שיטה זו מנצלת את הדרך השונה להתמודד עם אתגרי ביטוי החלבון הנגיפי הרקומביננטי באמצעות חלבון ויראלי אחד P'as chaperone עבור חלבון ויראלי אחר N'כדי להשיג חלבוני N ללא RNA. חלבון RSV N ללא RNA מתקבל לפני הרכבת ה- RNA הספציפי לנגיף לגרעין במבחנה. השיטה יכולה לשמש גם עם וירוסי RNA אחרים שאינם מפולחים תחושה שלילית.
שיטת השיבוט הבלתי תלויה של הקשירה היא טכניקה מהירה לרכישת מבני ביטוי משותף. למה או electives מיקרוסקופ אלקטרונים כתם היא שיטה מהירה לבדיקת הרכבה גדולה בתא גלם. אנחנו רוצים לתת לך שני טיפים.
ראשית, קבל תשואה גבוהה ותוצאות מוצקות עבור כל שלב לפני שתעבור לשלב הבא. שנית, להגדיר תוכניות מתאימות כרומטוגרפיה ולתרגל להרים רשתות עם מלקחיים. לבנייה דו-סיסטרונית של הביטוי המשותף N ו- P, לגדל ארבע תרביות ליטר אחד של E coli BL21DE3 תאי זן במדיום LB ב 37 מעלות צלזיוס.
כאשר הצפיפות האופטית ב 600 ננומטר מגיע 0.6, להוריד את הטמפרטורה ל 16 מעלות צלזיוס. לאחר שעה אחת, לגרום ביטוי חלבון על ידי טיפול עם 0.5 מילימולאר IPTG לילה. למחרת בבוקר, לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה ו resuspend כדורי ב 200 מיליליטר של מאגר תמוגה.
lyse התאים על ידי sonication במשך 15 דקות, עם שלוש שניות על, שלוש שניות את הפעימות. ולאסוף את lysates על ידי צנטריפוגה. לטעון את supernatant לתוך 2.5 על ידי 10 ס"מ קובלט עמוד הכבידה, עם כ 10 מיליליטר של חרוזים.
שווה ערך מראש עם 5 עד 10 עמודות של מאגר תמוגה. ולשטוף את העמודה עם חמישה כרכים עמודות של חוצץ B וחמישה כרכים של חוצץ C.Use שני כרכים של חיץ D כדי elute החלבון מן החרוזים. ולהשוות את עמודת Q עם חמישה כרכים מיליליטר אחד של מאגר QA.
השתמש במשאבה פריסטלית כדי לטעון את המדגם המדולל על העמודה. הפשר את עמודת ה- Q שנטענה למכונת HPLC, יחד עם מאגרי QA ו- QB טריים. הפעל את שטיפת המשאבה כדי לשטוף בהצלחה את המכונה עם נפח אחד עד שני כרכים של מאגרי QB ו- QA.
לאחר הכביסה האחרונה, להגדיר את קצב הזרימה מיליליטר אחד לדקה, ולהגדיר UV1 כדי 280 ננומטר ו UV2 כדי 260 ננומטר, באמצעות צלחת באר עמוקה 96 כדי לאסוף את השברים. לאחר מכן השתמש ביישום הדרגתי צעד של שלושה עד ארבעה כרכים של כל ריכוז של סוכן elution כדי elute את החלבונים, החל ריכוז 0%QB ולהגדיל את האחוז על ידי 5%בכל פעם. קומפלקס החלבון N-0 P יהיה elute בריכוז חיץ 15%QB.
לבודד את החלבון על ידי סינון ג'ל, בעמודת טיהור בקנה מידה קטן של 30 ס"מ, שווה עם חיץ E.Then לנתח את החלבון המכיל שברים על ידי דף SDS. עבור הרכבה nucleocapsid ספציפי וירוס, לערבב ולהדגיר את קומפלקס N-0 P מטוהר עם אוליגו RNA ביחס מולקולרי 1:1.5 בטמפרטורת החדר במשך שעה אחת. מראש לשוויון עמודת סינון ג'ל טיהור בקנה מידה קטן עם חיץ E.ולהסיר כל משקעים על ידי צנטריפוגה.
טען את העל-טבעי, לעמודת הכרומטוגרפיה של אי-הכללת הגודל. ולהשוות את תמונות הכרומטוגרפיה של הדרת הגודל של החלבון להרכבת RNA, ודגימות בקרה של חלבונים בלבד, המשלבות את יחסי טוהר חומצת הגרעין, כדי לזהות אילו פסגות הן N RNA, N-0 P ו- RNA חינם. כדי להרכיב קומפלקס N RNA, לאסוף את כל שברי השיא N RNA, לבצע מיצוי RNA, ולהפעיל ג'ל דף אוריאה כדי לבדוק שוב את אורך RNA הספציפי.
כדי להכין רשת כתמים שלילית עבור מיקרוסקופ אלקטרונים כתם שלילי, השתמש בצלחת חום כדי לחמם 5 מ"ל של מים מזוקקים כפולים לרתיחה ולהוסיף 37.5 מיליגרם של אורניל formate למים כדי להשיג 0.75% אורניל תמיסת הכתמת אסיר. מעבירים את הפתרון לכיסוי רדיד אלומיניום. ולהוסיף ארבעה מיקרוליטרים של 10 נתרן הידרוקסידי טוחן.
לאחר 15 דקות של ערבוב מוגן מפני אור, לסנן את הפתרון באמצעות מסנן 0.22 מיקרון לתוך מבחנה. כדי להפוך את רשתות מיקרוסקופ אלקטרונים מצופות פחמן רציפות הידרופילית, למקם את הרשתות בתא מחובר לאספקת חשמל ולהחיל יונים טעונים שלילית על הרשתות. חותכים ומקפלים רצועת פארפילם בגודל 2 על 2 אינץ'.
מוסיפים שתי טיפות 40 מיקרוליטר של מים מזוקקים לקצה אחד של הרצועה. ושתי טיפות 40 מיקרוליטר של 0.75% אורניל לפתרון מכתים את הקצה השני. הוסף שלושה מיקרוליטרים של דגימת חלבון לכל רשת.
לאחר דקה אחת, לחסום את הרשתות נגד נייר סופג לטבול את הרשתות פעמיים טיפות מים מזוקקים. ופעם אחת בטיפת פתרון הכתמים הראשונה. ואז לטבול את הרשת טיפת פתרון הכתם השני במשך 30 שניות, לפני סופג את הרשתות נגד נייר סופג כדי להסיר כל פתרון כתם עודף ומאפשר לרשתות להתייבש באוויר לפני ההדמיה.
באמצעות פרוטוקול זה, בקנה מידה גדול מסיס הטרו דימרי וירוס סינקטיאל N0 P קומפלקס ניתן להשיג. ב- E coli, האורך המלא של חלקים N ו- N-מסוף של חלבוני P באים לידי ביטוי במשותף עם 10 X התג שלו על חלבון N. בהתבסס על יחס טוהר חומצת גרעין ספיגת UV, N0 P הכיל הן N באורך מלא N ו- N-מסוף P, אך לא הכיל RNA הסלולר.
N0 P מטוהר אז יכול להיות מגורה ומורכב לתוך nucleocapsid כמו חלקיקים על רשתות מיקרוסקופיה אלקטרונים באמצעות דגירה עם אוליגוס RNA ספציפי כפי שהוכח. בעת טיהור החלבון למנוע בועות אוויר במהלך טיהור העמודה לדלל את המדגם עם מאגר QA כדי להתאים את ה- pH ואת ריכוז המלח לפני טעינת המדגם על העמודה. יש להקפיד להחזיק את רשתות מיקרוסקופ אלקטרונים בקצה החיצוני, כדי למנוע זיהום הרשתות.
זה יעזור לנו לקבוע את שאלות אריזת הגנום RSV לא חיובי, אם זה שמאלי או מבנה סלילי ימני. בעקבות הליכים אלה ותבנית RNA אותנטית עבור בדיקת פעילות פולימראז RSV ניתן לבצע. וזה RSV ויראלי ספציפי nucleocapsid יכול לשמש לניתוח CRYO EM ברזולוציה גבוהה.
