Name: real-time imaging of myeloid cells dynamics in apcmin/+ intestinal tumors by spinning disk confocal microscopy
Uploaded: 2014-10-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy at JoVE.com

ברצוננו להודות ליינג יו לגנוטיפ / + עכברי Min APC. מחקר זה נתמך על ידי כספים מINSERM ומענקים (CA057621 וAI053194) מהמכון הלאומי לבריאות.

<ol>
	<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+cancer:+the+next+generation.">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144 (5), 646-674 (2011).</li><li>Hanahan, D., Coussens, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accessories+to+the+crime:+functions+of+cells+recruited+to+the+tumor+microenvironment.">Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment.</a> Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).</li><li>Schouppe, E., De Baetselier, P., Van Ginderachter, J. A., Sarukhan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Instruction+of+myeloid+cells+by+the+tumor+microenvironment:+Open+questions+on+the+dynamics+and+plasticity+of+different+tumor-associated+myeloid+cell+populations.">Instruction of myeloid cells by the tumor microenvironment: Open questions on the dynamics and plasticity of different tumor-associated myeloid cell populations.</a> Oncoimmunology. 1 (7), 1135-1145 (2012).</li><li>Egeblad, M., Nakasone, E. S., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumors+as+organs:+complex+tissues+that+interface+with+the+entire+organism.">Tumors as organs: complex tissues that interface with the entire organism.</a> Dev Cell. 18 (6), 884-901 (2010).</li><li>Lohela, M., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+stromal+cell+dynamics+in+tumors.">Intravital imaging of stromal cell dynamics in tumors.</a> Curr Opin Genet Dev. 20 (1), 72-78 (2010).</li><li>Egeblad, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+stromal+cell+dynamics+in+different+tumor+microenvironments+by+spinning+disk+confocal+microscopy.">Visualizing stromal cell dynamics in different tumor microenvironments by spinning disk confocal microscopy.</a> Dis Model Mech. 1 (2-3), 155-167 (2008).</li><li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+long-term+in+vivo+imaging+of+tumor-stroma+interactions+in+mouse+models+of+breast+cancer+using+spinning-disk+confocal+microscopy.">Dynamic long-term in vivo imaging of tumor-stroma interactions in mouse models of breast cancer using spinning-disk confocal microscopy.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2011 (2), (2011).</li><li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+vital+signs+for+long-term+survival+of+mice+under+anesthesia.">Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2011 (2), (2011).</li><li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+mice+for+long-term+intravital+imaging+of+the+mammary+gland.">Preparation of mice for long-term intravital imaging of the mammary gland.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2011 (2), (2011).</li><li>Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+drug+responses+in+the+tumor+microenvironment+in+mouse+models+of+breast+cancer.">Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer.</a> J Vis Exp. (73), e50088 (2013).</li><li>Nakasone, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+tumor-stroma+interactions+during+chemotherapy+reveals+contributions+of+the+microenvironment+to+resistance.">Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance.</a> Cancer Cell. 21 (4), 488-503 (2012).</li><li>Walther, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+prognostic+and+predictive+markers+in+colorectal+cancer.">Genetic prognostic and predictive markers in colorectal cancer.</a> Nat Rev Cancer. 9 (7), 489-499 (2009).</li><li>Fearon, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+genetics+of+colorectal+cancer.">Molecular genetics of colorectal cancer.</a> Annu Rev Pathol. 6, 479-507 (2011).</li><li>Moser, A. R., Pitot, H. C., Dove, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dominant+mutation+that+predisposes+to+multiple+intestinal+neoplasia+in+the+mouse.">A dominant mutation that predisposes to multiple intestinal neoplasia in the mouse.</a> Science. 247 (4940), 322-324 (1990).</li><li>Su, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+intestinal+neoplasia+caused+by+a+mutation+in+the+murine+homolog+of+the+APC+gene.">Multiple intestinal neoplasia caused by a mutation in the murine homolog of the APC gene.</a> Science. 256 (5057), 668-670 (1992).</li><li>Watson, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+barrier+function+in+vivo+is+sustained+despite+gaps+in+epithelial+layers.">Epithelial barrier function in vivo is sustained despite gaps in epithelial layers.</a> Gastroenterology. 129 (3), 902-912 (2005).</li><li>McDole, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Goblet+cells+deliver+luminal+antigen+to+CD103++dendritic+cells+in+the+small+intestine.">Goblet cells deliver luminal antigen to CD103+ dendritic cells in the small intestine.</a> Nature. 483 (7389), 345-349 (2012).</li><li>Xu, C., Shen, Y., Littman, D. R., Dustin, M. L., Velazquez, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+mucosal+homeostasis+via+single-+and+multiphoton+intravital+fluorescence+microscopy.">Visualization of mucosal homeostasis via single- and multiphoton intravital fluorescence microscopy.</a> J Leukoc Biol. 92 (3), 413-419 (2012).</li><li>Haigis, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+oncogenic+K-Ras+and+N-Ras+on+proliferation,+differentiation+and+tumor+progression+in+the+colon.">Differential effects of oncogenic K-Ras and N-Ras on proliferation, differentiation and tumor progression in the colon.</a> Nat Genet. 40 (5), 600-608 (2008).</li><li>Sansom, O. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+Apc+allows+phenotypic+manifestation+of+the+transforming+properties+of+an+endogenous+K-ras+oncogene+in+vivo.">Loss of Apc allows phenotypic manifestation of the transforming properties of an endogenous K-ras oncogene in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (38), 14122-14127 (2006).</li><li>Janssen, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=APC+and+oncogenic+KRAS+are+synergistic+in+enhancing+Wnt+signaling+in+intestinal+tumor+formation+and+progression.">APC and oncogenic KRAS are synergistic in enhancing Wnt signaling in intestinal tumor formation and progression.</a> Gastroenterology. 131 (4), 1096-1109 (2006).</li><li>Takaku, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+tumorigenesis+in+compound+mutant+mice+of+both+Dpc4+(Smad4)+and+Apc+genes.">Intestinal tumorigenesis in compound mutant mice of both Dpc4 (Smad4) and Apc genes.</a> Cell. 92 (5), 645-656 (1998).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

במאמר זה, פרוטוקול מפורט מתואר לספינינג confocal הדמיה דיסק של דינמיקת תא מיאלואידית בגידולים במעי במשך כמה שעות בחי, צילמו מהצד serosal של המעיים. כדי להימנע מדלקת ויש להם תנאים פיסיולוגיים אופטימליים, הדמיה של המעי צריכה להיעשות על האיבר שלם. עם זאת, הדמיה מהצד serosal של המעי היא מאתגרת, מאחר שהאור צריך לעבור שכבות רקמה שונות כגון שריר חלק לפני שהגיע לאפיתל. התמקדות באפיתל יכולה להיות קשה באזורים מסוימים, בעיקר בעכברי הכתב יקטין ECFP מאז אקטין באו לידי הביטוי בחום על ידי תאי שריר חלק. למרות ששני הפוטונים במיקרוסקופ יש את היתרון של חדירה לרקמות עמוקה יותר בהשוואה למיקרוסקופי confocal, מצאנו כי מיקרוסקופ confocal דיסק ספינינג הוא חזק מספיק כדי להשיג הדמיה טובה של מבנה אפיתל במעי. יתרונות oמיקרוסקופיה הדיסק מסתובב f כוללת את היכולת לרכישה מהירה מאוד ורגישות ייחודית מבלי להקריב רזולוציה confocal. איכויות אלו מאפשרות התצפית של תהליכים דינמיים גם אם כמה נקודות זמן צריכה להיות נמחקו בשל חפצי תנועה, למזער photodamage, ולאפשר ההדמיה של מולקולות יחסית חלש ניאון. מעי הדמיה מהצד serosal יכול גם להיות מאתגר בגלל תנועות peristaltic אנדוגני של איבר זה. בפרוטוקול זה, הזרקת sc של אטרופין ניתנת לפני ההדמיה, ובו ביעילות מקטינה את התנועה. עם זאת, חשוב לשים לב כי תנועת peristaltic היא יותר נרחבת במעי הגס, אך לא בלמה היטב על ידי טיפול אטרופין, טיוח הדמיה די קשה בחלק זה של המעי. שכבת שריר החלק במעי הגס היא קצת יותר בולטת ג ompared למעי הדק ונראה יותר התכווצות. לכן,כמעט בלתי אפשרי להתמקד באפיתל בעכברי הכתב יקטין ECFP. יתר על כן, בנוסף לתנועות אנדוגני אלה, נסחף איבר יכול להתרחש, אבל בתיקון להיסחף אחורי מקרה זה יכול להתבצע על ידי שימוש בתוכנת המצלמה. אתגר מרכזי נוסף בניסויי הדמיה פולשנית הוא לשמור על העכבר חי ובריאים זמן רב ככל האפשר בהרדמה. הוא הגיע המעי על ידי פתיחת חלל הצפק. כך ההליך הוא יותר חודרני מזה המשמש להדמית גידול החלב, שיכול להיעשות עד 40 שעה בגלל היושרה של הצפק. הרכישה המרבית נעשתה עם חלל הצפק פתח הייתה 6 שעות, אבל העכבר עדיין היה בחיים ללא סימנים ברורים של מצוקה, כך שגם רכישה עוד עשויה להיות אפשרית. במיאלואידית מחקר זה התנהגות תא יכולה להיות אחרי ונותחה תוך הגידול במעי באמצעות עכברי כתב ניאון וגם לא fluorochrome מצומדות-מרוץ או נוגדנים. גם גישה זו יכולה לשמש להתבוננות סוגי תאים אחרים כגון Tregs, תאים או fibroblasts דנדריטים באמצעות FOXP3-EGFP או CD11c-DTR-EGFP, או עכברי כתב Fsp1-EGFP בהתאמה, כפי שנעשה בו שימוש במחקר גידול החלב 6 . כמו כן, ניתן להזריק נוגדני ניאון נגד אוכלוסיות תאים אחרות מאשר נויטרופילים iv בנוסף, התנהגות תא יכולה גם להיות מנותחת בתנאים שונים, כגון חוסר חמצן. ניסויים אלה עשויים לתת תובנות חדשות על התנהגותם של תאי סטרומה אלה לאחר טיפול בכימותרפיה או טיפול ממוקד. לבסוף, פרוטוקול זה יכול לשמש במודלים של עכברים אחרים של סרטן מעי גס ובשלבים שונים של התקדמות גידול. Apc מינימום / + עכברים לפתח פוליפים במעי adenomatous רק, שאינו להתקדם לממאירות, כי יש לי העכברים תוחלת חיים מקוצרים. יהיה מעניין ללמוד את הדינמיקה של תאי מיאלואידית בדגמי סרטן מעי אחרים עם יותר AGGגידולי ressive ופולשניים כגון עכברים שנשאו מוטציות בK-ras 19-21 או Smad4 22 גנים בנוסף למוטצית APC.

ראיות מכריעות עכשיו מוכיחות כי microenvironment הגידול, בהיקף של אוכלוסיות תאים הטרוגנית, הכוללים פיברובלסטים, תאי אנדותל, תאי מערכת חיסונית ודלקתיים, מטריצת חוץ תאית, וגורמים מסיסים, ממלא תפקיד מכריע בייזום ובהתפתחות של גידולים מוצקים על ידי תרומה לכמעט כל סימני ההיכר של סרטן 1. ואכן, במהלך התקדמות גידול, יש אינטראקציות דינמיות מתמידים בין תאים סרטניים ותאי סטרומה הפכו להתפתח ליצור microenvironment חיובי לממאירות 2. בין תאי מערכת החיסון שלהסתנן microenvironment הגידול, תאי מיאלואידית הם בשפע 3 ביותר. בהיקף של מקרופאגים גידולים הקשורים (TAM), תאים המדכאים המופקת מיאלואידית (MDSCs), תאים דנדריטים (DC) ונויטרופילים (PMNs), תאי מיאלואידית מגויסים ממח עצם ובהדרגה לחדור גידולים, משחררים ציטוקינים, גורמי גדילה ופרוטאזות ה יכול לקדםצמיחה וגידול התפשטה 4. Crosstalk בין תאים סרטניים ותאי מיאלואידית הוא מורכב, אך דינמי. כך ההבנה של מהות יחסי הגומלין שלהם היא קריטית לקביעה מדוע תאים אלה לקדם התקדמות הסרטן במקום משתתף בתגובה חיסונית כנגד גידול, ועשויה לעזור למצוא מטרות חדשות כדי לשלוט בו. תצפית ישירה על ידי מיקרוסקופ intravital מספקת מידע על דינמיקת תאים בתוך הרקמות של עכברים חיים 5. ארבעת צבעים, רב אזור, מערכת confocal דיסק מסתובב עם עדשות מיקרו נועד ללמוד תאי סטרומה בתוך גידולי החלב 6. גישה זו מאפשרת הדמיה רציפה לטווח ארוך וכוללת מספר יתרונות כגון (א) רכישת תמונות מהירות כדי למזער ממצא תנועה, (ב) הרדמה לטווח ארוך, ארבע רכישת צבע למעקב תאים מסוגים שונים (ג), תיוג ניאון (ד) רכיבים שונים של tumoral, ותצפית (ה) של שנינות microenvironments גידול שונהHin אותו העכבר כדי להימנע מעכבר ל7-9 השתנות עכבר. בעזרת טכנולוגיה זו, התנהגויות תאים שונות כבר דיווחו בוירוס גידול החלב מודל (MMTV) אונקוגן T אמצע polyoma מונע אמרגן (PyMT) המציג שלבים מתקדמים של יצירת גידולים. לימפוציטים מסוג T רגולטורים (Tregs, דמיין ידי transgene FOXP3 EGFP) להעביר באופן מועדף בסמוך לכלי דם ואילו DCS (CD11c-DTR-EGFP), פיברובלסטים הקשורים קרצינומה (Fsp1 + / + -EGFP) ותאי מיאלואידית (c-FMS -EGFP) מפגין תנועתיות גבוהה יותר בפריפריה מאשר הגידול במסת הגידול. במצב של היפוקסיה המערכתית החריפה, תאים נדדו באופן שונה: Tregs להפסיק נודדים בניגוד לתאי מיאלואידית שימשיכו לנוע 6. בנוסף, באותו מודל העכבר, זה כבר הראה כי רגישות דוקסורוביצין שינויים בשלב גידול, הפצת סמים קשורה לתגובת סמים, ודוקסורוביציןטיפול מביא לגיוס CCR2 תלוי של תאי מיאלואידית לגידולים. לפיכך, הדמיה חיה יכולה לשמש גם כדי לקבל תובנות לתוך תגובות בסמים באתר והביולוגיה של chemoresistance 10,11. מוטציות גנטיות coli polyposis (APC) adenomatous בדרך הכלל מתרחשות באדנומות אנושיות מעי גס וקרצינומה 12 ומוטציה של עותק בודד של תוצאות גן APC בpolyposis המשפחתי adenomatous (FAP), אשר מקנה סיכון גבוה ביותר לסרטן מעי גס 13. זן העכבר Apc מינימום / + נושא מוטציה עיצור בקודון 850 של הגן APC ואופן ספונטני מתפתח אדנומות במעי מרובה בכל רחבי המעי הדק 14- 16. ההדמיה intravital לטווח ארוך של המעי היא מאתגרת בגלל הפולשנות של ההליך, שכן פתיחת חלל הצפק היא הכרחית לגישה למעי. הדמיה חיה לזמן קצר studies כבר פורסם בעבר במעי בריא 17,18, אבל תצפית ישירה לטווח הארוך של גידולים במעי לא דווחה. הליך כירורגי תוכנן ומעודן לדמיין גידולים דרך פני השטח serosal של המעי, תוך שימוש במערכת מיקרוסקופ דיסק ספינינג intravital ששימשה בעבר לגידולי שד תמונת 6,10. במאמר זה, פרוטוקול מתואר המאפשר אחד כדי לעקוב אחר התנהגותם של תאי מיאלואידית בתוך הגידולים במעי הדק באמצעות Apc מינימום / + עכברים.

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;Apc&lt;sup&gt;Min/+&lt;/sup&gt;&lt;/em&gt; mice</td><td>Jackson Laboratory</td><td>2020</td><td></td></tr><tr><td>ACTB-ECFP mice</td><td>Jackson Laboratory</td><td>3773</td><td></td></tr><tr><td>cfms-EGFP mice</td><td>Jackson Laboratory</td><td>18549</td><td></td></tr><tr><td>2,000 kDa Dextran, rhodamine-conjugated</td><td>Invitrogen</td><td>D7139</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Butler Animal Health Supply</td><td>29450</td><td></td></tr><tr><td>Nitrogen</td><td>UCSF</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oxygen</td><td>UCSF</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>UCSF cell culture facility</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Saline Buffer</td><td>UCSF cell culture facility</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse Ly-6G (GR1) antibody AF647</td><td>UCSF Monoclonal antibody core</td><td></td><td>Stock 1 mg/ml. Use at 7 &amp;mu;g/mouse</td></tr><tr><td>Atropine</td><td>LARC UCSF</td><td></td><td>Use at 1 mg/kg mouse</td></tr><tr><td>Alcohol wipes</td><td>Becton Dickinson</td><td>326895</td><td></td></tr><tr><td>28 G x 1/2 in. insulin syringe</td><td>Becton Dickinson</td><td>329465</td><td></td></tr><tr><td>Remium cover glass</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-5M</td><td>24x50-1</td></tr><tr><td>Betadine</td><td>LARC UCSF</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heat blanket</td><td>Gaymar Industries</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hot bead sterilizer</td><td>Fine Science Tools</td><td>18000-45</td><td>Turn ON 30 min before use</td></tr><tr><td>Cotton tipped apllicators 6-inch</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72310-10</td><td></td></tr><tr><td>Anesthesia system</td><td>Summit Anesthesia Support</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inverted microscope</td><td>Carl Zeiss Inc</td><td>Zeiss Axiovert 200M</td><td></td></tr><tr><td>Stage insert</td><td>Applied Sientific Instrumentation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse Ox oximeter, software and sensors</td><td>Starr Life Sciences</td><td>MouseOx</td><td></td></tr><tr><td>Nebulizer</td><td>Summit Anesthesia Support</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;mu;Manager</td><td>Vale lab, UCSF</td><td></td><td>Open-source software</td></tr><tr><td>ICCD camera</td><td>Stanford Photonics</td><td>XR-Mega-10EX S-30</td><td></td></tr><tr><td>Spinning disk confocal sacan-head</td><td>Yokogawa Corporation</td><td>CSU-10b</td><td></td></tr></tbody></table>

real-time imaging of myeloid cells dynamics in apcmin/+ intestinal tumors by spinning disk confocal microscopy

תאי מיאלואידית הם התאים חיסוניים הנפוצים ביותר בגידולים והוכחו לקדם התקדמות גידול. טכניקות הדמיה intravital מודרניות מאפשרות התצפית של התנהגות תאית חי בתוך האיבר אבל יכולות להיות מאתגר בסוגים מסוימים של הסרטן בשל נגישות איבר וגידול כגון מעי. תצפית ישירה של גידולים במעי לא דווחה בעבר. הליך כירורגי המתואר כאן מאפשר תצפית ישירה של דינמיקת תא מיאלואידית בתוך הגידולים במעיים בעכברים חיים באמצעות עכברי כתב ניאון מהונדסים וקליעים נותבים או נוגדנים להזרקה. לצורך כך, נעשה שימוש בארבעה צבעים, רב אזור, מיקרוסקופ confocal דיסק מסתובב עם עדשות מיקרו, המאפשר הדמיה רציפה ארוך טווח עם רכישת תמונה מהירה. Apc מינימאלי עכברים / + המתפתחים אדנומות מרובות במעי הדק הם חצו עם עכברי c-FMS-EGFP לדמיין תאי מיאלואידית ועם עכברי ACTB-ECFPלדמיין תאי אפיתל במעי של מאורות. נהלים לתיוג רכיבי גידול שונים, כגון כלי דם ונויטרופילים, ואת ההליך למיצוב גידול הדמיה דרך פני השטח serosal גם מתוארים. זמן לשגות סרטים מלוקט מכמה שעות של הדמיה מאפשרים הניתוח של מיאלואידית התנהגות תא באתרו בmicroenvironment המעיים.

באמצעות מיקרוסקופיה confocal הדיסק מסתובבת, רקמות שאינן tumoral וtumoral במעי הדק של Apc מינימום / +; ACTB-ECFP; ניתן דמיינו עכברים c-FMS-ECFP מפני שטח serosal. לאחר הדמיה, תוכנת מצלמה משמשת כדי לנתח ולהתאים את הרכישה (איור משלים 1). לאחר (iv) הזרקה תוך ורידית של dextran-rhodamine 2,000 kDa ניאון ונוגדנים מצומדות Ly-6G 647, ניתן לאתר כלי דם וPMNs בהתאמה (איור 1). הטלאים של Peyer שהם מקבצים של רקמת הלימפה ומלאה של תאי מיאלואידית ניתן לראות בקלות (איור 1 א). מאורות של המעי הדק מוקפים בכלי דם ותאי מיאלואידית (איור 1 א ו -1 B). רקמת Tumoral היא לעתים קרובות יותר כלי דם ועוד חדר על ידי תאי מיאלואידית, והמבנה של מאורות הוא פחות w<html> מאורגן ell (איור 1 א ו -1 B) בהתאם לגודלו של הגידול. רכישה יכולה להיעשות על ידי שימוש בNA 10X 0.5 (איור 1 א) ו20X 0.75 עדשות NA Fluar (איור 1), אך השגנו את הביצועים הטובים ביותר עם ​​עדשת 10X 0.5 NA Fluar שהייתה בהיר, מאפשר הרכישה של אזור גדול (676 x 676 מיקרומטר) ויכול לספק תמונות ממרחק של עד 70 מיקרומטר לתוך הרקמה. יקטין ECFP שכבת שריר להביע החלק לפעמים יכול להפוך את הפוקוס על אפיתל המעיים קשה (איור 1, פנל מימין). ניתן בעקבות דינמיקת תאי מיאלואידית בגידולים בזמן אמת לכמה שעות כפי שמוצגת באנימציה / וידאו איור 2. בעוד נויטרופילים (Gr1 + תאים) לזרום בכלי דם ולסייר ברקמות, תאי מיאלואידית אחרים, בעיקר מקרופאגים, מקיפים את מאורות והם פחות נעימים ב( אנימציה / וידאו איור 2). n-page = &quot;תמיד&quot;&gt; <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/51916/51916fig1highres.jpg" /> איור 1 תמונות נציג שהושגו עם confocal דיסק ספינינג של רקמה שאינה tumoral וtumoral מApc מינימום / + עכברים. () תמונות ארבעה צבעים (10X Fluar, 0.5 עדשת NA) של אפיתל המעי הדק מפני שטח serosal של Apc מינימום / +; ACTB-ECFP; cfms-EGFP עכבר שקיבל ניאון iv 2,000 dextran-rhodamine kDa (אדום) ו647 נוגדן Ly-6G מצומדות (לבנה). הלוח השמאלי מציג את האפיתל שאינו tumoral והפנל הימני מראה גידול מאותו Apc מינימום / +; ACTB-ECFP; עכבר cfms-EGFP. תאי מיאלואידית ירוקים ותאי האפיתל הם כחולים. מקבץ של c-FMS + תאים נראה ברקמת המעי שאינו tumoral בתיקון של Peyer (חץ לבן), סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. (ב &#39;) תמונות ארבעה צבעים (20X Fluar, 0.5 NAעדשה) של אפיתל המעי הדק מפני שטח serosal של מינימום Apc / +; ACTB-ECFP; גידול cfms-EGFP. בפנל מהשמאל, כמה c-FMS Gr1 + כפול חיובי + תאים מזוהים ברקמת tumoral. הפנל הימני מראה תמונה של שכבת השריר החלקה להביע תקטין ECFP שיכול להפוך את הפוקוס על אפיתל המעיים קשה, סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/51916/Animated-Video_Figure_2.mov" target="_blank">אנימציה / וידאו איור 2.</a> דינמיקת תא מיאלואידית באדנומה 3 מ&quot;מ מנגמ&quot;ש מינימום / + עכבר. ארבעה צבע זמן לשגות של האפיתל המעי הדק (10X Fluar, 0.5 עדשת NA) מפני שטח serosal של Apc מינימום / + ; ACTB-ECFP; cfms-EGFP שיתוף הזריק עכבר עם dextran-rhodamine ניאון 2,000 kDa (אדום) ו647 נוגדן Ly-6G מצומדות (לבנה). תאי מיאלואידית ירוקים ותאי האפיתל הם כחולים. תאי מיאלואידית סביב מאורות לא זזים. נויטרופילים מסוימים (תאי Gr1 + בלבן) מפטרלים ברקמות. זוהי רכישה 2 שעות והסרט כבר האיץ 295 פעמים. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/51916/Supplementary Figure 1.tif" target="_blank">איור משלים 1.</a> צילומי מסך של תוכנת מצלמה לניתוח רכישה. () ראשית, הקבצים צריכים להיות מומרים להארכת .ims. (B) ואז, יכולות להיות מותאמות תמונות תצוגה, כגון אותות ספציפיים יכול להיות מוגבר ורקע ירידה תאריך. (C) וזקוק לזמן כדי להיות מותאם על מנת לקבל סרט בזמן אמת. (ד &#39;) הרכישה ניתן לשמור כסרט.

Watch this Scientific Journal Video about Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy at JoVE.com

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the ApcMin/+ colorectal cancer model.

הדמיה של Dynamics התאים מיאלואידית בזמן אמת<em&gt; Apc<sup&gt; מינימום / +</sup</em&gt; מעיים גידולים על ידי דיסק מסתובב Confocal מיקרוסקופית

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques ...

real-time-imaging-myeloid-cells-dynamics-apcmin-intestinal-tumors

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

9.6K Views.  INSERM U661, Functional Genomic Institute. By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the ApcMin/+ colorectal cancer model. 

Video: Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the tumor microenvironment and respond adequately to tumor antigens. The recent development of improved imaging approaches, such as 2-photon microscopy, and the use of powerful mouse tumor models have shed light on some of the mechanisms that regulate anti-tumor T cell activities. Whereas such systems have provided valuable insights, they do not always predict human responses. In human, our knowledge in the field mainly comes from a description of fixed tumor samples from human patients, as well as in vitro studies. However, in vitro models lack the complex three-dimensional tumor milieu and, therefore, are incomplete approximations of in vivo T cell activities. Fresh slices made from explanted tissue represent a complex multi-cellular tumor environment that can act as an important link between co-cultured studies and animal models. Originally set up in murine lymph nodes1 and previously described in a JoVE article2, this approach has now been transposed to human tumors to examine the dynamics of both plated3&#160;as well as resident&#160;T cells4.
Here, a protocol for the preparation of human lung tumor slices, immunostaining of resident CD8 T and tumor cells, and tracking of CD8 T lymphocytes within the tumor microenvironment using confocal microscopy is described. This system is uniquely placed to screen for novel immunotherapy agents favoring T cell migration in tumors.

Ex Vivo Imaging of Resident CD8 T Lymphocytes in Human Lung Tumor Slices Using Confocal Microscopy

This protocol describes a method to image resident tumor-infiltrating CD8 T cells labeled with fluorescently coupled antibodies within human lung tumor slices. This technique permits real-time analyses of CD8 T cell migration using confocal microscopy.

לשעבר Vivo הדמיה של לימפוציטים מסוג T CD8 תושב באמבריולוגיה הגידול פרוסות משתמש מיקרוסקופיה קונפוקלית

CD8 T cell are key players in the fight against cancer. In order for CD8 T cells to kill tumor cells they need to enter into the tumor, migrate within the ...

Cancer Research

הדמיית לבלב מורין באמצעות חלון מיוצב מושתל

Stabilized Window for Intravital Imaging of the Murine Pancreas

The physiology and pathophysiology of the pancreas are complex. Diseases of the pancreas, such as pancreatitis and pancreatic adenocarcinoma (PDAC) have high morbidity and mortality. Intravital imaging (IVI) is a powerful technique enabling the high-resolution imaging of tissues in both healthy and diseased states, allowing for real-time observation of cell dynamics. IVI of the murine pancreas presents significant challenges due to the deep visceral and compliant nature of the organ, which make it highly prone to damage and motion artifacts. 
Described here is the process of implantation of the Stabilized Window for Intravital imaging of the murine Pancreas (SWIP). The SWIP allows IVI of the murine pancreas in normal healthy states, during the transformation from the healthy pancreas to acute pancreatitis induced by cerulein, and in malignant states such as pancreatic tumors. In conjunction with genetically labeled cells or the administration of fluorescent dyes, the SWIP enables the measurement of single-cell and subcellular dynamics (including single-cell and collective migration) as well as serial imaging of the same region of interest over multiple days. 
The ability to capture tumor cell migration is of particular importance as the primary cause of cancer-related mortality in PDAC is the overwhelming metastatic burden. Understanding the physiological dynamics of metastasis in PDAC is a critical unmet need and crucial for improving patient prognosis. Overall, the SWIP provides improved imaging stability and expands the application of IVI in the healthy pancreas and malignant pancreas diseases.

מחבר זרקור: מהפכה בהבנת מחלות הלבלב באמצעות הדמיה תוך-חיונית מתקדמת 

We present a protocol for the surgical implantation of a stabilized indwelling optical window for subcellular-resolution imaging of the murine pancreas, allowing serial and longitudinal studies of the healthy and diseased pancreas.

חלון מיוצב להדמיה תוך חיונית של הלבלב המוריני

The physiology and pathophysiology of the pancreas are complex. Diseases of the pancreas, such as pancreatitis and pancreatic adenocarcinoma (PDAC) have ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in vivo is crucial for understanding the molecular basis of leukocyte transendothelial migration and interaction with vascular endothelium. One powerful approach involves intravital microscopy on transgenic mice expressing fluorescent proteins in cells of interest.
Here we present a protocol for imaging monocytes and neutrophils in the CX3CR1gfp/wt mouse i.v. injected with orange dye-labeled neutrophils with an inverted confocal microscope. Time-lapse movies gathered from 30 min&#160;to several hours of imaging allow the analysis of leukocyte behavior in mesenteric veins under both steady state and inflammatory conditions. We also describe the steps to locally induce blood vessel inflammation with TLR2/TLR1 agonist Pam3SK4 and monitor the subsequent recruitment of neutrophils and monocytes.
The presented technique can also be used to monitor other populations of leukocytes and investigate molecules implicated in leukocyte recruitment or trafficking using other stimuli or transgenic mice.

We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

הדמיה נויטרופילים ומונוציטים בmesenteric ורידים על ידי מיקרוסקופית Intravital על עכברים מורדמים בזמן אמת

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Imaging CD4 T Cell Interstitial Migration in the Inflamed Dermis

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral tissues through an as-yet undefined mechanism. The application of multiphoton microscopy to the study of the immune system provides a tool to measure the dynamics of immune responses within intact tissues. Here we present a protocol for non-invasive intravital multiphoton imaging of CD4 T cells in the inflamed mouse ear dermis. Use of a custom imaging platform and a venous catheter allows for the visualization of CD4 T cell dynamics in the dermal interstitium, with the ability to interrogate these cells in real-time via the addition of blocking antibodies to key molecular components involved in motility. This system provides advantages over both in vitro models and surgically invasive imaging procedures. Understanding the pathways used by CD4 T cells for motility may ultimately provide insight into the basic function of CD4 T cells as well as the pathogenesis of both autoimmune diseases and pathology from chronic infections.

The mechanisms that govern the interstitial motility of CD4 effector T cells at sites of inflammation are relatively unknown. We present a non-invasive approach to visualize and manipulate in vitro-primed CD4 T cells in the inflamed ear dermis, allowing for study of the dynamic behavior of these cells in situ.

הדמית תא CD4 T גירת ביניים בדרמיס המוסת

The ability of CD4 T cells to carry out effector functions is dependent upon the rapid and efficient migration of these cells in inflamed peripheral ...

Extended Time-lapse Intravital Imaging of Real-time Multicellular Dynamics in the Tumor Microenvironment

In the tumor microenvironment, host stromal cells interact with tumor cells to promote tumor progression, angiogenesis, tumor cell dissemination and metastasis. Multicellular interactions in the tumor microenvironment can lead to transient events including directional tumor cell motility and vascular permeability. Quantification of tumor vascular permeability has frequently used end-point experiments to measure extravasation of vascular dyes. However, due to the transient nature of multicellular interactions and vascular permeability, the kinetics of these dynamic events cannot be discerned. By labeling cells and vasculature with injectable dyes or fluorescent proteins, high-resolution time-lapse intravital microscopy has allowed the direct, real-time visualization of transient events in the tumor microenvironment. Here we describe a method for using multiphoton microscopy to perform extended intravital imaging in live mice to directly visualize multicellular dynamics in the tumor microenvironment. This method details cellular labeling strategies, the surgical preparation of a mammary skin flap, the administration of injectable dyes or proteins by tail vein catheter and the acquisition of time-lapse images. The time-lapse sequences obtained from this method facilitate the visualization and quantitation of the kinetics of cellular events of motility and vascular permeability in the tumor microenvironment.

This protocol describes the use of multiphoton microscopy to perform extended time-lapse imaging of multicellular interactions in real time, in vivo at single cell resolution.

זמן לשגות Extended הדמיה Intravital של Dynamics תאיים בזמן אמת ב microenvironment הגידול

In the tumor microenvironment, host stromal cells interact with tumor cells to promote tumor progression, angiogenesis, tumor cell dissemination and ...

Medicine

Time-lapse 3D Imaging of Phagocytosis by Mouse Macrophages

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of the actin cytoskeleton to capture, envelop and engulf large particles. Although phagocytic receptors, downstream signaling pathways, and effectors, such as Rho GTPases, have been identified, the dynamic cytoskeletal remodeling of specific receptor-mediated phagocytic events remain unclear. Four decades ago, two distinct mechanisms of phagocytosis, exemplified by Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)- and complement receptor (CR)-mediated phagocytosis, were identified using scanning electron microscopy. Binding of immunoglobulin G (IgG)-opsonized particles to Fc&#947;Rs triggers the protrusion of thin membrane extensions, which initially form a so-called phagocytic cup around the particle before it becomes completely enclosed and retracted into the cell. In contrast, complement opsonized particles appear to sink into the phagocyte following binding to complement receptors. These two modes of phagocytosis, phagocytic cup formation and sinking in, have become well established in the literature. However, the distinctions between the two modes have become blurred by reports that complement receptor-mediated phagocytosis may induce various membrane protrusions. With the availability of high resolution imaging techniques, phagocytosis assays are required that allow real-time 3D (three dimensional) visualization of how specific phagocytic receptors mediate the uptake of individual particles. More commonly used approaches for the study of phagocytosis, such as end-point assays, miss the opportunity to understand what is happening at the interface of particles and phagocytes. Here we describe phagocytic assays, using time-lapse spinning disk confocal microscopy, that allow 3D imaging of single phagocytic events. In addition, we describe assays to unambiguously image Fc&#947; receptor- or complement receptor-mediated phagocytosis.

Here we describe methods using spinning disk confocal microscopy to image single phagocytic events by mouse resident peritoneal macrophages. The protocols can be extended to other phagocytic cells.

זמן לשגות הדמיה תלת-ממדית של Phagocytosis על ידי העכבר מקרופאגים

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of ...

Intravital Microscopy of Tumor-associated Vasculature Using Advanced Dorsal Skinfold Window Chambers on Transgenic Fluorescent Mice

Tumor and tumor vessel development, as well as tumor response to therapeutics, are highly dynamic biological processes. Histology provides static information and is often not sufficient for a correct interpretation. Intravital evaluation, in which a process is followed in time, provides extra and often unexpected information. With the creation of transgenic animals expressing cell-specific markers and live cell tracers, improvements to imaging equipment, and the development of several imaging chambers, intravital microscopy has become an important tool to better understand biological processes. This paper describes an experimental design for the investigation of tumor vessel development and of therapeutic effects in a spatial and temporal manner. Using this setup, the stage of vessel development, tip cell and lumen formation, blood flow, extravasation, an established vascular bed, and vascular destruction can be visualized and followed. Furthermore, therapeutic effects, intratumoral fate, and the localization of chemotherapeutic compounds can also be followed.

This protocol describes the intravital imaging of transgenic mice expressing cell-specific fluorescent markers. Intravital imaging provides a non-invasive method for high-resolution observations in living animals using implantable windows through which the microscopic visualization of processes is possible. This method is especially useful to study longitudinal processes.

מיקרוסקופ intravital להערכת סרטניים הקשורים לשימוש מתקדם הגבי צ'יימברס Skinfold חלון על העכברים הטרנסגניים פלורסנט

Tumor and tumor vessel development, as well as tumor response to therapeutics, are highly dynamic biological processes. Histology provides static ...

Intravital Imaging of Intraepithelial Lymphocytes in Murine Small Intestine

Intraepithelial lymphocytes expressing &#947;&#948; T cell receptor (&#947;&#948; IEL) play a key role in immune surveillance of the intestinal epithelium. Due in part to the lack of a definitive ligand for the &#947;&#948; T cell receptor, our understanding of the regulation of &#947;&#948; IEL activation and their function in vivo remains limited. This necessitates the development of alternative strategies to interrogate signaling pathways involved in regulating &#947;&#948; IEL function and the responsiveness of these cells to the local microenvironment. Although &#947;&#948; IELs are widely understood to limit pathogen translocation, the use of intravital imaging has been critical to understanding the spatiotemporal dynamics of IEL/epithelial interactions at steady-state and in response to invasive pathogens. Herein, we present a protocol for visualizing IEL migratory behavior in the small intestinal mucosa of a GFP &#947;&#948; T cell reporter mouse using inverted spinning disk confocal laser microscopy. Although the maximum imaging depth of this approach is limited relative to the use of two-photon laser-scanning microscopy, spinning disk confocal laser microscopy provides the advantage of high speed image acquisition with reduced photobleaching and photodamage. Using 4D image analysis software, T cell surveillance behavior and their interactions with neighboring cells can be analyzed following experimental manipulation to provide additional insight into IEL activation and function within the intestinal mucosa.

We describe a method to visualize GFP-labeled &#947;&#948; IELs using intravital imaging of murine small intestine by inverted spinning disk confocal microscopy. This technique enables the tracking of live cells within the mucosa for up to 4 h and can be used to investigate a variety of intestinal immune-epithelial interactions. &#160;

הדמיה של Dynamics התאים מיאלואידית בזמן אמת

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

לשעבר Vivo הדמיה של לימפוציטים מסוג T CD8 תושב באמבריולוגיה הגידול פרוסות משתמש מיקרוסקופיה קונפוקלית

חלון מיוצב להדמיה תוך חיונית של הלבלב המוריני

חלון מיוצב להדמיה תוך חיונית של הלבלב המוריני

חלון מיוצב להדמיה תוך חיונית של הלבלב המוריני

הדמיה נויטרופילים ומונוציטים בmesenteric ורידים על ידי מיקרוסקופית Intravital על עכברים מורדמים בזמן אמת

הדמית תא CD4 T גירת ביניים בדרמיס המוסת

זמן לשגות Extended הדמיה Intravital של Dynamics תאיים בזמן אמת ב microenvironment הגידול

זמן לשגות הדמיה תלת-ממדית של Phagocytosis על ידי העכבר מקרופאגים

מיקרוסקופ intravital להערכת סרטניים הקשורים לשימוש מתקדם הגבי צ'יימברס Skinfold חלון על העכברים הטרנסגניים פלורסנט

אינטרטל הדמיה של לימפוציטים תוך-אפיתל במעי קטן מוריין