הכנת מדגם סטנדרטית מקשה על השגת אות לרעש טוב במהלך ניסויי עקיפה של מיקרו-קריסטלים. פרוטוקול זה נועד להפחית את מקורות הגבישים שנוצרו ברקע באופן מבוקר. השימוש ברובוטיקה הקפאת אגרוף ורשתות cryoTEM מספק פלטפורמה חזקה למניפולציה של microcrystals שוב ושוב, הפחתת נפח הנוזל שמסביב ומתן vitrification מהיר של המדגם.
המיומנות הדרושה לטיפול ברשתות דומה לזו הדרושה לקצירת קריסטלים מסורתית. גורם חשוב נוסף הוא קביעת הפרמטרים הראשוניים של סופגות באמצעות פתרון התגבשות, שהוא המפתח להפחתת השימוש במדגם. כדי להתחיל, להגדיר ולקרר את מקפיא הצלילה האוטומטי על פי הוראות היצרן.
רגע לפני השימוש, זוהר לפרוק את רשתות cryoTEM במשך 25 שניות עם זרם 15 מיליאמפר ולחץ 0.39 מיליבר, ולאחר מכן לשמור על רשתות הפרשה זוהר בצלחת פטרי מכוסה. הגדר את הלחות היחסית של תא המדגם ל -90% ואת זמן הכתם לחמש שניות. ודא כי מקפיא הצלילה מוגדר לצלול באופן אוטומטי את המדגם לאחר סופג הושלמה.
פתח את חותם ההתגבשות היטב ואת המאגר. הוסף במהירות שניים עד חמישה מיקרוליטרים של פתרון המאגר בטיפת הגביש כדי לשמור על נפח הטיפה. העבר 10 מיקרוליטרים של פתרון המאגר לצינור 0.5 מיליליטר לשימוש מאוחר יותר ולאחם מחדש את הבאר כדי למנוע את טיפת ההתגבשות מהייבוש.
השתמש במלקחיים הקפואים לצלול כדי לבחור רשת פריקה זוהרת אחת ולהעמיס את הרשת במכשיר כשצד הפחמן פונה הרחק מזרוע הכתם. סובבו את המלקחיים המחזיקים ברשת כך שצד הפחמן יעמוד מול הזרוע הנפוחה. השתמש בצינור מיקרוליט 2.5 כדי להחיל שני מיקרוליטרים של פתרון המאגר על הצד שאינו תומך של רשת cryoTEM.
סובב את הרשת כשצד הפחמן פונה הרחק מזרוע הכתם והחיל בזהירות את נוזל המאגר על צד התמיכה בסרט הפחמן של הרשת. ליזום את תהליך הכתם ולהתבונן בנוזל שנמשך מפני השטח של הפחמן עד שגל הקפיצה על פני השטח של הרשת נראה. אם גל הקפיצה אינו נראה לעין, הגדל את זמן ההכתמה בשניה עד שתי שניות לפני שזרוע הכתם נסוגה מהרשת.
מניחים את לוח ההתגבשות מתחת למיקרוסקופ האור וממקם היטב את המטרה בתוך שדה הראייה. מניחים רשת פריקה זוהרת טרייה במקפיא הצלילה ומחילים את נוזל המאגר על הצד הלא תומך של הרשת כפי שהודגם בעבר. סובב את הרשת כשצד התמיכה בסרט הפחמן פונה ליציאת הדגימה של מקפיא הצלילה.
מקלפים את החותם הזמני מצלחת ההתגבשות ומשתמשים בפיפטה שנקבעה בשני מיקרוליטרים כדי לשאוף בעדינות את טיפת ההתגבשות שוב ושוב. מעבירים שני מיקרוליטרים של תרחיף המיקרו-קריסטל השאיפה למקפיא הצלילה ומחילים את כל הדגימה על צד הפחמן של רשת cryoTEM. ליזום את סופג ולהתבונן על גל של צץ, ואז מיד ליזום את הקפאת הצלילה.
מעבירים במהירות את הרשת מהאיתאן הנוזלי לתיבת הרשת השקועה בחנקן נוזלי. לאחר סופג וצלילה הקפאת הרשת, לסגת הרשת צלל מן האתאן הנוזלי על ידי איפוס מקפיא הצלילה. הסר את המלקחיים המחזיקים את הרשת מהמקפיא לצלול ומניחים את הרשת מתחת למיקרוסקופ האור.
התאם את המיקוד העדין והערך את צפיפות הגבישים על פני הרשת. לאחר טעינת רשת cryoTEM ב- SEM, יישר את המדגם והדליק את קרן האלקטרונים. בתחילה להעריך את הרשת כולה בהגדלה 45X ולתעד את התמונה, ולאחר מכן להגדיל את ההגדלה לבדיקה מדוקדקת יותר של ריבועי רשת בודדים עד גבישים בודדים נצפים בבירור.
נוע סביב הרשת ולצלם את תמונות הסטילס, מה שמבטיח שהרשתות שטוחות וסרט התמיכה בפחמן יהיה שלם ברובו. ודא כי ישנם גבישים בודדים רבים עם הילה צרה של נוזל מנווט סביב הגביש ואת החורים נראים בסרט תמיכה בפחמן. תוך התבוננות ולכידת התמונות של הרשת, ודא שהאזורים הגדולים של הנוזל המשובץ נעדרים, קרח משושה או קרח על פני השטח אינם מפוזרים על פני הרשת, וכי הגבישים אינם חופפים ומופצים באופן שווה על פני סרט התמיכה.
ב dewar קצף גדול, לקרר את המספר הנדרש של מחזיקי מדגם VMXm טעון במחסנית המדגם. הוסף חנקן נוזלי מעל מיקום המדגם במטען המדגם. העבר במהירות את תיבת הרשת המכילה רשתות טעונות מיקרו-קריסטליות לתקופת הרשת ההפסקה במטען הדגימה ושחרר מעט את המכסה כדי לשמור על המכסה רופף וניתן לסיבוב.
הרם את הרשת מתיבת הרשת וסובב את הרשת כדי להניח את הרשת שטוחה על מחזיק המדגם. הנח במהירות את כלי הצירליפ מקורר מראש על הרשת בפתיחת הרשת ולחץ על הכפתור כדי להתקין את הצירק. מוסיפים חנקן נוזלי כ-1.5 ס"מ מעל מחזיק המדגם.
השתמש במלקחיים מדגם VMXm כדי להרים בזהירות את מחזיק הדגימה הטעון ולהחזיר אותו למחסנית הדגימה. החלף את המכסה על המחסנית, והבטח שהסיכה בחלק העליון של המחסנית עוסקת בחור במכסה. מיקרוגרפים אלקטרונים סריקה של microcrystals מוכן על רשתות cryoTEM הראה פיזור רקע מינימלי.
הרשת הייתה נקייה מעודף נוזלים והילה צרה של נוזל נצפתה מקיפה את הגבישים. הגבישים הפוליהדרליים נצפו בנפרד, כמו גם בגושים. גבישי אינסולין מעט גדולים יותר הראו גם כמה גושים יחד עם גבישים מבודדים.
מיקרוקריסטלים גדולים מאוד הוצבו בהצלחה גם על רשתות cryoTEM. החורים בסרט התמיכה בפחמן נראו בבירור, מה שמצביע על סופג חזק. דגימות רבות דרשו אופטימיזציה נוספת בגלל וריאציה בזמן הכתם וריכוז של microcrystals.
הרשתות העמוסות בגבישים מפחיתות את יעילות הכתמים וסבים מרובים נרשמו בתמונת עקיפה אחת. זמן קצר של התגבשות צמיגה לפתרונות התגבשות צמיגים עלול לגרום לדגימה רטובה מדי. עבור פתרון התגבשות צמיגות נמוך יותר, זמן קצר של גניבה של microcrystals בצד אחד של הרשתות.
הכנת מדגם אופטימלית מאפשרת לנצל את היכולות המלאות של VMXm כדי לאסוף נתוני עקיפה באיכות גבוהה של קרני רנטגן ברזולוציה הגבוהה ביותר האפשרית עם יחס אות לרעש גבוה. קביעת סופגות ראשוניות של פתרון התגבשות היא המפתח לשימוש במדגם מינימלי. אם המדגם מוגבל מאוד, דלג על הערכת הצפיפות.
בסופו של דבר, עדיף שתהיה דגימה מדוללת. דגימות אלה מוכנות כעת לניסויי עקיפה של קרני רנטגן בקו הקרן VMXm, עקיפה של אלקטרונים מיקרוקריסטליים, או כרסום קרן יונים ממוקד לפני מיקרו אד.
