טכניקת פרופיל הריבוזום, הנקראת גם RIBO-seq, היא כיום הכלי היעיל ביותר לחקר תהליך סינתזת החלבון ב- vivo. היתרון של שיטה זו הוא היכולת שלה לפקח על התרגום על ידי מיפוי מדויק של המיקום ומספר הריבוזומים. RIBO-seq מבוסס על העובדה כי הריבוזום, על ידי קשירה למולקולת mRNA, מגן על השבר הקבור של התמליל על עיכול ריבונוקלאאז.
ניתן לרצף את השברים שהושגו, הנקראים עקבות ריבוזומליות, על גבי התמליל שממנו הגיעו, וכתוצאה מכך לקבוע את המיקום המדויק של הריבוזומים. במקביל ל- RIBO-seq, רצף mRNA כולל בעל תפוקה גבוהה מבוצע כדי לספק נקודת התייחסות ולאפשר השוואת נתונים הן מ- RIBO-seq והן מ- RNA-seq במהלך ניתוח נתונים. לפני קצירת תאים, אתה יכול אופציונלי להוסיף כלוראמפניקול לתרבות החיידקים, לריכוז הסופי של 100 מיקרוגרם למיליליטר, כדי לעכב את התרגום.
דגירה את התרבות עם אנטיביוטיקה במשך דקה אחת. שלב זה חשוב אם הקציר לוקח יותר זמן מהרגיל, כמו עיכוב תרגום מאפשר להאריך את זמן איסוף מדגם. לאסוף את הדגימות עם מערכת סינון מחומם מראש.
אתה יכול להציג רעידות על מנת לחקות את תנאי הצמיחה. הפסק לסנן כאשר כל המדיה עברה דרך הממברנה, אך אל תאפשר למסנן להתייבש לחלוטין. לאסוף כדורי חיידקים על ידי גירוד מהיר את התאים של דיסק המסנן באמצעות מראש מחומם, חיטוי scoopula.
מיד למקם את הסקופולה כולה עם התאים שנקטפו בצינור 50 מיליליטר מלא חנקן נוזלי. גלולה שנקטפו צריך להיות מכוסה לחלוטין חנקן נוזלי. תן גלולה להקפיא ביסודיות, ולעקור תאים קפואים באמצעות scoopula מקורר בעבר.
סגור את המכסה, וודא שהוא מנוקב. זה חשוב, כמו חנקן נוזלי יכול לגרום מיכלים סגורים להתפוצץ עקב שינוי הלחץ על אידוי. הכינו GMPP, ספוגית דנ"א וצינורות אפנדורף טריים המוקדשים לליסאז.
הכן מאגר תמוגה עם תוספת של כלוראמפניקול במידת הצורך. להקצות 500 מיקרוליטרים של מאגר תמוגה לכל מדגם לתוך צינורות Eppendorf נפרדים, ומניחים אותם על קרח. נטרף מרגמה ועלי עם חיטוי מעבדה ו-70% אתנול.
מצננים מרגמה ועלי על ידי שפיכת חנקן נוזלי לתוך המרגמה. מעבירים את גלולת החיידקים הקפואים למרגמה צוננת מראש וטוחנים אותה לאבקה. מוסיפים כנפח אחד של תחמוצת אלומיניום וממשיכים לטחון.
שמור מרגמה, עלה, ואת התאים להתקרר על ידי שפיכת חנקן נוזלי בעת הצורך, לא לתת את התוכן של מרגמה להפשיר. ממש לפני השימוש, להוסיף GMPPNP ו DNA ספוגית לתוך aliquot מאגר תמוגה. מעבירים את הפתרון למרגמה וממשיכים לטחון.
תן לליסאז להפשיר לאט תוך כדי שחיקה. כאשר הליסאז מפשיר לחלוטין, מעבירים את התערובת לצינור אפנדורף המצונן מראש וחוזרים לקרח. צנטריפוגה lysase ב 20, 0000 G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.
מעבירים את הסופרנטנטים לצינורות אפנדורף טריים ומצוננים מראש ומניחים אותם על קרח. למדוד את ריכוז RNA בכל מדגם מדולל עם NanoDrop. מחלקים כל lysate לשתי מנות, 0.5 עד 1 מיליגרם של RNA עבור RIBO-seq, והשאר עבור RNA-seq.
למיליגרם אחד של ה-RNA, הוסיפו 3.8 מיקרוליטרים של MNase ב-Tris pH 8, ומעליו מאגר תמוגה לנפח הכולל של 500 מיקרוליטרים. דגירה ב 25 מעלות צלזיוס, 300 סיבובים לדקה, במשך 45 דקות. כאשר הדגירה מסתיימת, לנקות את הדגימות עם ערכת ניקוי RNA זמין מסחרית.
הכינו 15% ג'ל TBE פוליאקרילמיד עם שמונה אוריאה טוחנת, והניחו אותו במיכל עם חיץ TBE. לרוץ מראש במשך מינימום של 10 דקות במתח קבוע של 200 וולט. מערבבים את הדגימות עם מאגר מדגם TBE-Urea.
דנאטורה ב 95 מעלות צלזיוס לדקה אחת ומניחים אותם מיד על קרח. לשטוף את אוריאה על ידי הזרקת חיץ TBE לתוך בארות ג'ל באמצעות מזרק. לטעון את הדגימות, משאיר רווח באר אחד ביניהם כדי להפריד כל מדגם ולמנוע זיהום צולב.
השתמשו באוליגו באורך 29 נוקלאוטידים, ובתערובת של אוליגו באורך 26 ו-32 נוקלאוטידים כסמנים. הפעל את האלקטרופורזה במתח קבוע של 180 וולט. הכינו חיץ סטרילי להדגרת לילה.
לאחר שהאלקטרופורזה מסתיימת, הכתימו את הג'ל בזהב SYBR. בלו שברים של הג'ל בין 26 ל 32 נוקלאוטידים עם מחט סטרילית או סכין גילוח, ומניחים את שברי הג'ל בצינורות Eppendorf נפרדים. לשנות את המחט או סכין הגילוח בין הדגימות.
הוסף 200 מיקרוליטרים של מאגר דגירה לילה לכל Eppendorf ולהדגיר את הדגימות ב 10 מעלות צלזיוס, 1000 סיבובים לדקה, לילה. למחרת, לנקות את הדגימות עם ערכת ניקוי RNA, ו elute אותם 18 microliters של מים ללא גרעינים. העקבות הריבוזומליות המתקבלות מוכנות להכנת הספרייה.
בצע דלדול RNA ריבוזומלי עבור דגימות עבור RNA-seq באמצעות ערכה זמינה מסחרית. לאחר מכן, לנקות את הדגימות עם ערכת ניקוי RNA. בצע הידרוליזה אלקליין כדלקמן;להכין את מאגר הידרוליזה אלקליין, להוסיף נפח אחד של המאגר לנפח אחד של המדגם, ולהדגיר ב 95 מעלות צלזיוס במשך 25 דקות.
הוסף חמישה microliters של 3 Molar נתרן אצטט pH 5.5 לכל מדגם על מנת לעצור את התגובה. נקו את הדגימות בערכת ניקוי רנ"א, ושחררו אותן ב-18 מיקרוליטרים של מים נטולי גרעין. RNA מקוטע באופן אקראי המתקבל מוכן להכנת הספרייה.
הוסף 10 מיקרוליטרים של חיץ תגובה 10x וחמישה microliters של קינאז פולינוקלאוטידים T4 לכל מדגם. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה וחצי. לאחר מכן, להוסיף שלושה microliters של ATP מילימולאר אחד דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת.
לאחר מכן, לנקות את הדגימות עם ערכת ניקוי RNA. בצע את הכנת הספרייה באמצעות הערכה המסחרית הזמינה, בהתאם לפרוטוקול המפורט כאן. בצע PAGE באמצעות ג'ל פוליאקרילמיד 6%."
הכתים את הג'ל בזהב SYBR. Excise שברי ג'ל המכילים את הספריות. עבור דגימות RNA-seq, הספרייה היא בין 135 ל 180 נוקלאוטידים, ועבור RIBO-seq, בין 135 ל 170 נוקלאוטידים.
השתמש מחטים סטריליות או סכיני גילוח ומניחים את שברי ג'ל מגורש בצינורות Eppendorf נפרדים. זכור לשנות את המחט או סכין הגילוח בין הדגימות. הוסיפו 100 מיקרוליטרים של מים נטולי גרעין לכל שבר ג'ל שנכרת.
ותדגיר אותם ב-10 מעלות צלזיוס, 450 כדורים לדקה, בן לילה. למחרת, לנקות את הדגימות עם ערכת ניקוי DNA. הספריות המתקבלות מוכנות לבקרת איכות וכמות ברגישות גבוהה, אלקטרופורזה על שבב DNA, ולאחר מכן לריצוף הדור הבא.
ספריות cDNA וכתוצאה מכך להציג כמות ואיכות מתאימים הנדרשים עבור רצף הדור הבא, כפי שאומת על ידי רגישות גבוהה, DNA על שבב אלקטרופורזה. הרצועות והפסגות המייצגות את ספריות RIBO-seq צרות ומוגדרות טוב יותר, בהשוואה לספריות RNA-seq. על פי האלקטרופורזה על השבב, לספריות יש את העדשה הצפויה.
הפסגות הנוספות הקרובות יותר ל-200 זוגות בסיסים הנמצאים בספריות RIBO-seq עשויות להצביע על ריבוזומים של שנת חורף, לא על עקבות ריבוזומליות מתעכלות לחלוטין, או על ממצאים, לדוגמה, rRNA, וניתן למחוק אותם במהלך ניתוח ביואינפורמטי כאשר הנתונים המתקבלים מריסוק נחתכים ו- rRNA מסונן. הכמות הממוצעת של cDNA שנוצר בהכנת הספרייה היא 32 ננוגרם, מתן כמות מספקת של חומר הנדרש עבור רצף הדור הבא. לאחר בקרת איכות על ידי אלקטרופורזה על השבב, ספריות נמשכו לריצוף יחיד ו -50 זוגות בסיסים בפלטפורמת NextSeq 500 של אילומינה.
קיצוץ המתאמים ורצפים באיכות ירודה הביא 25 עד 47 מיליון קריאות לכל מדגם עבור דגימות RNA-seq, ו 25 עד 50 מיליון קריאות לכל מדגם עבור דגימות RIBO-seq. הנתונים שהושגו היו בקרת איכות נבדקה עם FastQC. שתי דגימות RNA-seq ו RIBO-seq הציגו איכות טובה מאוד.
מיפוי הספריות שהוכנו על פי הפרוטוקול המתואר הניב 2.4 עד 9.6 מיליון קריאות ממופה באופן ייחודי לכל מדגם לדגימות RNA-seq, ו-2.3 עד 10.4 מיליון קריאות ממופה באופן ייחודי עבור דגימות RIBO-seq. נתוני RIBO-seq מציגים מחזוריות משולשת ופסגה גבוהה וצרה, המתאימה לריבוזומים היוזמים ומאפיינים את עקבות הריבוזומה, שאינה נצפית בנתוני ה- RNA-seq. יתר על כן, העלילה המציגה את הפרופילים של כיסוי ממוצע של עקבות ריבוזומליות ושברי mRNA ברצפי הקידוד חושפת את השיעור הגבוה יותר של קריאות הממופות לתקליטורים בערכת הנתונים RIBO-seq, כצפוי.
ההדמיה של עקבות הריבוזומליות הממופות הראתה דפוסים דומים מאוד בהשוואה לתוצאות שהתקבלו מאותו ניסוי שבוצע בהתאם להליך RIBO-seq הסטנדרטי, הכולל התאוששות מונוזום על ידי שיפוע סוכרוז אולטרה-צנטריפוגציה. הפרוטוקול שלנו שימש לבדיקת ויסות תרגום בתנאי צמיחה שונים, אך ניתן ליישמו כדי ללמוד היבטים אחרים של תרגום, כמו זיהוי אתרי ייזום תרגום וגנים חדשניים של קידוד חלבונים. רצף הספריות שהוכנו על פי ההנחיות שלנו מביא לנתונים מספיקים לניתוח ביואינפורמטי מקיף.
הפרוטוקול שאנו מציגים כאן הוא מהיר, קל וחסכוני, וניתן לבצעו באמצעות ציוד מעבדה סטנדרטי.
