אנטיגנים רבים של תת-יחידות חיסון מועמדים הם חלבוני ממברנה. מבחינה היסטורית, היה קשה לייצר ולטהר אותם בכמויות מספיקות. בעזרת טכניקה זו, אנו מסוגלים ליצור אנטיגנים בעלי עניין המוטמעים בתוך קרום השומנים כדי להבטיח אישור דמוי יליד.
תהליך זה גם מקל על ניסוח עם adjuvants של עניין. ביטוי ללא תאים מאפשר ייצור מהיר של חלבונים בעלי עניין במבנה חסר התגים הטבעי שלהם. טכניקה זו ניתנת להרחבה ואנו כבר עובדים עם חברות מסחריות לפיתוח פורמולציות חיסונים באמצעות תהליך זה.
אנו מדגימים כאן את התהליך עבור אנטיגן כלמידיה, אך ניתן להתאים את התהליך בקלות לייצור אנטיגנים מעניינים ללא קשר אם הם חלבוני ממברנה או לא. תהליך זה עשוי להיות ישים הן לפיתוח פתוגן והן לפיתוח חיסון לסרטן. כדי להתחיל, הכינו MOMP-tNLPs על ידי שימוש בשיטה ללא תאים.
הפשיר את מאגר ההרכבה מחדש של ערכת ביטוי החלבון ללא תאים שעתיים לפני הגדרת התגובה והוסף מעכב פרוטאז ללא EDTA לחיץ. השתמש בערכה המיועדת להריץ חמש תגובות של מיליליטר. עבור כל תגובה של מיליליטר אחד, הוסף 525 מיקרוליטר של חיץ הרכבה מחדש לבקבוק E.coli lysate וגלגל אותו להתמוססות.
יש להוסיף 250 מיקרוליטר של חיץ ההרכבה מחדש לבקבוק התגובה המכיל את התוסף ולהמיס על ידי גלגול. לאחר מכן, הוסף 8.1 מיליליטר של חיץ reconstitution לבקבוק הזנת התגובה וגלגל אותו להתמוססות. לבקבוק של תערובת חומצות אמינו, הוסיפו שלושה מיליליטר של חיץ להרכבה מחדש כדי להמיס אותו.
לבקבוק נוסף של מתיונין, הוסיפו 1.8 מיליליטר של חיץ הרכבה מחדש, המסו אותו ואחסנו אותו על קרח. הוסף 225 מיקרוליטר של תערובת משוחזרת, 270 מיקרוליטר של תערובת חומצות אמינו משוחזרת ללא מתיונין, ו -30 מיקרוליטר של מתיונין משוחזר לבקבוק E.coli lysate. יתר על כן, להוסיף 400 מיקרוליטר של תערובת DMPC / telodendrimer 15 מיקרוגרם של פלסמיד MOMP, ו 0.6 מיקרוגרם של delta-49ApoA1 לתערובת ולערבב אותו.
Aliquot 20 מיקרוליטר של הפתרון הכולל בצינור 1.5 מיליליטר עבור תגובת בקרה המבטאת GFP. הכינו תמיסת הזנה על ידי הוספת 2.65 מיליליטר של תערובת חומצות אמינו משוחזרת ללא מתיונין ו -300 מיקרוליטר של מתיונין משוחזר. מעבירים מיליליטר אחד מתמיסת התגובה לתא התגובה הפנימי בערכת התגובה ללא תאים ואוטמים אותו.
מלא את החדר החיצוני של כלי התגובה עם 10 מיליליטר של פתרון הזנה ולסגור אותו. הוסף 0.5 מיקרוליטר של פלסמיד בקרת GFP לאליציטוטים של 20 מיקרוליטר של תערובת התגובה. שים את התגובה בשייקר ב 300 סיבובים לדקה במשך 18 שעות ב 30 מעלות צלזיוס.
עקוב אחר התגובה תחת אור UV לאחר 15 דקות עבור פלואורסצנטיות עקב סינתזת GFP. לטהר את קומפלקס הננו-חלקיקים MOMP-tNLP מתערובת התגובה נטולת התאים על ידי כרומטוגרפיית זיקה לניקל משותק באמצעות תג HIS-על חלבון delta-49ApoA1. העבירו מיליליטר אחד מה-50% של שרף הטיהור HIS-tag לעמודת כרומטוגרפיה חד-פעמית של 10 מיליליטר, והוסיפו שלושה מיליליטר של חיץ קשירה לאיזון.
לאחר מכן, נקזו את החיץ והוסיפו 250 מיקרוליטר של חיץ קשירה לשרף. חלץ 20 מיקרוליטר של תערובת התגובה ללא תאים לניתוח SDS-PAGE. מוסיפים את תערובת התגובה נטולת התאים הנותרת עם השרף המאוזן ודגרים על נדנדה במעבדה למשך שעה אחת בארבע מעלות צלזיוס.
הסר את מכסה העמוד ושטוף אותו עם 500 מיקרוליטר של חיץ קשירה. הוסף את נוזל הכביסה לעמודה ואסוף את הזרימה לצורך ניתוח SDS-PAGE. לשטוף את העמוד עם מיליליטר אחד של חיץ לשטוף עם imidazole 20 מילימולרי שש פעמים ולאסוף את השברים.
בזמן הכביסה בפעם השנייה, להשתמש פיפטה של מיליליטר אחד כדי לעורר את השרף. הצדיעו ל-MOMP-tNLPs בשישה שברים של 300 מיקרוליטר של חיץ אלוציה I המכיל אימידזול של 250 מילימולר ואלוטיון סופי עם 300 מיקרוליטר של חיץ אלוציה II המכיל אימידזול של 500 מילימולרי. על ההדבקה השנייה, להתסיס במרץ את השרף על ידי pipeting למעלה ולמטה באמצעות פיפטה של מיליליטר אחד.
השתמש במצלמת ג'ל כדי לצלם את התמונות במהירות של 600 ננומטר. לאחר מכן, כמת את כמות החלבונים השונים בננו-חלקיקים באמצעות ניתוח SDS-PAGE באמצעות תקן חלבון. צייר עקומה סטנדרטית באמצעות הצפיפויות של רצועות MOMP.
לאחר מכן, קבע את רכיב MOMP של ננו-חלקיקים עם התקן. פתרו את הדגימות באמצעות SDS-PAGE והעבירו את ערימות הג'ל באמצעות מערכת מסחרית לניקוי יבש לניתוח כתמים מערביים. הסר את הכתמים מהערימה ודגר עליהם למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס במאגר חוסם המכיל 0.2% TWEEN 20 ו- 0.5 מיקרוגרם למיליליטר MAb40, או 0.2 מיקרוגרם למיליליטר MAbHIS נוגדן antiHIS-tag המכוון נגד תג HIS מחלבון delta-49ApoA1.
שטפו כל כתם עם PBST שלוש פעמים במשך חמש דקות לכל כביסה. לדגור את הכתמים במשך שעה אחת במאגר חוסם המכיל נוגדן משני מצומד לפלואורופור בדילול של 1:10, 000. חזור על השטיפות עם PBST וצלם את התמונה באמצעות מכונת צילום פלואורסצנטית לאחר השטיפה הסופית.
באמצעות מנגנון כתם נקודה, כתם שלושה מיקרוגרם של MOMP-tNLP ו tNLP ריק. לפתח ולחסום את הכתמים באותה שיטה עבור כתמים מערביים. מקפיאים את התמיסה המעורבת על קרח יבש והופכים אותה למשך הלילה לליופיליזר.
אחסנו את הפורמולות המיובשות בטמפרטורה של מינוס 20 מעלות צלזיוס. בעת הצורך, הרכיבו מחדש את ה-tNLPs שעברו ליופיליזציה במים נטולי אנדוטוקסין וגלגלו אותם כדי להתמוסס ולהתייבש. דיאליזה את התמיסה עם PBS ולהסיר את הטרהלוז עם קרום דיאליזה בחיתוך 3.5 קילודלטון.
צנטריפוגה את תמיסת הננו-חלקיקים ברכז ואקום לפני הוספת האדג'ובנט. נטרו את נפח הדגימה לאחר 20 עד 30 דקות כדי למנוע ייבוש מלא. בארון בטיחות ביולוגית, הוסיפו את האדג'ובנט בתנאים סטריליים.
באמצעות כרומטוגרפיה אנליטית של אי הכללת גודל, לנתח את הניסוח לשילוב מוצלח. אחסנו את MOMP-tNLPs האדג'ובנטיים ורוקנו tNLP בארבע מעלות צלזיוס למשך עד 14 יום. לנתח את היציבות של ניסוח tNLP עם כרומטוגרפיה אי הכללת גודל.
ניתוח SDS-PAGE של MOMP-tNLP בוצע באמצעות כרומטוגרפיית זיקה לניקל, אשר הראתה כי לתערובת התגובה ללא תאים יש רמות גבוהות של ביטוי הן עבור MOMP והן עבור חלבוני delta-49ApoA1. על ידי שימוש בצפיפות ג'ל, ריכוז MOMP כומת באמצעות MOMP רקומביננטי מטוהר עם ריכוז ידוע כסטנדרט. כדי לקבוע את היווצרות האוליגומרים, SDS-PAGE MOMP ו-MOMP-tNLP טופלו בחום וב-DTT, שהראו רצועות נפרדות עבור MOMP ו-delta-49ApoA1.
ניתוח כתמים מערביים באמצעות נוגדן MAb40 הופעל כנגד חלבון MOMP, אשר חשף דפוס פסים המאשר את היווצרות האוליגומרים על ידי חלבון MOMP במצבו הלא מפורק . בדיקת כתם נקודה בוצעה בנוכחות נוגדנים MAb40 ו- MAbHIS, שהצביעו על היווצרות MOMP-tNLP. עם זאת, tNLP ריק הראה איתות חיובי עבור MAbHIS.
Sera מהעכברים המחוסנים שקיבלו הזרקת MOMP-tNLP אדג'ובנטי הדגימה קשירת MOMP חזקה והצביעה על כך ש-MOMP-tNLP יכול לעורר תגובה חיסונית. מכיוון שפרוטוקול זה מייצר חלבון מ- DNA, חיוני להימנע מזיהום התגובה עם DNase, RNase, כמו גם את ה- DNA וה- RNA החיצוניים. כל החומרים או הריאגנטים המשמשים בתגובות צריכים להיות חופשיים מסוג זה של מולקולות.
לאחר ביטוי, טיהור והוספה של אדג'ובנטים, מועמדים אלה לחיסון יכולים להיות מוערכים במודלים מתאימים של בעלי חיים עבור הפתוגנים המעניינים כדי להעריך סמני הפעלה חיסונית או להעריך הגנה במהלך אתגר. עבור כלמידיה, חלבון הממברנה החיצונית העיקרי, או MOMP, נחשב לאנטיגן מועמד מוביל לחיסונים תת-יחידות במשך שנים רבות, אך היה קשה לייצר אותו בהיקפים הדרושים ליישום החיסון. ביטוי משותף ללא תאים של חלבון ממברנה זה הוא דרך מעשית להתחיל להניע חלבון זה לקראת הערכה במודלים של בעלי חיים כגון עכברים, ובסופו של דבר לעבור לניסויים בבני אדם.
