פרוטוקול זה מביא למיצוי כרומטין אמין וניתן לשחזור מדגימות כבד קפואות לצורך ניסויים במשקעים חיסוניים של כרומטין. כדי להתחיל, מניחים את הצינור המכיל את הרקמה הקפואה במכתש, ולתת לו לשבת שם במשך חמש דקות. לאחר מכן יש להפעיל לחץ על הדגימה באמצעות פסטל מקורר מראש עד שלא יהיו יותר פירורים מוצקים.
הסר את הצינור המכיל את הדגימה מהטיט. מוסיפים 950 מיקרוליטר של PBS קר כקרח עם המעכבים הנדרשים, ופיפטה למעלה ולמטה בעדינות עד שהדגימה מושהית לחלוטין. מיד להעביר את השעיה רקמות הומוגנייזר, ולהחיל 20 עד 30 שבץ עם Pestle A כדי להשיג השעיה עדינה יותר.
הימנעו מהזזת המזיק אל מחוץ לשלב הנוזלי כדי למנוע הקצפה. מעבירים את ההומוגנט לצינור חדש של 1.5 מיליליטר שצונן בעבר על קרח. ואז צנטריפוגה את הצינור במשך חמש דקות ב 1, 300 G וארבע מעלות צלזיוס.
בזהירות להסיר את supernatant ולהשהות מחדש את הגלולה לחלוטין ב 950 מיקרוליטר של PBS בטמפרטורת החדר על ידי pipetting עדין. לאחר מכן להוסיף 63.6 מיקרוליטר של פורמלדהיד 16% ללא מתנול כדי לקבל ריכוז סופי של 1%סובב מיד את הצינור במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הסיבוב, מוסיפים 113 מיקרוליטר של גליצין מולארי 1.25 בטמפרטורת החדר כדי לקבל ריכוז סופי של 125 מילימולרי, ומסובבים את הצינור במשך חמש דקות נוספות.
ואז צנטריפוגה את הדגימה ב 1, 300 G במשך שלוש דקות בארבע מעלות צלזיוס. יש להשליך את הסופרנטנט, ולהשהות מחדש את הגלולה בזהירות על ידי החדרת 950 מיקרוליטר של PBS קר כקרח עם המעכבים הדרושים. צנטריפוגו את הדגימה שוב והשהו מחדש את הגלולה כפי שהודגם קודם לכן.
חזור על שלב הצנטריפוגה פעם נוספת ומיד המשך להליך בידוד הכרומטין. מוסיפים 950 מיקרוליטר של Buffer A עם המעכבים הדרושים לגלולה ומערבבים בעדינות על ידי פיפטינג עד שהגלולה מושהית לחלוטין. לאחר מכן סובב את הצינור במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס.
לאחר סיבוב, צנטריפוגה את הדגימה ב 2, 000 G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס בזהירות להסיר את supernatant. מוסיפים 950 מיקרוליטר של Buffer B עם המעכבים הנדרשים לגלולה ומערבבים בעדינות על ידי פיפטינג עד שהגלולה מושהית לחלוטין. לאחר מכן סובב את הצינור במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס.
לאחר הסיבוב, צנטריפוגו שוב את הדגימה. הסר את supernatant. לאחר מכן להוסיף 300 מיקרוליטר של טמפרטורת החדר Buffer C עם המעכבים הדרושים לגלולה פיפטה במרץ.
מערבלים את הדגימה למשך 15 עד 30 שניות. לאחר מכן סובב את הצינור לזמן קצר כדי לאסוף את הטיפות על המכסה. לאחר ניקוי דגימת הכרומטין, יש להוסיף 30 מיקרוליטר של תמיסת טריטון X-100 10% ומערבולת למשך חמש עד 10 שניות.
צנטריפוגה הדגימה ב 16, 000 G במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס. ומעבירים את הסופרנאטנט לצינור נקי של 1.5 מיליליטר מקורר מראש על קרח. מעבירים 10 עד 25 מיקרוליטר של כרומטין גזוז לצינור חדש, ומוסיפים חיץ C כדי להגיע לנפח סופי של 200 מיקרוליטר.
Aliquot והלם להקפיא את שאר הכרומטין במינוס 80 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף. מוסיפים שמונה מיקרוליטרים של חמישה נתרן כלורי מולארי ודגרים לפחות שש שעות ב 65 מעלות צלזיוס בבלוק החימום תוך כדי רעידה ב -1, 000 סל"ד. האריכו את הדגירה למשך הלילה במידת האפשר.
לאחר מתן הדגימות להתקרר בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות, להוסיף שני מיקרוליטר של RNase A ולדגור במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס תוך כדי רעד ב 1, 000 סל"ד. הסר את הדגימות מבלוק החימום והוסף שבעה מיקרוליטרים של 300 מילימולר סידן כלורי ושני מיקרוליטרים של פרוטאינאז K.לדגור על הדגימות בבלוק החימום ב 56 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות תוך כדי טלטול ב 1, 000 סל"ד. בינתיים, להכין צינור הפרדה פאזי אחד עבור כל דגימה על ידי צנטריפוגה אותם עד 16, 000 G במשך דקה אחת בארבע מעלות צלזיוס.
לאחר הסרת הצינורות מבלוק החימום ולתת להם להתאזן בטמפרטורת החדר למשך שלוש דקות, מעבירים 400 מיקרוליטר מהדגימה לצינור הפרדת הפאזה הצנטריפוגי הקודם. לאחר מכן, להוסיף 400 מיקרוליטר של פנול כלורופורם איזואמיל אלכוהול פתרון, מערבולת במשך חמש שניות. צנטריפוגה הצינור ב 16, 000 G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.
לאחר מכן להוסיף 400 מיקרוליטר של כלורופורם ומערבולת במשך חמש שניות. צנטריפוגו את הצינור למשך חמש דקות נוספות והעבירו 400 מיקרוליטר מהשלב העליון לצינור חדש של 1.5 מיליליטר המכיל 24 מיקרוליטר של חמישה נתרן כלורי מולארי ו-0.75 מיקרוליטר גליקוגן. לאחר מכן מערבלים בקצרה את הצינור.
הוסף 1, 055 מיקרוליטר של 100% אתנול. לאחר מכן מערבלים ביסודיות ודגרים על הדגימה במינוס 80 מעלות צלזיוס למשך שעה או במינוס 20 מעלות צלזיוס למשך הלילה. לאחר השלמת הדגירה, צנטריפוגה את הדגימה ב 16, 000 G במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס בזהירות להסיר את supernatant מבלי לנקוע את הכדור.
הוסיפו 500 מיקרוליטר אתנול קר 70% והטו את הצינור בעדינות כדי להבטיח שהגלולה נשטפת. צנטריפוגה הצינור ב 16, 000 G במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס. מוציאים בזהירות את כל הסופרנאטנט ונותנים לגלולה להתייבש בטמפרטורת החדר.
לחלופין, יש לדגור על הצינור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס לייבוש מהיר יותר. הוסיפו 50 מיקרוליטר של תמיסת Tris-EDTA והניחו את הצינור על בלוק החימום למשך חמש עד 10 דקות תחת רעידות ב-300 סל"ד. לאחר מכן לנתח את ה- DNA על ג'ל agarose 1%.
לאחר הצלבת קישור של כרומטין והדמיה של ה- DNA על ג'ל אגרוז, ניתן לזהות גזירה מוצלחת על ידי נוכחות של שברים בטווח של 100 עד 300 זוגות בסיס. הכרומטין הואץ בהצלחה עם טרימתילציה H3K4, אצטילציה H3K27 ונוגדנים לטרימתילציה H3 K27 ונותח עוד יותר על ידי qPCR. כרומוזום אחד מסגרת קריאה פתוחה 43, פרוטאזום 20S תת-יחידה בטא שתיים, ואזורי מקדם גליצראלדהיד-3-פוספט דהידרוגנאז המשועתקים באופן פעיל בכבד הראו העשרה לטרימתילציה H3K4 ואצטילציה H3K27.
לשם השוואה, הומיאובוקס C13, הומיאובוקס C12 וגורם שעתוק המיאלין בעכבר אחד מקדמים אזורים מושתקים בכבד לא הועשרו כמצופה. טרימתילציה H3 K27 מראה התנהגות הפוכה, ובכך מאשרת את ההצלחה של המשקעים החיסוניים של הכרומטין או בדיקת ChIP. הכרומטין היה נתון בהצלחה ChIP-Seq.
לאחר הריצוף, הקנים יושרו לאינדקס שהוכן מראש והופרדו לפי מינים. טרימתילציה H3K4 ושקיעת אצטילציה H3K27 באתרי התחלה של שעתוק גנים אנטגוניזם עם שקיעת טרימתילציה H3K27 כצפוי. צביר Hox C ידוע בכך שאינו פעיל הן בכבד עכברי והן בכבד אנושי.
הפרופיל של טרימתילציה H3K4 ואצטילציה H3K27 מראה שיאים עבור שני שינויים אלה שלאחר התרגום מחוץ לצביר, בעוד שעוצמת האות של טרימתילציה H3K27 נוטה לעלות בתוך אשכול הגנים. מיצוי כרומטין מדגימות רקמה קפואה הוא בעל שונות פנימית גבוהה, תלוי מאוד בעדינות תרחיף התא ובטמפרטורה במהלך קישור צולב. הבטחת תנאי מעבדה קבועים מסייעת בשמירה על יכולת השחזור של טווח גודל המקטעים.
