הערכה של פתוגן-פונדקאי תגובות והיעילות החיסון בעכברים

הפרוטוקול מאפשר הערכה של תגובות מארח למגוון פתוגנים וניסוח חיסונים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת הערכה של נטל חיידקי ותגובות חיסוניות ב vivo, באמצעות מודל בעלי חיים מתכלה. מדגימה את ההליך הזה היא Kacy Yount, סטודנטית לתואר שני מהמעבדה שלי.

עבור חיסון, לאשר חוסר תגובה קמצוץ בוהן בעכבר הרדמה, שישה עד שתים עשרה שבועות, טען מזרק אינסולין מיליליטר אחד, מצויד מחט מד 28.5 עם 0.1 מיליליטר של החיסון של עניין. מחזיקים את המזרק בזווית של 45 מעלות, כאשר השיפון פונה כלפי מעלה, מכניסים את המחט כחמישה מילימטרים לתוך הדלטואיד של העכבר, ומזריקים את החיסון. שמור את המחט מוכנס לשריר במשך חמש עד עשר שניות, ולאחר מכן לסובב את המזרק 180 מעלות, כך שפוע פונה כלפי מטה כדי ליצור חותם, ולמנוע דליפת חיסון, לפני נסיגה איטית את המחט מאתר ההזרקה.

ואז להחזיר את העכבר לכלוב שלה, עם ניטור, עד החלמה מלאה. כשבועיים לאחר האצה, להדביק עכברים מחוסנים. לתפוס עכבר הרדמה על ידי עורף של בית החזה הגבי, מאחורי השכמות והצוואר, ולמקם את העכבר זקוף כדי לגשת לאף.

באמצעות קצה פיפטה 200 מיקרוליטר, לאט להחיל 20 עד 25 microliters של inoculum חיידקי של עניין על כל nare של החיה, מחזיק את העכבר עד inoculum כולו כבר בשאיפה. לאחר מכן ספק נפח שווה של PBS סטרילי לקבוצה אחת של עכברים כפקד שלילי. בנקודת הקצה הניסיונית המתאימה, מניחים צד גחוני של עכבר נגוע על לוח ניתוח, ומאבטחים את הגפיים.

הרטב את הגוף עם 70% אתנול, ולהשתמש מדפים כדי לאחז את העור מתחת לבטן במרכז האגן. באמצעות מספריים חדים, לעשות חתך אנכי עד ההיתוך, ול לנתח את העור מקיר צפק. מעבירים את העור לצדי הפגר כדי ליצור שדה ללא הפרעה לקציר איברים סטריליים, ולתפוס את צמיטונום שלם מתחת לבית החזה, בכבד או לידו.

חותכים את peritoneum לכיוון בית החזה כדי לחשוף את מערכת העיכול התחתונה, ולהזיז את המעי הגס שמאלה כדי לחשוף את הטחול. באמצעות מדפים מעוגלים, לתפוס את הטחול, ול לנתח את רקמת החיבור עם מספריים. לאחר מכן מניחים את הטחול בצינור חרוט 15 מיליליטר המכיל 3 מיליליטר של RPMI, ו 5% סרום בקר עוברי על קרח.

השתמש מטחנים כדי לייצב את בית החזה בתהליך קסיפואיד, לחתוך לפתוח את הסרעפת. הריאות צריכות לנפח, ולרדת לכיוון עמוד השדרה. חותכים את בית החזה בצדדים כדי להסיר את החזן, לחתוך את העורקים הריאה והוורידים כדי לבודד ולהסיר את האונה העליונה של הריאה הימנית.

תקן את האונה בצינור חרוט 15 מיליליטר של 10% פורמלין במאגר ניטרלי בטמפרטורת החדר לפחות 24 שעות, ולבודד את האונות הנותרות של הריאות הימנית והשמאלית. לאחר מכן מניחים אונות בצינור חרוט 15 מיליליטר, המכיל שני מיליליטר של 1% קסטין ב PBS על קרח. השתמש pipetman מיליליטר אחד עם קצה כדי לאסוף את הדם מילוי חלל החזה, ולהעביר את הדם לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר על קרח.

הסר את בלוטות parotid, sublingual, submaxillary ובלוטות הלימפה המכסה את קנה הנשימה, ולפתוח ולהסיר את קרום מגן המקיף את קנה הנשימה. באמצעות מדחפים ומספריים עדין, בזהירות להפריד את קנה הנשימה מן הוושט, וכל רקמת חיבור אחרת מהחלק העליון של עצמות הצווארון לתחתית הלסת התחתונה. השתמש מלקחיים להחזיק את קנה הנשימה, לחתוך את קנה הנשימה בחלק העליון של עצם הבריח.

משוך את קנה הנשימה כדי למקסם את הגמישות, לחתוך את קנה הנשימה בתחתית הישבן, ממש מעל הגרון, בידוד על סנטימטר אחד של רקמה. לאחר מכן מניחים את האיבר בצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר, המכיל 0.3 מיליליטר של 1% קסטין ב- PBS על קרח. עכשיו לסובב את העכבר לגישה ברורה לאף, ולרסס את הראש עם 70% אתנול.

תופסים ידנית את החיה ישירות מאחורי הגולגולת, ולהשתמש במספריים כדי לחתוך את הבשר הרך של האף, החל מתחתית האף נע כלפי מעלה. מוציאים את הפרווה, העור והשפם מסביב לאף, ומכניסים את קצות זוג המספריים המעוקלים לתוך הנארים כשהעיקולים מכוונים כלפי מטה. חותכים את מעבר האף לכיוון העיניים, יצירת היווצרות דמוית V.

לאחר מכן השתמש מטלפים עדינים כדי לאסוף את מחיצת האף, ורקמות רכות בתוך היווצרות, ולמקום את הרקמה בצינור microcentrifuge מראש שכותרתו 1.5 מיליליטר המכיל 0.3 מיליליטר של 1% קסטין ב PBS, על קרח. כדי לעבד את רקמת הריאה, להעביר את כל תכולת צינור דגימת הריאות לתוך homogenizer דונס סטרילי 15 מיליליטר, ולהשתמש עלה כדי הומוגניזציה של הרקמה. נתק את הדגימה עד שלא יישארו חלקיקים גדולים של רקמה, והחזר את ההשעיה ההומוגנית לצינור המקורי של 15 מיליליטר.

הסר aliquot 0.3 מיליליטר עבור ציפוי יחידות הקמת המושבה, ולאסוף את שאר הומוגנית על ידי צנטריפוגה. Aliquot 0.5 מיליליטר של על-טבעי לתוך צינורות מיקרוצנטריפוגה מסומנים מראש לאחסון ב 20 מעלות צלזיוס עד ניתוח ביטוי ציטוקינים על ידי אלייזה. לאחר מכן, לדלל באופן סדרתי 0.1 aliquots מיליליטר של ההשעיה ריאה הומוגנית להגדיר ב 0.9 מיליליטר של PBS סטרילי לכל דילול, ולהשתמש מפזר משולש סטרילי כדי צלחת 0.1 מיליליטר של כל דילול שנבחר אמפירית על תווית מראש 10%Bordet-Gengou בתוספת צלחות סטרפטומיצין.

כאן, צפיפות אופטית ייצוגית 600 מדידות וחישובים כדי להשיג השעיה חיידקית אחת בצפיפות אופטית, כדי להכין inoculum חיידקי מדולל פי מאה להיות מועבר לעכברים, מוצגים. לאחר שבעה ימים של גירוי אנטיגן חיסון, תאי טחול מחוסנים מקבוצה חיסונית משולבת לייצר גמא אינטרפרון, ו IL17, תוך ירידה משמעותית ויסות IL5, קידום עוזר T, אחד T helper 17 קיטוב של התגובה החיסונית במהלך זיהום שעלת B. מושבה להרכיב ספירת יחידה של חיידקים התאושש מבעיות בדרכי הנשימה של עכבר נגוע שעלת B יכול לשמש כדי להעריך את ההשפעות המגוננות של החיסון של עניין.

לעבוד במהירות וביעילות רבה ככל האפשר על מנת למנוע נמק רקמות, ולאחסן את הרקמה המבודדת על הקרח כדי לשמר את הכדאיות של החיידקים התאושש. ניתן לבצע ציטומטריית זרימה ELISpot ובידוד DNA ו- RNA כדי להעריך תאים חיסוניים, ייצור אנליט, ולאפשר ניתוחים אפיגנטיים ותמלוליים. כאשר עובדים עם סוכנים זיהומיות כגון שעלת Bordetella, חשוב לזכור ללבוש את PPE המתאים, ולעבוד ארון biosafety מוסמך על מנת למנוע העברת פתוגן.

פרוטוקול זה מפרט ספירת CFU מדרך הנשימה, במיוחד הלוע האף. כדי לענות על שאלות בתחומי החיסון ומחלות זיהומיות על מיקוד קולוניזציה חיידקית באף.