הבדיקות מבוססות TR-FRET מספקות כלים חסכוניים חדשים להקרנה ואפיון פרמקולוגי של אפננים ספציפיים וסלקטיביים של מסלולי האיתות JAK / STAT. טכניקה זו היא הרבה יותר קלה, מהירה, ניתנת לשחזור, וחזקה מאשר שיטות קונבנציונליות כמו כתם מערבי ו ELISA. אין צורך במדרגות כביסה וריגנטים מתווספים בשלב אחד.
פלטפורמה זו חיסונית יכולה להיות מיושמת בקלות על חלבונים אחרים איתות תאים בתנאי נוגדנים ספציפיים זמינים. כדי לעצב בדיקות הניתנות לשחזור, עליך להשתמש בשיטות טובות של תרביות תאים ולקבוע נהלי הפעלה סטנדרטיים. בנוסף, עליך לייעל בזהירות את תרבית התא ואת תנאי הטיפול.
מדגים את ההליך יהיה ז'נבייב שאטל, מדען מהמעבדה שלנו. בתור התחלה, תרבית HeLa ותאי A431 בחממה לחה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני באמצעות DMEM בתוספת 10% FBS. כאשר התאים מגיעים למפגש של 70 עד 80%, מנסים לבצע בהם טריפסין או לעבור או להשתמש בהם לבדיקות.
כדי לבצע את הבדיקה, לחלק 50 מיקרוליטרים של תאים בצפיפות ממוטבת מראש לתוך צלחת 96-well-well רקמה מטופלת במדיום התרבות המתאים, ולאחר מכן לדגור אותם בן לילה בחממה 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. למחרת, להכין בינוני כפול וסדרת דילול פי ארבעה של תרכובות הבדיקה על ידי דילול סדרתי של המתחם במדיום ללא סרום על פני 12 בארות של צלחת פוליפרופילן 96-well. לגירוי תאים, הוסיפו 50 מיקרוליטרים של מדיום נטול סרום המכיל את הסימולטור בריכוז של פי 2 ודגרו את התאים לזמן הממוטב מראש בטמפרטורת החדר או בטמפרטורת החדר או ב-37 מעלות.
לעיכוב תאים, הוסיפו 25 מיקרוליטרים של מדיום נטול סרום המכיל את המעכב בריכוז של פי 4 ודגרו את התאים לזמן שעבר אופטימיזציה מראש בטמפרטורת החדר או ב-37 מעלות, ולאחר מכן הוסיפו 25 מיקרוליטרים של מדיום ללא סרום המכיל את הממריץ בריכוז של פי 4 ודגרו לזמן הממוטב מראש. לאחר מכן, כדי lyse את התאים, להכין את מאגר תמוגה 1X בתוספת ולהוסיף קוקטייל מעכבי פוספטאז אליו. לאחר הסרה בזהירות והשלכת המדיום תרבית התא, מיד להוסיף 50 microliters של חיץ תמוגה 1X מוכן להשלים ודגור במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר תחת רועד עם עצבנות מתונה.
לגילוי TR-FRET, הכן את תמהיל זיהוי הנוגדנים 4X במאגר זיהוי פי 1, ולאחר מכן הכן את פתרונות הנוגדנים EUAB1 ו- FRAB2, כמו גם את פתרונות הנוגדנים EUAB3 ו- FRAB4 במאגר זיהוי 1X. לבסוף, ערבבו את EUAB1 מדולל מראש עם FRAB2 מדולל מראש לגילוי זרחן ו-EUAB3 מדולל מראש ו-FRAB4 מדולל מראש לגילוי חלבון כולל. לאחר מכן בזהירות פיפטה 15 microliters של התא lysate מצלחת התרבות 96-well לבאר של לבן בנפח נמוך 384-well microplate.
לאחר מכן, להוסיף 15 microliters של lysate בקרה חיובית ו 15 microliters של מאגר תמוגה 1X כפקד שלילי כדי להפריד בארות בדיקה. לבארות המכילות 15 מיקרוליטרים של הליסט, הוסיפו חמישה מיקרוליטרים של תערובת זיהוי הנוגדנים 4X המתאימה כדי לזהות את הפוספופרוטאין או את החלבון הכולל. לאחר כיסוי הצלחת עם אטם צלחת, לדגור אותו בטמפרטורת החדר במשך שעה אחת עד לילה בהתאם לערכת הבדיקה.
לאחר השלמת הדגירה, הסר את אטם צלחת הדבק וקרא את הצלחת על קורא מיקרופלט תואם TR-FRET. תוצאות בדיקות TR-FRET לגילוי וכימות של phospho-STAT1 עם סך הכל STAT1 ו phospho-STAT4 בתאי U266B1 יחד עם phospho-STAT5 עם סך STAT5 בתאי A431 מיוצגים באמצעות עקומות תגובת ריכוז. באופן דומה, בדיקות TR-FRET לאיתור וכימות של זרחן-STAT3 וסה"כ STAT3 וזרחן-STAT6 וסך הכל STAT6 בתאי HeLa מיוצגים באמצעות עקומות תגובת ריכוז.
בסך הכל, כל הבדיקות הראו אותות TR-FRET חזקים, טווחים דינמיים רחבים, וריאציה נמוכה של מקדם בין-בארות ויחסי אות-לרקע מקובלים. טיפול בתאים עם מפעילי JAK, אינטרפרון אלפא-2B ו IL-4 ו- EGF הראה את העלייה הצפויה תלוי ריכוז בזרחן STAT בשאריות טירוזין ספציפיות, בעוד חלבוני STAT הכולל המקבילים נותרו יציבים. הן מעכב JAK והן erlotinib עיכבו את רמות הפוספו-STAT המתאימות באופן תלוי ריכוז.
תוצאות של גירוי פוספו-STAT4 על ידי אינטרפרון אלפא-2B בקו תא השעיה או גירוי זרחן-STAT6 על ידי IL-4 בקו תא הדבקה באמצעות פרוטוקול צלחת אחת היו עקביים עם אלה שהושגו באמצעות פרוטוקול שתי לוחות, ובכך הראו הסתגלות מוצלחת של פרוטוקול העברת שתי לוחות לפרוטוקול All-in-One-well של צלחת אחת. תוצאות מחקר השונות התוך-צלחת עבור בדיקת phospho-STAT1 באמצעות קו תא השעיה ואת הבדיקה phospho-STAT3 באמצעות קו תא הדבקה להדגים את החוסן של בדיקות אלה זרחן-STAT עבור יישומי HTS. זה חיוני כדי להשלים את מאגר תמוגה עם קוקטייל מעכבי פוספטאז כדי למנוע dephosphorylation של חלבונים זרחן מן פוספטאז פעיל נוכח תמצית התא כולו.
