יש צורך בשיטת תפוקה מדויקת וגוהה למדידת נוגדנים לנטרול RSV, כסמן חשוב להגנה מפני וירוס סינפטיאלי נשימתי. שיטה זו היא מאוד לשכפל עם וריאציות בין assay עבור antiserum התייחסות להיות פחות מ 10%אנו מאמינים כי בדיקה זו ניתן להקים בקלות במעבדות רבות ברחבי העולם בעלות נמוכה יחסית. אנו מתארים כאן בדיקה מבוססת מיקרו-נטרול הדמיה שנבדקה בקבוצת משנה A של RSV, וגם יכולה להיות מותאמת לקבוצת משנה B של RSV ולסוגי מדגמים שונים.
הדגמת ההליך תהיה ראובן Tse, חבר בצוות המחקר ב MCRI. כדי לזרוע צלחות ביום הראשון, הראשון resuspend A549 תאים במדיה DMEM, עם 10%FCS ו 1, 000 יחידות פניצילין-סטרפטומיצין תערובת בריכוז של 400, 000 תאים למיליליטר. ואז זרע 96 צלחות סטריליות שטוחות תחתית עם 40, 000 תאי A459 בצפיפות של 100 מיקרוליטרים ל באר.
דגירה הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס בסביבה 5%פחמן דו חמצני לילה. כדי להכין את דילול הסרום ביום השני, הפשרו תחילה את דגימות מבחן RSV וסרום אנושיות בטמפרטורת החדר. ואז למקם אותם באמבט מים ב 56 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות כדי לחמם ולהפעיל אותם.
לאחר מכן, להכין יותר מ 110 microliters של אחד עד 100 דילול של סרום הייחוס על ידי ערבוב 1.5 microliters של סרום התייחסות עם מדיה DMEM ללא FCS עם תערובת פניצילין-סטרפטומיצין לנפח סופי של 150 microliters. פיפטה 110 מיקרוליטרים של דילול זה לתוך גם A12 של צלחת סטרילית U-התחתון 96 היטב. כדי לבצע דילול טורי אחד עד שניים לאורך הצלחת, תחילה להוסיף 55 microliters של מדיה DMEM ללא FCS עם תערובת פניצילין-סטרפטומיצין ל בארות B12 כדי H12.
ואז עם העברת טיפ חדשה 55 microliters מגם A12 לגם B12. פיפטה למעלה ולמטה חמש פעמים כדי לערבב את הפתרון, ולהמשיך עד שתגיע גם H12. פיפטה את עודף 55 microliters של הפתרון מ גם H12.
לאחר מכן, הכינו דילול של 1 עד 100 דגימות לבדיקת סרום, והוסיפו 110 מיקרוליטרים של כל דילול ל הבאר המתאימה A1 עד A9 ו-E1 ל-E9 של הלוח הסטרילי של 96 הבאר. לאחר מכן הוסיפו 55 מיקרוליטרים של מדיית DMEM נטולת FCS עם תערובת פניצילין-סטרפטומיצין ל בארות בעמודות 1 עד 9. בצע דילול טורי של שורה א' לשורה D ומן שורה E לשורה H כמתואר לעיל.
הוסף 55 מיקרוליטרים של מדיית DMEM נטולת FCS עם תערובת פניצילין-סטרפטומיצין ל בארות בעמודות 10 ו- 11. כדי להכין את מלאי הנגיף, תחילה לשים בקבוקון קפוא של RSV באמבט מים 37 מעלות צלזיוס להפשיר אותו במהירות, ולאחר מכן למקם את הבקבוקון על קרח. לאחר מכן, להוסיף את הווירוס למדיה DMEM המכיל תערובת פניצילין-סטרפטומיצין בכ 200 PFU ל הבאר כדי להפוך נפח כולל של 55 מיליליטר עבור 100 בארות.
כדי להכין את תערובת סרום הנגיף, ראשית להוסיף 55 microliters של הנגיף מדולל לכל בארות של עמודות אחד עד תשע בארות של שורות E עד H של עמודות 10 ו 11. לאחר מכן הוסיפו 55 מיקרוליטרים של מדיית DMEM נטולת FCS עם תערובת פניצילין-סטרפטומיצין לכל בארות השורות A עד D של עמודים 10 ו-11, וגרפו את הצלחת ב-37 מעלות צלזיוס בסביבה של 5%פחמן דו-חמצני למשך שעה. לפני החיסון של תאי A549 עם RSV, בדוק את לוחית התא תחת מיקרוסקופ אור כדי לאשר כי מונואירים תא A549 הם 80%confluent.
לאחר מכן להפוך את הצלחת בעדינות כדי להשליך את המדיה, ולמחוק קלות את הצלחת על מגבת נייר סופג סטרילי. לאחר כל אחד מהם, יש לשטוף עם PBS סטרילי מסונן. לאחר מכן מוסיפים 100 מיקרוליטרים ל הבאר של תערובת סרום הנגיף ל הבאר המתאימה על צלחת התא A549 על פי תבנית הלוחית המסופקת בכתב היד, ו דגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% פחמן דו חמצני במשך שעה אחת.
בסוף הדגירה, השתמש בפיקטה כדי להסיר 90 מיקרוליטרים ל באר, ולהוסיף 100 מיקרוליטרים של המדיה המכילה 1XM199, 1.5%CMC ו- 2%FCS בתערובת פניצילין-סטרפטומיצין. דגירה הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% פחמן דו חמצני במשך שלושה ימים. כדי לתקן ולפתח לוחית מים, הפוך תחילה את לוח התאים A549 הנגוע ב- RSV בעדינות כדי להשליך את המדיה המכילה M199, CMC, 2% FCS ותערובת פניצילין-סטרפטומיצין.
לאחר מכן הוסיפו באיטיות 200 מיקרוליטרים של מאגר קיבעון לכל באר. דגירה הצלחת במינוס 20 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות. ואז להשליך את מאגר קיבעון בעדינות כתם על מגבת נייר סופג.
השאירו את הצלחת עם הפנים כלפי מטה לייבוש במשך 10 דקות. לאחר מכן, כאשר מאגר PBS מסונן מכיל 05 פוליסורבט 20, הפוך את פתרון חסימת החלב ל-5%. מוסיפים 200 מיקרוליטרים של פתרון החסימה לכל באר ומדרגים את הצלחת בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות.
בסוף הדגירה להפוך את הצלחת בעדינות כדי להשליך את הפתרון כתם על מגבת נייר סופג. כדי להפוך את הנוגדן העיקרי, לדלל נוגדן XRSV עז אחד עד 500 בתת פתרון החסימה. מוסיפים 50 מיקרוליטרים לכל באר ומדרגים את הצלחת ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעה.
לשטוף את הצלחת שלוש פעמים עם PBS-פוליסורבט מסונן. לאחר מכן, להפוך את הנוגדן המשני על ידי דילול אחד עד 5, 000 אלקסה פלואור חמור נגד עז אימונוגלובולין G בתתא החסימה. מוסיפים 50 מיקרוליטרים לכל באר ו דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת.
לשטוף את הצלחת חמש פעמים עם PBS-פוליסורבט מסונן. כדי לספור לוחות עם קורא כתמים אוטומטי, השתמש תחילה בלוחית תרבות של 96 בארות שאינן בשימוש כדי לשתף פעולה עם הכלי על-ידי הזנת הגדרות הספירה בערוץ FITC. ואז לקרוא את לוחית התא, לעטוף אותו בנייר כסף, ולאחסן אותו בארבע מעלות צלזיוס.
לאחר מכן, בדוק את התמונות של בארות עבור לוחות חפצים או monolayers תאים משובשים, ולא לכלול בארות עם monolayers תאים משובשים. המספר הממוצע של לוחות של בארות בקרת ללא סרום חושב והשתמשו בו כדי לקבוע את ניתוב הנטרול של 50% שיגרם לעיכוב של 50% בפעילות הנגיף. דילול הסרום ההדדי התווה על ציר ה- x ועל מספר הלוחות על ציר ה- y של גרף יומן רישום למחצה מ קו שצויר בין שתי הנקודות.
50% טיטרציה נטרול של דגימות סרום הבדיקה היו אדומים ודילול סרום עם ספירות מיד מעל או מתחת לערך 50% של בארות בקרת ללא סרום זוהו. RSVAPRN מוצג בשתי קבוצות מבוגרים שונות מגמביה ומתנדבים בריאים במלבורן גרמו למבוגרים הגמביים להיות בעלי TITRE NAB ממוצע נמוך יותר בהשוואה למבוגרים במלבורן. סרום התייחסות RSV האנושי המוצג מדגים שונות נמוכה מאוד עם מקדם וריאציה של 6.82%זה שיפור תפוקה גבוהה RSV פלאק הפחתת בדיקה ניתן ליישם בקלות במעבדות רבות, ויתמוך במאמץ ההרמוניזציה הבינלאומי של ארגון מי עבור RSV בנטרול בדיקות נוגדנים.
זה יהיה קריטי להערכת מועמדים חדשים לחיסון RSV בעתיד.
