ביו-הדפסה תלת-ממדית של אסטרוציטים מייצגת התקדמות בהנדסת רקמות נוירו, ומאפשרת ביו-פיבריות של מודלים במבחנה שימושיים להבנת המנגנונים המעורבים במחלות נוירולוגיות. היתרון העיקרי של ביו-הדפסה תלת-ממדית הוא ביו-פטריית מבנים מן החוץ של התאים המחקים את התכונות הביוכימיות והמכניות של הרקמות, ומספקים הבנה טובה יותר של דינמיקת התאים בבריאות ובמחלות. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על biofabrication של רקמות רכות אחרות, כפי שהוא מבוסס על הדפסה ביולוגית 3D של ביו-דיו המורכב פולימרים טבעיים ורכיבי מטריצה חוץ תאית.
ראשית, לחתוך את רקמת קליפת המוח מבודד מן העכבר המתת חסד לחתיכות קטנות עם מספריים מיקרו מעוקלים. לשטוף את חתיכות הרקמה שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של HBSS על ידי צינור למעלה ולמטה. לאחר הסרת HBSS הוסיף בפעם השלישית, להוסיף מיליליטר אחד של 0.05%טריפסין ולדגירה את הרקמה במשך חמש דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
לניתוק רקמות מכני, יש להפיץ בעדינות את תערובת טריפסין הרקמה למעלה ולמטה 15 פעמים. לאחר מכן, להעביר את התערובת מנותקת לצינור חרוט 15 מיליליטר ולהוסיף נפח שווה של FBS כדי לנטרל את פעילות טריפסין. סנן את המתלה באמצעות מסנן מסנן מסננת תאי מיקרומטר 0.4 כדי להסיר שברים שאינם מנותקים.
לשטוף את המסנן עם מיליליטר אחד של אסטרוציטים בינוני. גלולה למטה השעיית התא המסונן על ידי צנטריפוגה. לאחר השלכת supernatant, להשעות את גלולה התא במיליליטר אחד של אסטרוציטים תרבות מדיום.
העבר את ההשעיה התאית לבקבוקון תרבות T25. להפוך את הנפח הבינוני הכולל של 3.5 מיליליטר ולדגירה את התאים ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. לקבלת פיברינוגן בריכוז הסופי של שלושה מיליגרם למיליליטר, להעביר 0.9 מיליליטר של 10 מיליגרם לכל תמיסת פיברינוגן מיליליטר לפתרון ג'לטין-ג'לטין מתאקרילויל.
לקבלת יוזם התמונה בריכוז הסופי של 0.5% משקל לפי נפח, להוסיף 0.015 גרם של יוזם תמונה מוכן ג'לטין-ג'לטין methacryloyl פיברינוגן. לאחר מערבולת, לשמור על הפתרון ב 40 מעלות צלזיוס, מוגן מפני אור כדי למנוע השפלה PI. לאחר מכן, לסנן את הפתרון באמצעות מסנן מיקרומטר 0.2 לתוך צינור חרוט סטרילי 15 מיליליטר.
העבר 980 מיקרוליטרים של הפתרון הביו-חומריםי לצינור חרוט 15 מיליליטר. לקבלת למינין בריכוז הסופי של שני מיקרוגרם למיליליטר, הוסף 20 מיקרוליטרים של למינין מדולל לצינור המכיל ביו-דיו. מערבבים בעדינות על ידי צנרת למעלה ולמטה, הימנעות בועות ולשמור על פתרון ביו-דיו ב 37 מעלות צלזיוס עד מוכן לקבל מעורבב עם התאים.
Trypsinize את אסטרוציטים הראשי עם 0.05%טריפסין במשך 5 דקות ולנטרל את פעילות טריפסין עם FPS ביחס של אחד לאחד. לאחר מכן, להעביר את התאים לצינור חרוט 15 מיליליטר צנטריפוגה ב 200 פעמים G במשך חמש דקות. לאחר ספירת התאים, העבר 1 כפול 10 ל -6 תאים לצינור חרוט וצנטריפוגה שונים כפי שהודגם.
השאירו רק 200 מיקרוליטרים של הסופר-נט בצינור והשעו את גלולה התא על ידי הקשה עדינה על תחתית הצינור החרוט. כדי להשיג ריכוז סופי של 1 כפול 10 ל 6 תאים למיליליטר, להעביר מיליליטר אחד של פתרון פיברינוגן ג'לטין-ג'לטין מתאקרילויל לצינור המכיל את התאים הומוגניזציה על ידי צנרת בעדינות למעלה ולמטה. השתמש 1000 פיפטה מיקרוליטר להעביר לאט את אסטרוציטים הניח ג'לטין-ג'לטין מתאקרילויל פיברינוגן ביו-דיו פתרון מזרק פלסטיק חמישה מיליליטר, הימנעות היווצרות בועה.
חבר מחט קהה סטרילית 22 מד למזרק. לחשוף את הביו-הדפסה לאור UV במשך 15 דקות, ולאחר מכן לנגב את הביו-הדפסה עם 70%אתנול, ולאחר מכן לחבר את המזרק לראש ההדפסה ביו הדפסה באופן ידני לשטוף את הדיו הביולוגי כדי להסיר את הבועות הנותרות. כדי לבצע הדפסה ביולוגית, מניחים צלחת תרבות של 35 מ"מ על שולחן הביו-הדפסה, מקמו את המחט במרחק של 0.1 מילימטרים משטח צלחת התרבות כדי לאפשר תנועה של המחט ולחצו על כפתור ההדפסה".
לאחר סיום ההדפסות הביולוגיות, ודאו שהמזרק מתרחק מהמנה וסוגרים את מנת התרבות. מניחים את מנת התרבות תחת אור UV לחיבור צולב של ג'לטין מתאקרילויל. השתמש מרית סטרילית כדי להעביר את המבנה המודפס ביולוגית לצלחת 24 באר.
הוסיפו 500 מיקרוליטרים של תמיסת סידן כלורי תרומבין והשאירו למשך 30 דקות כדי לאפשר חיבור צולב של פיברין. לאחר הסרת הפתרון חוצה קישור, לשטוף את המבנה עם שני מיליליטר של PBS, ולאחר מכן להחליף את PBS עם מיליליטר אחד של אסטרוציטים תרבות מדיום. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני ולשנות את המדיום כל שלושה ימים.
השתמש מרית כדי להעביר את המבנה המודפס ביולוגית לצלחת תרבות 35 מ"מ. לשטוף את המבנה עם מיליליטר אחד של PBS. הפקד 100 מיקרוליטרים של ריאגנט מת חי מעל המבנה ולשמור אותו ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות, שמירה על זה מוגן מפני אור.
לאחר הסרת ריאגנט מת חי, לשטוף את המבנה עם PBS כפי שהוכח. העבר את המדגם לצלחת קונפוקלית והתבונן בתאים בתוך המבנה תחת מיקרוסקופ קונפוקלי באמצעות עירור של 488 ו -570 ננומטר לרכישת תמונה. לאחר הדפסה ביולוגית תלת-ממדית, הוערכה שלמות הפיגומים המודפסים ביולוגית והיווצרות מבנה מוגדר היטב נצפתה עם תאים לכודים בתוך הביו-חומרים.
לאחר ביו-הדפסה ותהליכי קישור צולב, רוב התאים הציגו מורפולוגיה עגולה כאשר המבנה היה דגירה עם מדיום אסטרוציטים. הפיגומים המודפסים ביו-מודפסים שמרו על שלמות לאחר שבעה ימים של דגירה, ולמרות שנצפתו כמה תאים עגולים, אסטרוציטים רבים התפשטו ברחבי המבנה, והציגו מורפולוגיה אסטרוציטית ויחסים הדדיים. הכדאיות של התא הוערכה מיד לאחר הדפסה ביולוגית ותוצאות הראו כי במהירות נמוכה יותר, תאים קיימא ייצגו עד 74% מכלל התאים, להיות גבוה באופן משמעותי מאשר תאים ביוהדפסה במהירות גבוהה יותר.
הכדאיות של אסטרוציטים מודפסים ביו-מודפסים מנורמלה לאסטרוציטים מתורבתים 2D והתוצאות הצביעו על כך שביום השביעי, האסטרוציטים המודפסים ביו-מודפסים הגדילו באופן משמעותי את הכדאיות. מיד לאחר הטביעה הביולוגית, האסטרוציטים הראו מורפולוגיה עגולה ובחון מת חי. לאחר שבוע, האסטרוציטים התפשטו לאורך המבנה והציגו מורפולוגיה ברורה של תאים, זהים לתרבות הדו-די.
האסטרוציטים המודפסים ביו-ממדיים התאפיינו באימונופלואורסצנטיות. לאחר שבעה ימים של דגירה במבנה המודפס ביולוגית, נצפו אסטרוציטים צפופים מאוד עם מורפולוגיה דמוית כוכב. תאי האסטרוציטים המודפסים ביו-מודפסים הביעו את החלבון החומצי גליה גליה סמן אספרילרי ספציפי מציין שמירה על פנוטיפ אסטרוציטי לאחר שבעה ימים של ביו-הדפסה, ותוצאות אלה מצביעות על כך שהרכב הביו-דיו סיפק מיקרו-סביבה תואמת ביולוגית לקידום הידבקות, התפשטות וצמיחה של אסטרוציטים.
הערכה של ביטוי גנים וסמני תאים ספציפיים על ידי אסטרוציטים מודפסים ביולוגית תספק עדות לתפקוד דמוי הרקמה העצבית, כגון תגובתיות אסטרוציטארית בעקבות גירויים ספציפיים. פרוטוקול זה סולל את הדרך לביו-פיכחון של מבנים מורכבים יותר דמויי נוירו המורכבים מסוגים שונים של תאים ביומולקולס, ומאפשר חיקוי של נישות נוירוגניות ספציפיות.
