Name: fecal (micro) rna isolation
Uploaded: 2020-10-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fecal micro RNA Isolation at JoVE.com

קיבלנו סיוע טכני ממתקן הביופולימרים בבית הספר לרפואה של הרווארד לביואנליזה. עבודה זו נתמכה על ידי מענק המחקר של האגודה הלאומית לטרשת נפוצה RG-1707-28516 (H.L.W. ו- S.L.).

כל השיטות המערבות חיות מחקר המתוארות כאן אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של בית החולים בריגהם אנד נשים, בית הספר לרפואה של הרווארד.
כל השיטות המערבות את נושאי המחקר בבני אדם המתוארות כאן הן בהתאם להנחיות שנקבעו על ידי ועדת המחקר האנושית של השותפים.
1. איסוף דגימות צואה
<ol><li>Autoclave או להכין צינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי ונטול נוקלאז 2 מ"ל עם מכסה בורג לכל נבדק בעל חיים בניסוי.<ol><li>עבור נבדקים אנושיים, ספק מכשיר איסוף דגימות צואה מתאים, ללא נוקלאז וסטרילי עבור כל נושא.</li>
	</ol></li>
	<li>לאסוף 25-100 מ"ג (כ 1-4 כדורי צואה עבור דגימות צואה עכבר) של דגימות צואה מכל נושא בעל חיים בסביבה סטרילית. הערה: שני כדורי צואה או יותר (~ 50 מ"ג או כבד יותר) מועדפים לקבלת RNA בטוהר הגבוה ביותר.<ol><li>השתמש בכל ציוד המגן האישי (PPE) והחומרים הדרושים, לדוגמה: זוג כפפות מעבדה, תרסיס חיטוי ומגבת נייר סטרילית, כדי לעקר את אזור העבודה, שבו מונח נושא המחקר בבעלי חיים, כדי למנוע זיהום דגימת צואה.<ol><li>עבור נבדקים אנושיים, הנחו כל נבדק/אספן מחקר לאסוף 100-200 מ"ג של דגימות צואה בסביבה סטרילית ככל האפשר. השתמש בפעולה סטרילית סטנדרטית והימנע מזיהום דגימת הצואה.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>אסוף דגימות צואה מכל נושא בעל חיים ישירות לתוך צינור microcentrifuge 2 מ"ל עם מכסה בורג מבלי לגעת במשטחים אחרים כדי למנוע זיהום.<ol><li>עבור נבדקים אנושיים, הנחו כל נבדק לעשות את צרכיו ישירות לתוך מכשיר איסוף ישים המסופק (למשל, ערכת איסוף דגימות צואה סטרילית) כדי למנוע זיהום. הערה: יש להנחות את הנושא להימנע מזיהום על ידי משטחי אסלה, מים, שתן או כל משטח/חפץ אחר שאינו סטרילי.</li>
	</ol></li>
	<li>הקפיאו דגימות צואה שנאספו בצינורות מיקרוצנטריפוגה של 2 מ"ל באופן מיידי בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס או הניחו בדלי של קרח יבש לקבלת הכמות והאיכות הטובות יותר של RNA לפני חידוש הצואה כמתואר בשלבים הבאים.<ol><li>עבור דגימות צואה אנושיות, aliquot כל דגימה טרייה של 200 מ"ג לתוך צינורות microcentrifuge 2 מ"ל עם כובעי בורג ולהקפיא אותם ב -80 מעלות צלזיוס לפני צואה resuspension כמתואר להלן.<ol><li>לאחסון דגימות צואה שאינן בצינורות מיקרוצנטריפוגה של 2 מ"ל עם מכסי בורג, שוקלים ומעבירים 100-200 מ"ג כל אחת מהדגימות הקפואות לצינורות מיקרוצנטריפוגה נפרדים של 2 מ"ל עם מכסי בורג לפני חידוש הצואה כמתואר להלן. הערה: עבור דגימות צואה אנושיות, הימנע מנטילת יותר מ-200 מ"ג של דגימות צואה לבידוד RNA, שכן הדבר עלול לגרום לקשיים בשלבים הבאים. עם דגימה עמוסה בצינור מיקרוצנטריפוגה של 2 מ"ל, ייתכן שהפאזה המיימית, הפאזה האורגנית והאינטרפאזה לא ייווצרו ויופרדו בבירור. ניתן להשהות את ההליך כאן.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>2. הכנות של פתרונות לשטוף
<ol><li>הוסף 21 מ"ל של אתנול בדרגה 100% אתנול של האגודה האמריקאית לכימיה כימית (ACS) לתמיסת הכביסה 1 המסופקת בערכת הבידוד miRNA (ראו טבלת חומרים) כדי להגיע לנפח הסופי של 30 מ"ל, כפי שמוצג על הבקבוק. מערבולת עד שהכל מתמוסס בבקבוק.</li>
	<li>הוסף 40 מ"ל של אתנול בדרגה ACS 100% לתמיסת הכביסה 2/3 שסופקה כדי להגיע לנפח הסופי של 50 מ"ל, כפי שמוצג בבקבוק. מערבולת במשך 5 שניות או עד שהתערובת הסופית מעורבבת היטב.</li>
</ol>3. הכנת ציוד וחומרים
<ol><li>רססו את אזור העבודה והציוד, לדוגמה: ספסל המעבדה, אזור העבודה במכסה האדים הכימיים ומדפי צינורות המיקרו-צנטריפוגה, עם תמיסת פירוק ריבונוקלאז (RNase) (לדוגמה, תמיסת פירוק RNase הזמינה מסחרית). כדי למנוע זיהום, יש למרוח עם תמיסת הפירוק RNase על המשטחים בכל מקום ובכל זמן שיימצא לנכון.</li>
	<li>יש לעטות מעיל מעבדה נקי, לעטות מסכת פנים וללבוש כפפות מעבדה מתאימות כדי להגן על הרנ"א בדגימות הצואה מפני נוקלאזות הנמצאות על עור האדם. יש לרסס כפפות עם תמיסת RNase deontamination ולהחליף כפפות לעתים קרובות כדי למנוע זיהום.</li>
	<li>הכינו דלי קרח יבש לדגימות צואה המאוחסנות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס כדי למנוע הפשרה לפני ההפשרה מחדש של הצואה ודלי קרח לחומרים, לדוגמה: חומצה-פנול: כלורופורם, להארכת חיי המדף. הערה: ודא שהחומרים כולל המדיה המשמשת בפרוטוקול הם סטריליים ללא זיהום של נוקלאים.</li>
</ol>4. החייאת צואה
<ol><li>יש לשלול 25-100 מ"ג של דגימות צואה ב-600 מיקרו-ליטר של תמיסת מלח סטרילית 1x Dulbecco (DPBS). אזהרה: דגימות צואה צריכות להיות מעובדות באופן מיידי כאשר הן מופשרות מ-80°C- ללא הפשרה חלקית אפילו כדי למזער את שחרורם של RNases ו-RNA תאי, שכן גבישי קרח קורעים תאים פנימיים וחיצוניים כאשר תאים בדגימה מפשירים.<ol><li>הוסף 600 μL של 1x DPBS לצינור microcentrifuge 2 מ"ל עם מכסה בורג המכיל דגימות צואה בטמפרטורת החדר (RT).</li>
		<li>דגירה של תערובת של דגימות צואה שקועה ב 600 μL של 1x DPBS בצינור microcentrifuge 2 מ"ל מכוסה במשך 30 דקות ב RT.</li>
		<li>השהה את התערובת על ידי מחית עם קצה פיפטה של 1 מ"ל ומערבולת היטב עם צינור microcentrifuge 2 מ"ל מכוסה. כדי לייעל ולהגדיל את הכמות והאיכות של RNA, להשעות את התערובת עם homogenizer עם ההגדרה עבור מחזור אחד ב S4000 (או 4000 סל"ד) ו 45 שניות.</li>
	</ol></li>
</ol>5. מיצוי אורגני
אזהרה: השתמש במכסה האדים הכימי המסוכן לשלבים הבאים עד שלב 6 עם שימוש בחומצה-פנול: כלורופורם ואתנול בדרגה ACS 100% בשל רעילותם ודליקותם. שנה PPE לפי הצורך ופעל לפי אמצעי זהירות סטנדרטיים נאותים בעת טיפול בחומרים מסוכנים.
<ol><li>חלץ RNA עם 600 μL של חומצה-פנול: כלורופורם (נפח חומצה-פנול: כלורופורם נדרש שווה לנפח הראשוני של 1x DPBS נוסף בשלב 4.1).<ol><li>הוסף 600 μL של חומצה-פנול: כלורופורם לתרחיף משלב 4.1. הערה: למשוך חומצה-פנול: כלורופורם מהשלב התחתון בבקבוק כאשר השלב העליון מעורבב עם חיץ מימי. אם האינטרפאזה בין שני השלבים האלה מופרעת, אז לחכות ולסגת חומצה-פנול: כלורופורם רק כאשר interphase מחדש מבסס את עצמו כדי למנוע זיהום.</li>
	</ol></li>
	<li>מערבבים את התערובת במשך 60 שניות כדי לערבב היטב. לחלופין, כדי לייעל ולהגדיל את כמות הרנ"א בתפוקה, ערבבו באמצעות הומוגנייזר עם ההגדרה למחזור אחד ב-S4000 וב-45 שניות.</li>
	<li>צנטריפוגה למשך 15 דקות ב-10,000 x גרם ב-RT כדי להפריד בין הפאזות המימיות והאורגניות באמצעות מיקרוצנטריפוגה. לאחר צנטריפוגה, האינטרפאזה צריכה להיות קומפקטית. אם לא, חזור על הצנטריפוגה. הערה: אם האינטרפאזה לא יכולה להיות קומפקטית כפי הרצוי, אולי בגלל יחס לא אחיד של הנפח הראשוני לנפח של חומצה-פנול נוסף: כלורופורם לאחר מספר חזרות של צנטריפוגה, המשך לשחזר את השלב מימי בזהירות רבה יותר כדי למנוע זיהום.</li>
	<li>לשחזר את הפאזה המימית ולהעביר אותה לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש של 2 מ"ל עם מכסה ציר (לא מסופק על ידי ערכת בידוד miRNA).<ol><li>הסר את הפאזה המימית (או העליונה) בזהירות מבלי להפריע לפאזה התחתונה והעבר אותה לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש בגודל 2 מ"ל עם מכסה ציר. שים לב לנפח שהועבר (לדוגמה, ~ 500 μL). הערה: כאשר האינטרפאזה קומפקטית והפאזה העליונה מופרדת בבירור, ייתכן שיש כמה חלקיקים שיוריים זעירים שצפים בחלק העליון של הפאזה המיימית. פיפטה בזהירות כדי להימנע משאריות אלה ולהתאושש רק בפאזה מימית מופרדת באופן גלוי וברור כדי להבטיח תפוקת RNA איכותית, גם אם ניתן להשיג רק נפח קטן של הפאזה המיימית.</li>
	</ol></li>
</ol>6. בידוד RNA סופי
<ol><li>הוסף 1.25 נפחים של 100% אתנול בדרגה RT ACS לפאזה המימית בצינור מיקרוצנטריפוגה של 2 מ"ל (לדוגמה, הוסף 625 μL של 100% אתנול אם 500 μL של פאזה מימית התאוששו משלב 5.4.). וורטקס 3 שניות.</li>
	<li>טען את תערובת הפאזה/אתנול המימית דרך מחסנית המסנן המסופקת בערכת הבידוד miRNA.<ol><li>עבור כל דגימה, הנח את מחסנית המסנן באחת מצינורות האיסוף המסופקים על ידי הערכה.<ol><li>פיפטה וטעינה של 600 μL של תערובת פאזה/אתנול מימית לתוך מחסנית המסנן. הערה: מערבבים את התערובת לזמן קצר כדי לערבב היטב את האתנול עם פאזה מימית לפני הפיפטה. לא ניתן לטעון יותר מ-700 μL של תערובת פאזה/אתנול מימית בכל פעם.</li>
		</ol></li>
		<li>צנטריפוגה בגודל 10,000 x גרם למשך 90 שניות כדי לסנן את התערובת. סיבוב במהירות גבוהה יותר עלול לגרום נזק למסנן.</li>
		<li>השליכו את התסנין וחזרו על שלבים 6.2.1 עד 6.2.2 עד שכל התערובת תסונן דרך אותה קרום מסנן ביישומים עוקבים. יש לשמור ולעשות שימוש חוזר באותו צינור איסוף לשטיפה בשלבים הבאים.</li>
		<li>שטפו את המסנן עם 700 μL של miRNA Wash Solution 1. אזהרה: תמיסת רחצה miRNA 1 מכילה גואנידין תיוציאנט שעלול לגרום לגירוי בעור ולנזק חמור לעיניים. ללבוש PPE הכרחי, למשל: כפפות, מגן פנים, מעיל מעבדה מגן. החלף כפפות לעתים קרובות לפי הצורך.<ol><li>החל 700 μL של miRNA Wash Solution 1, פתרון העבודה שהוכן עם אתנול 100% בדרגה ACS, לתוך מחסנית המסנן.</li>
			<li>צנטריפוגה למשך 60 שניות לסינון תמיסת הכביסה miRNA 1 דרך מחסנית המסנן.</li>
			<li>השליכו את התסנין מצינור האיסוף והכניסו את אותה מחסנית מסנן לאותה שפופרת איסוף.</li>
		</ol></li>
		<li>שטפו את המסנן עם Wash Solution 2/3 פעם אחת כל אחד בנפחים של 700 μL, 500 μL ו-250 μL ברציפות.<ol><li>החל 700 μL של Wash Solution 2/3, פתרון העבודה שהוכן עם אתנול 100% בדרגה ACS, לתוך מחסנית המסנן.<ol><li>צנטריפוגה ב-10,000 x גרם למשך דקה.</li>
				<li>השליכו את התסנין מצינור האיסוף והכניסו את אותה מחסנית מסנן לאותה שפופרת איסוף.</li>
			</ol></li>
			<li>יש למרוח 500 μL של תמיסת כביסה 2/3 לתוך מחסנית המסנן.<ol><li>צנטריפוגה ב-10,000 x גרם למשך דקה.</li>
				<li>השליכו את התסנין מצינור האיסוף והכניסו את אותה מחסנית מסנן לאותה שפופרת איסוף.</li>
			</ol></li>
			<li>החל 250 μL של תמיסת כביסה 2/3 לתוך מחסנית המסנן.<ol><li>צנטריפוגה ב-10,000 x גרם למשך דקה.</li>
				<li>השליכו את התסנין מצינור האיסוף.</li>
			</ol></li>
			<li>העבירו את מחסנית המסנן לצינור איסוף חדש וסובבו את המכלול למשך 5 דקות כדי להסיר שאריות נוזל מהמסנן.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>7. רנ"א אלוטי עם 50 μL מים נטולי נוקלאז
<ol><li>העבר את מחסנית המסנן לצינור איסוף חדש. פיפטה 50 μL של מים ללא נוקלאז למרכז המסנן ומכסה את צינור האיסוף.<ol><li>דגירה ב- RT במשך 10 דקות.</li>
		<li>סובבו במשך 5 דקות ב-8,000 x g כדי לשחזר RNA לתוך צינור האיסוף החדש.</li>
		<li>לקבוע את הריכוז והטוהר של RNA צואה משוחזר באמצעות פלואורומטר. RNA צואה משוחזר יכול להיות מאוחסן ב -80 מעלות צלזיוס.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Das, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+RNA+communication+consortium:+Establishing+foundational+knowledge+and+technologies+for+extracellular+RNA+research.">The extracellular RNA communication consortium: Establishing foundational knowledge and technologies for extracellular RNA research.</a> Cell. 177 (2), 231-242 (2019).</li><li>Ahmed, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+microRNA+markers+for+screening+sporadic+human+colon+cancer+and+active+ulcerative+colitis+in+stool+and+tissue.">Diagnostic microRNA markers for screening sporadic human colon cancer and active ulcerative colitis in stool and tissue.</a> Cancer Genomics &amp; Proteomics. 6 (5), 281-295 (2009).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+host+shapes+the+gut+microbiota+via+fecal+microRNA.">The host shapes the gut microbiota via fecal microRNA.</a> Cell Host &amp; Microbe. 19 (1), 32-43 (2016).</li><li>Viennois, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-derived+fecal+microRNAs+can+indicate+gut+microbiota+healthiness+and+ability+to+induce+inflammation.">Host-derived fecal microRNAs can indicate gut microbiota healthiness and ability to induce inflammation.</a> Theranostics. 9 (15), 4542-4557 (2019).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+administration+of+miR-30d+from+feces+of+MS+patients+suppresses+MS-like+symptoms+in+mice+by+expanding+Akkermansia+muciniphila.">Oral administration of miR-30d from feces of MS patients suppresses MS-like symptoms in mice by expanding Akkermansia muciniphila.</a> Cell Host &amp; Microbe. 26 (6), 779-794 (2019).</li><li>Masotti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+small+non-coding+RNAs+allows+an+accurate+comparison+of+miRNA+expression+profiles.">Quantification of small non-coding RNAs allows an accurate comparison of miRNA expression profiles.</a> Journal of Biomedicine &amp; Biotechnology. 2009, 659028 (2009).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+win+the+battle+with+RNase.">How to win the battle with RNase.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (2), 101857 (2019).</li><li>Franzosa, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relating+the+metatranscriptome+and+metagenome+of+the+human+gut.">Relating the metatranscriptome and metagenome of the human gut.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (22), 2329-2338 (2014).</li><li>Wohnhaas, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fecal+microRNAs+show+promise+as+noninvasive+Crohn's+disease+biomarkers.">Fecal microRNAs show promise as noninvasive Crohn's disease biomarkers.</a> Crohn's &amp; Colitis. 2 (1), 003 (2020).</li><li>Tomkovich, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+colon+mucosal+biofilms+and+murine+host+communicate+via+altered+mRNA+and+microRNA+expression+during+cancer.">Human colon mucosal biofilms and murine host communicate via altered mRNA and microRNA expression during cancer.</a> mSystems. 5 (1), (2020).</li><li>Tarallo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+fecal+small+RNA+profiles+in+colorectal+cancer+reflect+gut+microbiome+composition+in+stool+samples.">Altered fecal small RNA profiles in colorectal cancer reflect gut microbiome composition in stool samples.</a> mSystems. 4 (5), 70 (2019).</li><li>Xing, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breed+differences+in+the+expression+levels+of+gga-miR-222a+in+laying+hens+influenced+H2S+production+by+regulating+methionine+synthase+genes+in+gut+bacteria.">Breed differences in the expression levels of gga-miR-222a in laying hens influenced H2S production by regulating methionine synthase genes in gut bacteria.</a> Research Square. , (2020).</li><li>Teng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant-derived+exosomal+microRNAs+shape+the+gut+microbiota.">Plant-derived exosomal microRNAs shape the gut microbiota.</a> Cell Host &amp; Microbe. 24 (5), 637-652 (2018).</li><li>Moloney, G. M., Viola, M. F., Hoban, A. E., Dinan, T. G., Cryan, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Faecal+microRNAs:+indicators+of+imbalance+at+the+host-microbe+interface.">Faecal microRNAs: indicators of imbalance at the host-microbe interface.</a> Beneficial Microbes. , 1-10 (2017).</li><li>Giannoukos, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+robust+RNA-seq+process+for+cultured+bacteria+and+complex+community+transcriptomes.">Efficient and robust RNA-seq process for cultured bacteria and complex community transcriptomes.</a> Genome Biology. 13 (3), 23 (2012).</li></ol>

המחברים מצהירים על היעדר אינטרסים כספיים רלוונטיים או מהותיים הקשורים לשיטת המחקר המתוארת במאמר פרוטוקול זה.

חשוב להשתמש בטכניקה נטולת RNase כדי למנוע זיהום RNase במהלך הבידוד7. לאחר צנטריפוגה והיווצרות אינטרפאזה קומפקטית, חשוב להימנע מהאינטרפאזה, הפאזה התחתונה ומזיהום החלקיקים המרחף על החלק העליון של הפאזה המימית בעת שחזור הפאזה המיימית. בנוסף, מתווספים שני שלבי שטיפה עם 500 μL ו- 250 μL Wash Solution 2/3 כדי לסלק מזהמים בקרום המסנן לאיכות מיטבית. יתר על כן, חומר דגימת התחלה של יותר מ -200 מ"ג אינו מומלץ מכיוון שהוא עלול ליצור קושי בהיווצרות ברורה של אינטרפאזה. באופן דומה, חומר דגימה של פחות מ-25 מ"ג אינו מומלץ מכיוון שייתכן שהוא לא יספיק כדי להפיק מספיק דגימות RNA לניתוח במורד הזרם.
הגידול המדהים בחקר המיקרוביום הניע את המדידות של מינים מיקרוביאליים, גנים למחקרים מטא-טרנספורמטיביים של פרופיל מיקרוביאלי8. מיקרו-רנ"א בצואה נחקרו כסמנים למחלות 9,10,11. מאז הדיווח הראשון על מיקרו-רנ"א בצואה המתווך אינטראקציות בין פונדקאי למיקרוב3, מחקרים הולכים וגדלים מתחילים לחקור את התרומות של פונדקאי ותזונה במערכת האקולוגית של המעיים12,13,14. יש לציין כי בשל העושר של מיקרובים בלומן המעיים ובצואה, מחקרים המתמקדים בזרוע המארחת של האינטראקציה בין המיקרוב המארח דורשים זיהום RNA מינימלי ממיקרובים. לפיכך, פרוטוקול מיצוי RNA הכולל שלבים של תזונת תאים15 אינו אידיאלי לחקר רנ"א המשתחררים מהמארח ומהתזונה. ככזה, התאמנו את הפרוטוקול הזה כדי למנוע שלבי תסיסה למזעור זיהומים של RNA מחיידקים חיים ותאים מארחים חיים בצואה.
פרוטוקול זה פועל עבור מחקרים שבהם רנ"א חוץ-תאי בתכולת לומן בצואה או במעיים הוא מטרה מעניינת. RNA מבודד באמצעות פרוטוקול זה הוא RNA כולל, כולל מיקרו-רנ"א כמרכיב עיקרי. פרוטוקול זה אינו מבחין אם הרנ"א נמצא באקסוזום, במיקרו-ווסיקלים או בצורה נטולת שלפוחית.

רנ"א חוץ-תאי מקבל הכרה כגורם משמעותי המתווך תהליכים ביולוגיים רבים1. RNA חוץ-תאי בצואה דווח לראשונה בשנת 2008 כסמן לסרטן המעי הגס ולקוליטיס כיבית פעילה2, והוא התגלה לאחרונה כמרכיב נורמלי של לומן המעיים והצואה ומתווך תקשורת בין חיידקים מארחים 3,4,5. מטרת פרוטוקול בידוד RNA זה היא לחלץ RNA חוץ-תאי באיכות גבוהה מדגימות צואה שנאספו מנבדקים בעלי חיים ובני אדם. הפרוטוקול הותאם מתוך ערכת בידוד miRNA מסחרית. הרנ"א הנרכש מנוצל לניתוחים במורד הזרם כגון ריצוף RNA, RT-PCR ומיקרו-מערך. הפרוטוקול כולל מספר טיפים חשובים ושימושיים כדי למקסם את הכמות והאיכות של RNA שנמצא בצואה של בעלי חיים ובני אדם. הסיבה לפתח ולייעל שיטה זו של בידוד RNA (כולל מיקרו-רנ"א) היא להקטין את הרנ"א המיקרוביאלי בצואה, להגביל את המשתנים במחקרים ולנתח את הרכב הרנ"א במעיים מבלי לקחת בחשבון גורמים מבלבלים שונים ומקורות זיהום. יש לציין שבידוד רנ"א זה ממזער את שחרור הרנ"א מתא חי וממיקרובים חיים (רנ"א תאי). הוא מתמקד ב-RNA חוץ-תאי ששוחררו על-ידי תאי מעיים או נרכשו באמצעות צריכת מזון. בעיקרון, שיטה זו אינה מתאימה למחקרים שבהם נחקר התעתיק המיקרוביאלי.

<table><tbody><tr><td>Acid-Phenol: Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>AM9720</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, no calcium, no magnesium</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Gloves</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>mirVana miRNA Isolation Kit</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>AM1561</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-Free microcentrifuge tubes (1.5 mL, 2 mL)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-Free Water (Not DEPC-treated)</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>Pipettor and Nuclease-Free Pipette tips (with filter)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PowerLyzer 24 Homogenizer</td><td>QIAGEN</td><td>13155</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Shaker</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

fecal (micro) rna isolation

זה הולך ומתברר כי RNA קיים לומן המעיים וצואה בבעלי חיים ובני אדם. הפרוטוקול המתואר להלן מבודד את סך הרנ"א כולל מיקרו-רנ"א מדגימות צואה של נבדקים בעלי חיים ובני אדם. המטרה היא לבודד RNA כולל עם טוהר וכמות גבוהים עבור ניתוחים במורד הזרם כגון ריצוף RNA, RT-PCR ומיקרו-מערך. היתרונות של פרוטוקול אופטימלי זה בבידוד miRNA הם היכולות של בידוד מוצרי RNA מטוהרים מאוד עם שלבי שטיפה נוספים שתוארו, כמות מוגברת של RNA המתקבלת בשיטה משופרת בחידוש הדגימה, וטיפים חשובים של פירוק. מגבלה אחת היא חוסר היכולת לעבד ולטהר מדגם גדול יותר של יותר מ -200 מ"ג מכיוון שגודלי דגימה אלה יגרמו לקושי בהיווצרות ברורה של האינטרפאזה. כתוצאה מכך, גודל המדגם הגדול עלול לזהם את הפאזה המימית שיש לחלץ כמתואר בפרוטוקול עם עניינים אורגניים המשפיעים על איכות הרנ"א המבודד בסופו של דבר. עם זאת, רנ"א מבודד מדגימה של עד 200 מ"ג מספיק לרוב הניתוחים במורד הזרם.

רנ"א מייצגים בודדו מדגימות של 50 מ"ג צואת עכברים (2 כדורי צואה של עכברים) ו-100 מ"ג של דגימות צואה אנושית בהתאמה, ונלקחו במים נטולי נוקלאז של 50 μL. מניתוח ספקטרופוטומטר של הריכוז עולה כי כמות כוללת של 49 מיקרוגרם ו-16 מיקרוגרם RNA בודדו בהתאמה (טבלה 1). טוהר הרנ"א היה גבוה כפי שצוין על ידי יחס A260/A280 של ~2.0 ויחס A260/A230 של ~1.8 (טבלה 1). כפי שדווח3, רוב הרנ"א בצואה הם מיקרו-רנ"א, והמיקרו-רנ"א האלה יכולים להתקיים באקסוזום. באופן עקבי לכך, בדיקת אלקטרופורזה מבוססת שבב של RNA מציעה כי מבודדי RNA מייצגים מצואה של עכברים ובני אדם הם נמוכים או חסרים בהרכבי rRNA של 18S ו-28S, וגודל מבודדי ה-RNA נופל באזור ה-RNA הקטן (איור 1A). אלקטרופורזה קטנה נוספת של רנ"א עם אלקטרופורזה מבוססת שבב מגלה שחלק גדול מהרנ"א הם בגודל מיקרו-רנ"א (איור 1B). זה עולה בקנה אחד עם התצפית כי הכימות שהושלם על ידי שימוש בביואנליזר RNA קטן דומה לזה שהתקבל עם מבחנים קודמים6.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>מזהה לדוגמה</td>
			<td>נפח אלוציה (μL)</td>
			<td>ריכוז RNA (ng/μL)</td>
			<td>A260/A280</td>
			<td>A260/A230</td>
			<td>תשואה (ng)</td>
		</tr><tr><td>עכבר</td>
			<td>50</td>
			<td>978.333</td>
			<td>2.036</td>
			<td>1.897</td>
			<td>48916.65</td>
		</tr><tr><td>אנוש</td>
			<td>50</td>
			<td>330.759</td>
			<td>1.981</td>
			<td>1.849</td>
			<td>16537.95</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 1: אנליזה מייצגת של ננו-טיפות של RNA שבודד באמצעות פרוטוקול זה. רנ"א מייצגים בודדו מ-2 כדורי צואה של עכברים או מדגימות של 100 מ"ג של צואה אנושית, שהוטבעו במים נטולי נוקלאז של 50 μL. ריכוז RNA, יחס של A260/A280 ויחס של A260/A230 נמדדו באמצעות ננודרופ.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61908/61908fig01.jpg"> איור 1: ניתוחי אלקטרופורזה מייצגים מבוססי שבבים של התפלגות הגודל של מבודדי RNA צואה. (A) רנ"א מייצגים שבודדו מ-2 כדורי צואה של עכברים (פאנל שמאלי) ודגימות צואה אנושיות של 100 מ"ג (פאנל ימני) באמצעות הפרוטוקול המתואר כאן אופיינו באמצעות בדיקת אלקטרופורזה מבוססת שבב. בדיקה זו מצביעה על כך שרוב מבודדי ה-RNA היו רנ"א קטנים. (B) המבודדים היו נתונים לאחר מכן לאלקטרופורזה RNA קטנה עם מערכת אלקטרופורזה מבוססת שבב כדי לנתח את התפלגות הגודל של המבודדים. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61908/61908fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Fecal micro RNA Isolation at JoVE.com

Fecal micro RNA Isolation

פרוטוקול זה מבודד RNA כולל באיכות גבוהה מדגימות צואה של נבדקים בעלי חיים ובני אדם. ערכת בידוד miRNA מסחרית משמשת עם הסתגלות משמעותית לבידוד RNA טהור עם כמות ואיכות אופטימליות. מבודדי ה-RNA טובים לרוב מבחני ה-RNA במורד הזרם, כגון ריצוף, מיקרו-מערך ו-RT-PCR.

צואה (מיקרו) בידוד RNA

It is becoming clear that RNA exists in the gut lumen and feces in animals and humans. The protocol described below isolates total RNA including microRNAs ...

Universidad San Sebastian

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Medical-Surgical Nursing

Immunology and Infection

Unit 1

Fecal (micro) RNA Isolation

Diagnostic and Radiological Studies of the GI System

SCIENTISTS IN ACTION

4.5K Views.  Brigham and Women's Hospital and Harvard Medical School. פרוטוקול זה מבודד RNA כולל באיכות גבוהה מדגימות צואה של נבדקים בעלי חיים ובני אדם. ערכת בידוד miRNA מסחרית משמשת עם הסתגלות משמעותית לבידוד RNA טהור עם כמות ואיכות אופטימליות. מבודדי ה-RNA טובים לרוב מבחני ה-RNA במורד הזרם, כגון ריצוף, מיקרו-מערך ו-RT-PCR.

Video: Fecal micro RNA Isolation

Perturbations of Circulating miRNAs in Irritable Bowel Syndrome Detected Using a Multiplexed High-throughput Gene Expression Platform

The gene expression platform assay allows for robust and highly reproducible quantification of the expression of up to 800 transcripts (mRNA or miRNAs) in a single reaction. The miRNA assay counts transcripts by directly imaging and digitally counting miRNA molecules that are labeled with color-coded fluorescent barcoded probe sets (a reporter probe and a capture probe). Barcodes are hybridized directly to mature miRNAs that have been elongated by ligating a unique oligonucleotide tag (miRtag) to the 3&#39; end. Reverse transcription and amplification of the transcripts are not required. Reporter probes contain a sequence of six color positions populated using a combination of four fluorescent colors. The four colors over six positions are used to construct a gene-specific color barcode sequence. Post-hybridization processing is automated on a robotic prep station. After hybridization, the excess probes are washed away, and the tripartite structures (capture probe-miRNA-reporter probe) are fixed to a streptavidin-coated slide via the biotin-labeled capture probe. Imaging and barcode counting is done using a digital analyzer. The immobilized barcoded miRNAs are visualized and imaged using a microscope and camera, and the unique barcodes are decoded and counted. Data quality control (QC), normalization, and analysis are facilitated by a custom-designed data processing and analysis software that accompanies the assay software. The assay demonstrates high linearity over a broad range of expression, as well as high sensitivity. Sample and assay preparation does not involve enzymatic reactions, reverse transcription, or amplification; has few steps; and is largely automated, reducing investigator effects and resulting in high consistency and technical reproducibility. Here, we describe the application of this technology to identifying circulating miRNA perturbations in irritable bowel syndrome.

We describe the use of a multiplexed high-throughput gene expression platform that quantitates gene expression by barcoding and counting molecules in biological substrates without the need for amplification. We used the platform to quantitate microRNA (miRNA) expression in whole blood in subjects with and without irritable bowel syndrome.

הפרעות של במחזור miRNAs ב תסמונת מעי רגיז זוהו באמצעות פלטפורמת ביטוי גני תפוקה הגבוהה Multiplexed

The gene expression platform assay allows for robust and highly reproducible quantification of the expression of up to 800 transcripts (mRNA or miRNAs) in ...

Genetics

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of cancer development. By using non-invasive or pre-malignant lesions from patients who later develop invasive disease, gene expression analyses may help identify early molecular alterations that predispose to cancer risk. It has been well described that nucleic acids recovered from FFPE tissues have undergone severe physical damage and chemical modifications, which make their analysis difficult and generally requires adapted assays. MicroRNAs (miRNAs), however, which represent a small class of RNA molecules spanning only up to ~18&#8211;24 nucleotides, have been shown to withstand long-term storage and have been successfully analyzed in FFPE samples. Here we present a 3&#39; barcoded complementary DNA (cDNA) library preparation protocol specifically optimized for the analysis of small RNAs extracted from archived tissues, which was recently demonstrated to be robust and highly reproducible when using archived clinical specimens stored for up to 35 years. This library preparation is well adapted to the multiplex analysis of compromised/degraded material where RNA samples (up to 18) are ligated with individual 3&#39; barcoded adapters and then pooled together for subsequent enzymatic and biochemical preparations prior to analysis. All purifications are performed by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE), which allows size-specific selections and enrichments of barcoded small RNA species. This cDNA library preparation is well adapted to minute RNA inputs, as a pilot polymerase chain reaction (PCR) allows determination of a specific amplification cycle to produce optimal amounts of material for next-generation sequencing (NGS). This approach was optimized for the use of degraded FFPE RNA from specimens archived for up to 35 years and provides highly reproducible NGS data.

Formalin-fixed paraffin-embedded specimens represent a valuable source of molecular biomarkers of human diseases. Here we present a laboratory-based cDNA library preparation protocol, initially designed with fresh frozen RNA, and optimized for the analysis of archived microRNAs from tissues stored up to 35 years.

רצף MicroRNA רטרוספקטיבה: DNA משלימים ספריית הכנת פרוטוקול באמצעות פורמלין-קבוע RNA פרפין-מוטבע דגימות

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, milk and urine. One subset of these RNAs are the posttranscriptional regulators &#8211; microRNAs (miRNAs). To delineate the miRNAs produced by specific cell types, in vitro culture systems can be used to harvest and profile exRNAs derived from one subset of cells. The secreted factors of mesenchymal stem cells are implicated in alleviating numerous diseases and is used as the in vitro model system here. This paper describes the process of collection, purification of small RNA and library generation to sequence extracellular miRNAs. ExRNAs from culture media differ from cellular RNA by being low RNA input samples, which calls for optimized procedures. This protocol provides a comprehensive guide to small exRNA sequencing from culture media, showing quality control checkpoints at each step during exRNA purification and sequencing.

This protocol demonstrates how to purify extracellular microRNAs from cell culture media for small RNA library construction and next generation sequencing. Various quality control checkpoints are described to allow readers to understand what to expect when working with low input samples like exRNAs.

בידוד, קביעת רצף וניתוח מיקרו Rna חוץ-תאי של גזע Mesenchymal אנושי

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, ...

A Complete Pipeline for Isolating and Sequencing MicroRNAs, and Analyzing Them Using Open Source Tools

Half of all human transcripts are thought to be regulated by microRNAs. Therefore, quantifying microRNA expression can reveal underlying mechanisms in disease states and provide therapeutic targets and biomarkers. Here, we detail how to accurately quantify microRNAs. Briefly, this method describes isolating microRNAs, ligating them to adaptors suitable for high-throughput sequencing, amplifying the final products, and preparing a sample library. Then, we explain how to align the obtained sequencing reads to microRNA hairpins, and quantify, normalize, and calculate their differential expression. Versatile and robust, this combined experimental workflow and bioinformatic analysis enables users to begin with tissue extraction and finish with microRNA quantification.

Here, we describe a step-by-step strategy for isolating small RNAs, enriching for microRNAs, and preparing samples for high-throughput sequencing. We then describe how to process sequence reads and align them to microRNAs, using open source tools.

צינור מלא לבידוד ולרצף של מיקרו-משתמשים וניתוחם באמצעות כלי קוד פתוח

Half of all human transcripts are thought to be regulated by microRNAs. Therefore, quantifying microRNA expression can reveal underlying mechanisms in ...

Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their translational repression. Changes in miRNA expression have been shown to be involved in the development of all major complex diseases. Furthermore, recent findings showed that miRNAs can be secreted to the extracellular environment and enter the bloodstream and other body fluids where they can circulate with high stability. The function of such circulating miRNAs remains largely elusive, but systematic high throughput approaches, such as miRNA profiling arrays, have lead to the identification of miRNA signatures in several pathological conditions, including neurodegenerative disorders and several types of cancers. In this context, the identification of miRNA expression profile in the cerebrospinal fluid, as reported in our recent study, makes miRNAs attractive candidates for biomarker analysis.
There are several tools available for profiling microRNAs, such as microarrays, quantitative real-time PCR (qPCR), and deep sequencing. Here, we describe a sensitive method to profile microRNAs in cerebrospinal fluids by quantitative real-time PCR. We used the Exiqon microRNA ready-to-use PCR human panels I and II V2.R, which allows detection of 742 unique human microRNAs. We performed the arrays in triplicate runs and we processed and analyzed data using the GenEx Professional 5 software.
Using this protocol, we have successfully profiled microRNAs in various types of cell lines and primary cells, CSF, plasma, and formalin-fixed paraffin-embedded tissues.

We describe a protocol of real time PCR to profile microRNAs in the cerebrospinal fluid (CSF). With the exception of RNA extraction protocols, the procedure can be extended to RNA extracted from other body fluids, cultured cells, or tissue specimens.

נוזל עמוד שדרת MicroRNA פרופיל שימוש כמותי בזמן אמת PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their ...

Medicine

Circulating MicroRNA Quantification Using DNA-binding Dye Chemistry and Droplet Digital PCR

Circulating (of cell-free) microRNAs (miRNAs) are released from cells into the blood stream. The amount of specific microRNAs in the circulation has been linked to a disease state and has the potential to be used as disease biomarker. A sensitive and accurate method for circulating microRNA quantification using a dye-based chemistry and droplet digital PCR technology has been recently developed. Specifically, using Locked Nucleic Acid (LNA)-based miRNA-specific primers with a green fluorescent DNA-binding dye in a compatible droplet digital PCR system it is possible to obtain the absolute quantification of specific miRNAs. Here, we describe how performing this technique to assess miRNA amount in biological fluids, such as plasma and serum, is both feasible and effective.

A sensitive and accurate method for cell-free microRNAs quantification using a dye-based chemistry and droplet digital PCR technology is described.

במחזור כימות MicroRNA שימוש DNA מחייבת כימיה דיי PCR דיגיטלי אגל

Circulating (of cell-free) microRNAs (miRNAs) are released from cells into the blood stream. The amount of specific microRNAs in the circulation has been ...

Bioengineering

Isolation and Profiling of MicroRNA-containing Exosomes from Human Bile

Exosome research in the last three years has greatly extended the scope towards identification and characterization of biomarkers and their therapeutic uses.
Exosomes have recently been shown to contain microRNAs (miRs). MiRs themselves have arisen as valuable biomarkers for diagnostic purposes. As specimen collection in clinics and hospitals is quite variable, miRNA isolation from whole bile varies substantially. To achieve robust, accurate and reproducible miRNA profiles from collected bile samples in a simple manner required the development of a high-quality protocol to isolate and characterize exosomes from bile. The method requires several centrifugations and a filtration step with a final ultracentrifugation step to pellet the isolated exosomes. Electron microscopy, Western blots, flow cytometry and multi-parameter nanoparticle optical analysis, where available, are crucial characterization steps to validate the quality of the exosomes. For the isolation of miRNA from these exosomes, spiking the lysate with a non-specific, synthetic miRNA from a species like Caenorhabditis elegans, i.e., Cel-miR-39, is important for normalization of RNA extraction efficiency. The isolation of exosome from bile fluid following this method allows the successful miRNA profiling from bile samples stored for several years at -80 &#176;C.

Bile fluid is a valuable source of extracellular vesicles/exosomes that contain potentially important biomarkers. This protocol represents a robust method to isolate exosomes from human bile for further analyses including miRNA profiling.

בידוד Profiling של MicroRNA המכיל Exosomes מן האדם מר

Exosome research in the last three years has greatly extended the scope towards identification and characterization of biomarkers and their therapeutic ...

Purification and microRNA Profiling of Exosomes Derived from Blood and Culture Media

Stable miRNAs are present in all body fluids and some circulating miRNAs are protected from degradation by sequestration in small vesicles called exosomes. Exosomes can fuse with the plasma membrane resulting in the transfer of RNA and proteins to the target cell. Their biological functions include immune response, antigen presentation, and intracellular communication. Delivery of miRNAs that can regulate gene expression in the recipient cells via blood has opened novel avenues for target intervention. In addition to offering a strategy for delivery of drugs or RNA therapeutic agents, exosomal contents can serve as biomarkers that can aid in diagnosis, determining treatment options and prognosis.	Here we will describe the procedure for quantitatively analyzing miRNAs and messenger RNAs (mRNA) from exosomes secreted in blood and cell culture media. Purified exosomes will be characterized using western blot analysis for exosomal markers and PCR for mRNAs of interest. Transmission electron microscopy (TEM) and immunogold labeling will be used to validate exosomal morphology and integrity. Total RNA will be purified from these exosomes to ensure that we can study both mRNA and miRNA from the same sample. After validating RNA integrity by Bioanalyzer, we will perform a medium throughput quantitative real time PCR (qPCR) to identify the exosomal miRNA using Taqman Low Density Array (TLDA) cards and gene expression studies for transcripts of interest.	
 These protocols can be used to quantify changes in exosomal miRNAs in patients, rodent models and cell culture media before and after pharmacological intervention. Exosomal contents vary due to the source of origin and the physiological conditions of cells that secrete exosomes. These variations can provide insight on how cells and systems cope with stress or physiological perturbations. Our representative data show variations in miRNAs present in exosomes purified from mouse blood, human blood and human cell culture media.	
 Here we will describe the procedure for quantitatively analyzing miRNAs and messenger RNAs (mRNA) from exosomes secreted in blood and cell culture media. Purified exosomes will be characterized using western blot analysis for exosomal markers and PCR for mRNAs of interest. Transmission electron microscopy (TEM) and immunogold labeling will be used to validate exosomal morphology and integrity. Total RNA will be purified from these exosomes to ensure that we can study both mRNA and miRNA from the same sample. After validating RNA integrity by Bioanalyzer, we will perform a medium throughput quantitative real time PCR (qPCR) to identify the exosomal miRNA using Taqman Low Density Array (TLDA) cards and gene expression studies for transcripts of interest.
 These protocols can be used to quantify changes in exosomal miRNAs in patients, rodent models and cell culture media before and after pharmacological intervention. Exosomal contents vary due to the source of origin and the physiological conditions of cells that secrete exosomes. These variations can provide insight on how cells and systems cope with stress or physiological perturbations. Our representative data show variations in miRNAs present in exosomes purified from mouse blood, human blood and human cell culture media

The presence of stable microRNAs (miRNAs) in exosomes has generated immense interest as a novel mode of intercellular communication, for their potential utility as biomarkers and as a route for therapeutic intervention. Here we demonstrate exosome purification from blood and culture media followed by quantitative PCR to identify miRNAs being transported.

טיהור וmicroRNA פרופיל של Exosomes נגזר מדיה דם ותרבות

Stable miRNAs are present in all body fluids and some circulating miRNAs  are protected from degradation by sequestration in small vesicles called  ...

Biology

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the immune system. Perturbation of the healthy gut microbiome has been suggested to play a role in the development of inflammatory diseases, including multiple sclerosis (MS). Environmental and genetic factors can influence the composition of the microbiome; therefore, identification of microbial communities linked with a disease phenotype has become the first step towards defining the microbiome&#8217;s role in health and disease. Use of 16S rRNA metagenomic sequencing for profiling bacterial community has helped in advancing microbiome research. Despite its wide use, there is no uniform protocol for 16S rRNA-based taxonomic profiling analysis. Another limitation is the low resolution of taxonomic assignment due to technical difficulties such as smaller sequencing reads, as well as use of only forward (R1) reads in the final analysis due to low quality of reverse (R2) reads. There is need for a simplified method with high resolution to characterize bacterial diversity in a given biospecimen. Advancements in sequencing technology with the ability to sequence longer reads at high resolution have helped to overcome some of these challenges. Present sequencing technology combined with a publicly available metagenomic analysis pipeline such as R-based Divisive Amplicon Denoising Algorithm-2 (DADA2) has helped advance microbial profiling at high resolution, as DADA2 can assign sequence at the genus and species levels. Described here is a guide for performing bacterial profiling using two-step amplification of the V3-V4 region of the 16S rRNA gene, followed by analysis using freely available analysis tools (i.e., DADA2, Phyloseq, and METAGENassist). It is believed that this simple and complete workflow will serve as an excellent tool for researchers interested in performing microbiome profiling studies.

Described here is a simplified standard operating procedure for microbiome profiling using 16S rRNA metagenomic sequencing and analysis using freely available tools. This protocol will help researchers who are new to the microbiome field as well as those requiring updates on methods to achieve bacterial profiling at a higher resolution.

אנליזה microbiota באמצעות שני שלבים PCR ו-הדור הבא של 16 rRNA גן רצף

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

Ticks are important ectoparasites that can vector multiple pathogens. The salivary glands of ticks are essential for feeding as their saliva contains many effectors with pharmaceutical properties that can diminish host immune responses and enhance pathogen transmission. One group of such effectors are microRNAs (miRNAs). miRNAs are short non-coding sequences that regulate host gene expression at the tick-host interface and within the organs of the tick. These small RNAs are transported in the tick saliva via extracellular vesicles (EVs), which serve inter-and intracellular communication. Vesicles containing miRNAs have been identified in the saliva of ticks. However, little is known about the roles and profiles of the miRNAs in tick salivary vesicles and glands. Furthermore, the study of vesicles and miRNAs in tick saliva requires tedious procedures to collect tick saliva. This protocol aims to develop and validate a method for isolating miRNAs from purified extracellular vesicles produced by ex vivo organ cultures. The materials and methodology needed to extract miRNAs from extracellular vesicles and tick salivary glands are described herein.

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

The present protocol describes the isolation of microRNAs from tick salivary glands and purified extracellular vesicles. This is a universal procedure that combines commonly used reagents and supplies. The method also allows the use of a small number of ticks, resulting in quality microRNAs that can be readily sequenced.

בידוד של מיקרו-רנ"א מתרביות בלוטת הרוק של Tick Ex Vivo ושלפוחיות חוץ-תאיות

Ticks are important ectoparasites that can vector multiple pathogens. The salivary glands of ticks are essential for feeding as their saliva contains many ...