ينتج عن هذا البروتوكول استخراج كروماتين قابل للتكرار وموثوق به من عينات الكبد المجمدة لتجارب الترسيب المناعي للكروماتين. للبدء ، ضع الأنبوب الذي يحتوي على الأنسجة المجمدة في الهاون ، واتركه هناك لمدة خمس دقائق. ثم اضغط على العينة باستخدام مدقة مبردة مسبقا حتى لا يكون هناك المزيد من الفتات الصلبة.
قم بإزالة الأنبوب الذي يحتوي على العينة من الهاون. أضف 950 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني بارد مع المثبطات المطلوبة ، وماصة لأعلى ولأسفل برفق حتى يتم إعادة العينة بالكامل. انقل تعليق الأنسجة على الفور إلى الخالط ، وقم بتطبيق 20 إلى 30 ضربة باستخدام Pestle A للحصول على تعليق أدق.
تجنب تحريك المدقة خارج الطور السائل لمنع الرغوة. انقل التجانس إلى أنبوب جديد سعة 1.5 ملليلتر تم تبريده مسبقا على الجليد. ثم الطرد المركزي الأنبوب لمدة خمس دقائق عند 1،300 غرام وأربع درجات مئوية.
قم بإزالة المادة الطافية بعناية وأعد تعليق الحبيبات تماما في 950 ميكرولتر من درجة حرارة الغرفة PBS عن طريق السحب اللطيف. ثم أضف 63.6 ميكرولتر من الفورمالديهايد الخالي من الميثانول بنسبة 16٪ للحصول على تركيز نهائي قدره 1٪قم بتدوير الأنبوب على الفور لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد الدوران ، أضف 113 ميكرولترا من 1.25 مولار جليكاين في درجة حرارة الغرفة للحصول على تركيز نهائي 125 مللي مولار ، وقم بتدوير الأنبوب لمدة خمس دقائق أخرى.
ثم طرد مركزي العينة عند 1،300 جم لمدة ثلاث دقائق عند أربع درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات بعناية عن طريق سحب 950 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني بارد مع المثبطات المطلوبة. قم بطرد العينة مرة أخرى وأعد تعليق الحبيبات كما هو موضح سابقا.
كرر خطوة الطرد المركزي مرة أخرى وانتقل فورا إلى إجراء عزل الكروماتين. أضف 950 ميكرولتر من Buffer A مع المثبطات المطلوبة إلى الحبيبات واخلطها برفق عن طريق السحب حتى يتم إعادة استخدام الحبيبات تماما. ثم قم بتدوير الأنبوب لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية.
بعد الدوران ، قم بطرد العينة عند 2،000 جم لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية وقم بإزالة المادة الطافية بعناية. أضف 950 ميكرولترا من Buffer B مع المثبطات المطلوبة إلى الحبيبات واخلطها برفق عن طريق السحب حتى يتم إعادة تنشيط الحبيبات تماما. ثم قم بتدوير الأنبوب لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية.
بعد الدوران ، أجهزة الطرد المركزي العينة مرة أخرى. إزالة الطاف. ثم أضف 300 ميكرولتر من درجة حرارة الغرفة Buffer C مع المثبطات المطلوبة إلى الحبيبات والماصة بقوة.
دوامة العينة لمدة 15 إلى 30 ثانية. ثم قم بتدوير الأنبوب لفترة وجيزة لجمع القطرات على الغطاء. بعد صوتنة عينة الكروماتين ، أضف 30 ميكرولترا من محلول Triton X-100 بنسبة 10٪ والدوامة لمدة خمس إلى 10 ثوان.
أجهزة الطرد المركزي العينة في 16،000 غرام لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية. وانقل المادة الطافية إلى أنبوب نظيف سعة 1.5 ملليلتر مبرد مسبقا على الجليد. انقل 10 إلى 25 ميكرولترا من الكروماتين المنفصم إلى أنبوب جديد ، وأضف Buffer C للوصول إلى حجم نهائي يبلغ 200 ميكرولتر.
تجمد القسمة والصدمة بقية الكروماتين عند 80 درجة مئوية تحت الصفر حتى الاستخدام مرة أخرى. أضف ثمانية ميكرولترات من خمسة مولار كلوريد الصوديوم واحتضانها لمدة ست ساعات على الأقل عند 65 درجة مئوية في كتلة التسخين أثناء الاهتزاز عند 1،000 دورة في الدقيقة. تمديد الحضانة بين عشية وضحاها إن أمكن.
بعد ترك العينات تبرد في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق ، أضف ميكرولتر من RNase A واحتضانها لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية أثناء الرج عند 1000 دورة في الدقيقة. قم بإزالة العينات من كتلة التسخين وأضف سبعة ميكرولترات من 300 مليمول كلوريد الكالسيوم واثنين ميكرولتر من البروتيناز K.احتضان العينات في كتلة التسخين عند 56 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة أثناء الاهتزاز عند 1000 دورة في الدقيقة. وفي الوقت نفسه ، قم بإعداد أنبوب فصل أحادي الطور لكل عينة عن طريق الطرد المركزي لها إلى 16،000 جم لمدة دقيقة واحدة عند أربع درجات مئوية.
بعد إزالة الأنابيب من كتلة التسخين والسماح لها بالتوازن في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث دقائق ، انقل 400 ميكرولتر من العينة إلى أنبوب فصل الطور الذي تم طرده مسبقا. بعد ذلك ، أضف 400 ميكرولتر من محلول كحول أيزو أميل الفينول كلوروفورم ، ودوامة لمدة خمس ثوان. جهاز طرد مركزي الأنبوب عند 16،000 غرام لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية.
ثم أضف 400 ميكرولتر من الكلوروفورم والدوامة لمدة خمس ثوان. طرد مركزي الأنبوب لمدة خمس دقائق أخرى ونقل 400 ميكرولتر من المرحلة العليا إلى أنبوب جديد 1.5 ملليلتر يحتوي على 24 ميكرولتر من خمسة مولار كلوريد الصوديوم و 0.75 ميكرولتر جليكوجين. ثم لفترة وجيزة دوامة الأنبوب.
أضف 1،055 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 100٪. ثم دوامة جيدا واحتضان العينة عند 80 درجة مئوية تحت الصفر لمدة ساعة واحدة أو عند 20 درجة مئوية تحت الصفر طوال الليل. بعد اكتمال الحضانة ، قم بطرد العينة عند 16،000 جم لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية وقم بإزالة المادة الطافية بعناية دون خلع الحبيبات.
أضف 500 ميكرولتر من الإيثانول البارد 70٪ وقم بإمالة الأنبوب برفق لضمان غسل الحبيبات. جهاز طرد مركزي الأنبوب عند 16،000 غرام لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية. قم بإزالة المادة الطافية بالكامل بعناية واترك الحبيبات تجف في درجة حرارة الغرفة.
بدلا من ذلك ، احتضن الأنبوب عند 37 درجة مئوية لتجفيف أسرع. أضف 50 ميكرولترا من محلول Tris-EDTA وضع الأنبوب على كتلة التسخين لمدة خمس إلى 10 دقائق تحت الاهتزاز عند 300 دورة في الدقيقة. ثم تحليل الحمض النووي على هلام 1 ٪ أغاروز.
بعد الربط المتقاطع للكروماتين وتصور الحمض النووي على هلام الأغاروز ، يمكن التعرف على القص الناجح من خلال وجود شظايا في حدود 100 إلى 300 زوج أساسي. تم ترسيب الكروماتين بنجاح باستخدام ثلاثي ميثيل H3K4 ، وأستلة H3K27 ، والأجسام المضادة ثلاثية الميثيل H3 K27 وتم تحليلها بشكل أكبر بواسطة qPCR. أظهر إطار القراءة المفتوح للكروموسوم الأول 43 ، والوحدة الفرعية للبروتيازوم 20S بيتا اثنين ، ومناطق تعزيز نازعة هيدروجين الجلسرين - 3 فوسفات التي يتم نسخها بنشاط في الكبد إثراء لثلاثي ميثيل H3K4 وأستلة H3K27.
وبالمقارنة ، لم يتم إثراء Homeobox C13 و homeobox C12 ومناطق محفز عامل نسخ المايلين الأول للفأر التي يتم إسكاتها في الكبد كما هو متوقع. يظهر ثلاثي الميثيل H3 K27 السلوك المعاكس ، مما يؤكد نجاح الترسيب المناعي للكروماتين أو مقايسة ChIP. تم إخضاع الكروماتين بنجاح ل ChIP-Seq.
بعد التسلسل ، تمت محاذاة القصب إلى فهرس معد مسبقا وفصلها وفقا للأنواع. ترسيب ثلاثي الميثيل H3K4 وترسب أستلة H3K27 في مواقع بدء النسخ الجيني معادية مع ترسب ثلاثي الميثيل H3K27 كما هو متوقع. من المعروف أن مجموعة Hox C غير نشطة نسخيا في كل من كبد الفئران والبشر.
يظهر تنميط ثلاثي ميثيل H3K4 وأستلة H3K27 قمم لهذين التعديلين بعد الترجمة خارج المجموعة ، بينما تميل شدة إشارة ثلاثي ميثيل H3K27 إلى الزيادة داخل مجموعة الجينات. يتميز استخراج الكروماتين من عينات الأنسجة المجمدة بتنوع جوهري عال ، ويعتمد بشدة على دقة تعليق الخلية ودرجة الحرارة أثناء الربط المتقاطع. يساعد ضمان ظروف المختبر الثابتة في الحفاظ على قابلية استنساخ نطاق حجم الشظية.
