקס של העכבר. לכסות את העיניים של העכבר עם משחת העין. להזריק 200 מיקרוליטר של מלח סטרילי שחומם מראש תת עורית.
לגלח את הבטן ולהסיר את השיער. החליפו את הבד הסטרילי באזור הניתוח. הכנס בדיקה רקטלית כדי לפקח על הטמפרטורה של העכבר.
הטמפרטורה צריכה להיות בערך ב 37 מעלות צלזיוס. לבשו זוג חדש של כפפות סטריליות. נקו את אזור הניתוח בצורה מעגלית עם קרצוף לסירוגין של תמיסת חיטוי ואחריה 80% אתנול שלוש פעמים.
כסו את העכבר במדרס כירורגי סטרילי. בדוק את הרפלקס של העכבר. בצע חתך אנכי בקו האמצע של 10 מ"מ דרך העור באמצעות אזמל סטרילי.
חותכים את linea alba באמצעות מספריים כדי להפריד את שרירי הבטן פי הטבעת ולפתוח את הבטן. מצא את צקום העכבר באמצעות צמר גפן סטרילי ספוג במי מלח שחוממו מראש כדי להשתמש בו כנקודת התייחסות. לעשות חתך קטן חתיכת גזה, להרטיב אותו מלוחים סטריליים שחומם מראש, ומניחים אותו מעל החתך.
הוציאו את המעי עם צמר גפן סטרילי ספוג במי מלח סטריליים שחוממו מראש. שמור על המעי hydrated על ידי הוספת מלוחים מעוקרים שחוממו מראש. העבר את העכבר לקופסת הדמיה סטרילית שחוממה מראש.
מניחים את המעי על הזכוכית הסטרילית. מקם את ראש העכבר בתוך צינור השאיפה של קופסת ההדמיה. במידת הצורך, אבטח את העכבר באמצעות סרט וסרט סטריליים גמישים.
מקם את קופסת ההדמיה המכילה את העכבר בתא המיקרוסקופ. עקוב אחר העכבר במהלך ההדמיה על ידי בדיקת תדירות ועומק הנשימה, וטמפרטורה באמצעות בדיקה רקטלית כל 15 דקות. Isoflurane צריך להישמר בין אחד ל 2%מצא אזור במעי באמצעות IPs של המיקרוסקופ.
קבל מבט שדה רחב של אזור העניין באמצעות המצלמה הפנימית של המיקרוסקופ. צלם את האזור המעניין באמצעות לייזר 960 ננומטר של מיקרוסקופ מולטיפוטון. התאימו את עוצמת הלייזר ואת אורך הגל בהתאם לפלואורופורמים ששימשו בניסוי.
בדוגמה זו, קריפטים המבוטאים בקרום הם חלבון פלואורסצנטי אדום, והם מסומנים באופן סטוכסטי עם חלבון פלואורסצנטי ירוק עם אינדוקציה עם מינון סופי נמוך של טמוקסיפן. לרכוש 10 עד 20 צעד Z-stack של שלושה מיקרון של האזור המעניין. בחרו מיקום בודד או מיקומים מרובים מתמונת האריח הקודמת.
השתמש בפונקציית כיול נקודת הפריצה בתוכנת ההדמיה בזום 32 וברזולוציה של 124 על 124 פיקסלים עם מהירות סריקה של 400 הרץ באמצעות מאפיין הסריקה הדו-כיוונית למשך שלוש עד 10 שניות, בהתאם לגודל הנזק המיועד. ייזום הנזק באזור הקריפטה יכול להיות מוכר על ידי עלייה autofluorescence הן בערוץ הירוק והאדום. לאחר אבלציה, לרכוש Z-stacks של האזורים הפגועים כדי לאשר את המיקום ואת היקף הנזק.
חזור על שני השלבים הקודמים עבור אזורים מרובים באותו עכבר. הניחו את העכבר בעודו תחת הרדמה על אזור תפירה סטרילי וכסו אותו בשפשוף סטרילי. החזירו את המעי החשוף לבטן באמצעות צמר גפן סטרילי ספוג במי מלח סטריליים שחוממו מראש.
תפרו את linea alba על ידי ביצוע תפר רציף פשוט באמצעות תפר נספג. סגור את הגפיים של התפר עם קשרים כירורגיים. חזור על אותו שלב עם שכבת העור.
כבו את תחנת האיזופלורן, נקו ועיקרו את תיבת ההדמיה והשיבוץ. תן לעכבר להתאושש מהניתוח בזמן שהכלוב מונח על כרית החימום למשך שעה. להזריק 200 מיקרוליטר של buprenorphine תת עורית שש עד 12 שעות לאחר הניתוח.
יש לתת קרפרופן במי שתייה במשך 72 שעות לאחר הניתוח. לשקול את העכבר ולפקח על הרווחה כל יום במשך שבוע לאחר הניתוח. בנקודת הזמן השנייה לפחות שבוע לאחר פגישת ההדמיה הראשונה, ניתוח חוזר והדמיה תוך חיונית.
השתמש בתבנית של כלי הדם כדי למצוא בחזרה את אותם אזורים של תמונה מעניינת בנקודת הזמן הראשונה. אם העכבר אינו אמור להיות מצולם בנקודת זמן אחרת, להקריב את העכבר על ידי ביצוע נקע צוואר הרחם תחת הרדמה. אחרת, המשך עם סגירת אתר הניתוח והטיפול לאחר הניתוח.
עכברי K19-Cre ERT mTmG הוזרקו עם טמוקסיפן כדי לגרום לתיוג סטוכסטי של תאים עם GFP ארבעה עד שישה שבועות לפני הניתוח ופגישת הדמיה ראשונה. לאחר חשיפה כירורגית של המעי של העכבר ורכישת מצלמה ותמונות פלורסנט של האזור המעניין, הגדרות נקודת הפרה של לייזר multiphoton משמש ablate crypts. ייזום הנזק יכול להיות מוכר על ידי עלייה autofluorescence הן את הערוץ הירוק ואת הערוץ האדום.
אותו הליך חוזר על עצמו חודש לאחר מכן, וכלי הדם משמשים כציון דרך כדי למצוא בחזרה את אותו אזור. באמצעות מודל קונפטי Lgr5-eGFP, ניתן לעקוב אחר קריפטים המסומנים בצבעים שונים לאורך זמן כדי למפות את הדינמיקה של ההתאוששות. בדוגמה זו, קריפטים בירוק מבטאים את Lgr5 Cre, וקריפטה במגנטה מסומנת בצבע קונפטי.
מצבים שונים של התחדשות נצפים שבועיים לאחר אבלציה בלייזר. אזורים מסוימים נותרים ללא שינוי, בעוד שאזורים אחרים מציגים שיפוץ בצורות של ביקוע קריפטה, כך חלוקה של קריפטה אחת לשתיים, או איחוי, מיזוג של שתי קריפטים לאחת, או היעלמות קריפטה. אבלציה בלייזר בשילוב עם שיטת מיקרוסקופ תוך חיונית מגבילה את הנזק לאזור עניין מוגדר.
זה מאפשר לנו לשלוט במיקום הנזק כמו גם בהיקף הנזק. חומרת הנזק יכולה להיות מווסתת כדי ablate crypts או שדות מעיים שלמים כדי ליידע אותנו על התגובה הרגנרטיבית בקנה מידה קריפטה. בנוסף לשליטה מרחבית, אבלציה בלייזר מאפשרת גם לתזמן במדויק את הופעת הנזק בנוסף להדמיית אותו איבר בתנאים הומיאוסטטיים והתחדשות באותו עכבר, ובכך עולה על הדיוק של מודלים קודמים של פגיעה.
היישום של אבלציה בלייזר והדמיה תוך-חיונית חוזרת יכול לשמש פלטפורמה למספר רב של שאלות מחקר ותחומים מדעיים מגוונים המשתרעים על פני רגנרציה, אימונולוגיה וחקר הסרטן.
