Name: fecal (micro) rna isolation
Uploaded: 2020-10-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fecal micro RNA Isolation at JoVE.com

Wir erhielten technische Unterstützung von der Biopolymers Facility der Harvard Medical School für Bioanalysatoren. Diese Arbeit wurde durch das Forschungsstipendium der National Multiple Sclerosis Society RG-1707-28516 (H.L.W. und S.L.) unterstützt.

Alle hier beschriebenen Methoden mit Versuchstieren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) des Brigham and Women's Hospital der Harvard Medical School genehmigt.
Alle hier beschriebenen Methoden mit Humanforschungssubjekten entsprechen den Richtlinien des Partners Human Research Committee.
1. Entnahme von Kotproben
<ol><li>Autoklav oder Vorbereitung eines sterilen und nukleasefreien 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchens mit Schraubverschluss für jedes Tier in einem Versuch.<ol><li>Stellen Sie für menschliche Probanden eine geeignete, nukleasefreie und sterile Stuhlprobenentnahmevorrichtung für jeden Probanden bereit.</li>
	</ol></li>
	<li>Sammeln Sie 25-100 mg (ca. 1-4 Kotpellets für Mauskotproben) Stuhlproben von jedem Tier in einer sterilen Umgebung. HINWEIS: Zwei oder mehr fäkale Pellets (~ 50 mg oder schwerer) werden bevorzugt, um RNA von höchster Reinheit zu erhalten.<ol><li>Verwenden Sie alle notwendigen persönlichen Schutzausrüstungen (PSA) und Materialien, zum Beispiel: ein Paar Laborhandschuhe, ein Desinfektionsspray und ein steriles Papiertuch, um den Arbeitsbereich zu sterilisieren, in dem das Tierversuchsobjekt platziert wird, um eine Kontamination der Fäkalienprobe zu vermeiden.<ol><li>Weisen Sie bei Menschen jede Forschungsperson / jeden Sammler an, 100-200 mg Stuhlproben in einer möglichst sterilen Umgebung zu sammeln. Verwenden Sie den standardmäßigen sterilen Betrieb und vermeiden Sie die Kontamination der Stuhlprobe.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Sammeln Sie Stuhlproben von jedem Tier direkt in ein 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit Schraubverschluss, ohne andere Oberflächen zu berühren, um eine Kontamination zu vermeiden.<ol><li>Weisen Sie jeden Probanden an, direkt in ein geeignetes Entnahmegerät (z. B. ein steriles Stuhlprobenentnahmeset) zu defäkieren, um eine Kontamination zu vermeiden. HINWEIS: Weisen Sie das Subjekt an, eine Kontamination durch Toilettenoberflächen, Wasser, Urin oder andere nicht sterile Oberflächen / Gegenstände zu vermeiden.</li>
	</ol></li>
	<li>Fäkalproben, die in 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen gesammelt wurden, sofort bei -80 °C einfrieren oder in einen Eimer Trockeneis geben, um die bessere Menge und Qualität der RNA zu erhalten, bevor der Kot wie in den folgenden Schritten beschrieben resuspendiert wird.<ol><li>Bei menschlichen Stuhlproben aliquot jede frische Probe von 200 mg in 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit Schraubverschlüssen geben und bei -80 °C einfrieren, bevor der Kot wie unten beschrieben resuspendiert wird.<ol><li>Für die Lagerung von Stuhlproben, die sich nicht in 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit Schraubverschlüssen befinden, werden jeweils 100-200 mg gefrorene Proben gewogen und in separate 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit Schraubverschlüssen überführt, bevor der Kot wie unten beschrieben resuspendiert wird. HINWEIS: Vermeiden Sie bei menschlichen Stuhlproben die Entnahme von mehr als 200 mg Stuhlproben zur RNA-Isolierung, da dies in den folgenden Schritten zu Schwierigkeiten führen kann. Bei einer überladenen Probe in einem 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen sind die wässrige Phase, die organische Phase und die Interphase möglicherweise nicht eindeutig gebildet und getrennt. Die Prozedur kann hier pausiert werden.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>2. Zubereitung von Waschlösungen
<ol><li>Fügen Sie 21 ml 100%iges Ethanol der American Chemical Society (ACS) zu der Waschlösung 1 hinzu, die im miRNA-Isolierkit enthalten ist (siehe Materialtabelle), um das Endvolumen von 30 ml zu erreichen, wie auf der Flasche angegeben. Wirbeln, bis sich alles in der Flasche auflöst.</li>
	<li>Fügen Sie 40 ml ACS-Ethanol der Qualität 100% in die bereitgestellte Waschlösung 2/3 hinzu, um das Endvolumen von 50 ml zu erreichen, wie auf der Flasche angegeben. Wirbel für 5 s oder bis die endgültige Mischung gut gemischt ist.</li>
</ol>3. Vorbereitung von Geräten und Materialien
<ol><li>Besprühen Sie den Arbeitsbereich und die Ausrüstung, z. B. den Labortisch, den Arbeitsbereich im chemischen Abzug und die Mikrozentrifugenröhrchengestelle, mit einer Ribonuklease (RNase) Dekontaminationslösung (z. B. handelsübliche RNase-Dekontaminationslösung). Um eine Kontamination zu vermeiden, tragen Sie die RNase-Dekontaminationslösung auf die Oberflächen auf, wo und wann immer dies für notwendig erachtet wird.</li>
	<li>Ziehen Sie einen sauberen Laborkittel an, setzen Sie eine Gesichtsmaske auf und tragen Sie geeignete Laborhandschuhe, um die RNA in den Kotproben vor Nukleasen auf der menschlichen Haut zu schützen. Sprühen Sie Handschuhe mit einer RNase-Dekontaminationslösung und wechseln Sie die Handschuhe häufig, um eine Kontamination zu vermeiden.</li>
	<li>Bereiten Sie einen Eimer Trockeneis für fäkale Proben vor, die bei -80 °C gelagert werden, um ein Auftauen vor der Resuspension von Kot zu verhindern, und einen Eimer Eis für Materialien, zum Beispiel: Säure-Phenol: Chloroform, um die Haltbarkeit zu verlängern. HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Materialien, einschließlich der im Protokoll verwendeten Medien, steril sind, ohne dass Nukleasen kontaminiert werden.</li>
</ol>4. Fäkalien Resuspension
<ol><li>Resuspendieren Sie 25-100 mg Stuhlproben in 600 μL steriler 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS) von Dulbecco. VORSICHT: Fäkalproben sollten sofort verarbeitet werden, wenn sie ab -80 °C aufgetaut werden, ohne auch nur teilweise aufzutauen, um die Freisetzung von RNasen und zellulärer RNA zu minimieren, da Eiskristalle sowohl innere als auch äußere Zellkompartimente reißen, wenn Zellen in der Probe auftauen.<ol><li>Fügen Sie 600 μL 1x DPBS in das 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit Schraubverschluss mit Kotproben bei Raumtemperatur (RT) hinzu.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Mischung von Stuhlproben, die in 600 μL 1x DPBS in das 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen getaucht sind, das für 30 min bei RT verschlossen ist.</li>
		<li>Resuspendieren Sie die Mischung durch Maischen mit 1 ml Pipettenspitze und Wirbelbohrung mit dem 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Um die Menge und Qualität der RNA zu optimieren und zu erhöhen, resuspendieren Sie die Mischung mit einem Homogenisator mit der Einstellung für einen Zyklus bei S4000 (oder 4000 U/min) und 45 s.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Organische Extraktion
VORSICHT: Verwenden Sie den gefährlichen chemischen Abzug für die folgenden Schritte bis Schritt 6 unter Verwendung von Säurephenol: Chloroform und ACS Klasse 100% Ethanol aufgrund ihrer Toxizität und Entflammbarkeit. Wechseln Sie die PSA nach Bedarf und befolgen Sie die entsprechenden Standardvorsichtsmaßnahmen beim Umgang mit Gefahrgut.
<ol><li>Extrakt RNA mit 600 μL Säure-Phenol: Chloroform (das Volumen von Säure-Phenol: Chloroform erforderlich entspricht dem Anfangsvolumen von 1x DPBS in Schritt 4.1).<ol><li>600 μL Säure-Phenol: Chloroform in die Suspension aus Schritt 4.1 geben. HINWEIS: Säure-Phenol: Chloroform aus der unteren Phase in der Flasche zurückziehen, da die obere Phase mit einem wässrigen Puffer gemischt wird. Wenn die Interphase zwischen diesen beiden Phasen gestört ist, warten Sie und ziehen Sie Säure-Phenol: Chloroform nur zurück, wenn sich die Interphase wieder etabliert, um eine Kontamination zu vermeiden.</li>
	</ol></li>
	<li>Wirbeln Sie die Mischung für 60 s gründlich mischen. Alternativ, um die Menge an RNA in der Ausbeute zu optimieren und zu erhöhen, mischen Sie mit einem Homogenisator mit der Einstellung für einen Zyklus bei S4000 und 45 s.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie für 15 min bei 10.000 x g RT, um die wässrige und organische Phase mit einer Mikrozentrifuge zu trennen. Nach der Zentrifugation sollte die Interphase kompakt sein. Wenn nicht, wiederholen Sie die Zentrifugation. HINWEIS: Wenn die Interphase nicht so kompakt wie gewünscht sein kann, möglicherweise aufgrund eines ungleichmäßigen Verhältnisses des Anfangsvolumens zum Volumen des zugesetzten Säurephenols: Chloroform nach mehreren Zentrifugationswiederholungen, fahren Sie fort, die wässrige Phase mit größerer Sorgfalt wiederherzustellen, um eine Kontamination zu vermeiden.</li>
	<li>Gewinnen Sie die wässrige Phase zurück und übertragen Sie sie in ein neues 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit einer Scharnierkappe (nicht im miRNA-Isolierungskit enthalten).<ol><li>Entfernen Sie die wässrige (oder obere) Phase vorsichtig, ohne die untere Phase zu stören, und geben Sie sie in ein neues 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit Scharnierkappe. Beachten Sie das übertragene Volumen (z. B. ~500 μL). HINWEIS: Wenn die Interphase kompakt ist und die obere Phase klar getrennt ist, schwimmen möglicherweise einige winzige Restpartikel auf der Oberseite der wässrigen Phase. Pipettieren Sie vorsichtig, um diese Rückstände zu vermeiden und nur sichtbar und deutlich getrennte wässrige Phase zu gewinnen, um eine qualitativ hochwertige RNA-Ausbeute zu gewährleisten, auch wenn Sie nur ein kleines Volumen der wässrigen Phase erhalten könnten.</li>
	</ol></li>
</ol>6. Endgültige RNA-Isolierung
<ol><li>Fügen Sie 1,25 Volumen RT ACS-Ethanol der Klasse 100% in die wässrige Phase im 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen hinzu (z. B. fügen Sie 625 μL 100% Ethanol hinzu, wenn 500 μL wässrige Phase aus Schritt 5.4 gewonnen werden). Wirbel 3 s.</li>
	<li>Laden Sie das wässrige Phasen-Ethanol-Gemisch durch die Filterkartusche, die im miRNA-Isolierkit enthalten ist.<ol><li>Legen Sie die Filterpatrone für jede Probe in eines der vom Kit gelieferten Sammelröhrchen.<ol><li>600 μL des wässrigen Phasen/Ethanol-Gemisches werden pipettiert und in die Filterpatrone geladen. HINWEIS: Wirbeln Sie die Mischung kurz durch, um das Ethanol vor dem Pipettieren gründlich mit wässriger Phase zu mischen. Es können nicht mehr als 700 μL des wässrigen Phasen-Ethanol-Gemisches gleichzeitig geladen werden.</li>
		</ol></li>
		<li>Zentrifugieren Sie bei 10.000 x g für 90 s, um durch die Mischung zu filtern. Das Drehen mit einer höheren Geschwindigkeit kann den Filter beschädigen.</li>
		<li>Das Filtrat wird verworfen und die Schritte 6.2.1 bis 6.2.2 wiederholt, bis das gesamte Gemisch in aufeinanderfolgenden Anwendungen durch dieselbe Filtermembran filtriert ist. Bewahren Sie das gleiche Sammelrohr für die unten aufgeführten Waschschritte auf und verwenden Sie es wieder.</li>
		<li>Waschen Sie den Filter mit 700 μL miRNA Wash Solution 1. ACHTUNG: miRNA Wash Solution 1 enthält Guanidinthiocyanat, das Hautreizungen und schwere Augenschäden verursachen kann. Tragen Sie notwendige PSA, zum Beispiel: Handschuhe, Gesichtsschutz, Laborschutzkittel. Wechseln Sie die Handschuhe häufig nach Bedarf.<ol><li>700 μL miRNA Wash Solution 1, die mit ACS-Ethanol hergestellte Arbeitslösung, in die Filterpatrone geben.</li>
			<li>Zentrifugieren Sie für 60 s, um die miRNA Wash Solution 1 durch die Filterpatrone zu filtrieren.</li>
			<li>Entsorgen Sie das Filtrat aus dem Sammelröhrchen und legen Sie dieselbe Filterpatrone in dasselbe Sammelröhrchen.</li>
		</ol></li>
		<li>Waschen Sie den Filter mit Waschlösung 2/3 einmal mit Volumina von jeweils 700 μL, 500 μL und 250 μL hintereinander.<ol><li>Tragen Sie 700 μL Waschlösung 2/3, die mit der ACS-Qualität 100% Ethanol hergestellte Arbeitslösung, in die Filterpatrone auf.<ol><li>Zentrifugieren bei 10.000 x g für 1 min.</li>
				<li>Entsorgen Sie das Filtrat aus dem Sammelröhrchen und legen Sie dieselbe Filterpatrone in dasselbe Sammelröhrchen.</li>
			</ol></li>
			<li>Geben Sie 500 μL Waschlösung 2/3 in die Filterpatrone.<ol><li>Zentrifugieren bei 10.000 x g für 1 min.</li>
				<li>Entsorgen Sie das Filtrat aus dem Sammelröhrchen und legen Sie dieselbe Filterpatrone in dasselbe Sammelröhrchen.</li>
			</ol></li>
			<li>Geben Sie 250 μL Waschlösung 2/3 in die Filterpatrone.<ol><li>Zentrifugieren bei 10.000 x g für 1 min.</li>
				<li>Verwerfen Sie das Filtrat aus dem Sammelrohr.</li>
			</ol></li>
			<li>Füllen Sie die Filterpatrone in ein neues Auffangrohr und drehen Sie die Baugruppe 5 Minuten lang, um die Restflüssigkeit aus dem Filter zu entfernen.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>7. Elue RNA mit 50 μL nukleasefreiem Wasser
<ol><li>Füllen Sie die Filterpatrone in ein neues Auffangrohr. Pipettieren Sie 50 μL nukleasefreies Wasser in die Mitte des Filters und verschließen Sie das Sammelrohr.<ol><li>Inkubieren bei RT für 10 min.</li>
		<li>Spin für 5 min bei 8.000 x g , um RNA in das neue Sammelröhrchen zurückzugewinnen.</li>
		<li>Bestimmen Sie die Konzentration und Reinheit der gewonnenen fäkalen RNA mit einem Fluorometer. Die gewonnene fäkale RNA kann bei -80 °C gelagert werden.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
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M., Viola, M. F., Hoban, A. E., Dinan, T. G., Cryan, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Faecal+microRNAs:+indicators+of+imbalance+at+the+host-microbe+interface.">Faecal microRNAs: indicators of imbalance at the host-microbe interface.</a> Beneficial Microbes. , 1-10 (2017).</li><li>Giannoukos, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+robust+RNA-seq+process+for+cultured+bacteria+and+complex+community+transcriptomes.">Efficient and robust RNA-seq process for cultured bacteria and complex community transcriptomes.</a> Genome Biology. 13 (3), 23 (2012).</li></ol>

Die Autoren erklären keine relevanten oder wesentlichen finanziellen Interessen, die im Zusammenhang mit der in diesem Protokollpapier beschriebenen Forschungsmethode stehen.

Es ist wichtig, eine RNase-freie Technik zu verwenden, um eine RNase-Kontamination während der Isolierung zu verhindern7. Nach der Zentrifugation und der Bildung einer kompakten Interphase ist es wichtig, zu vermeiden, dass die Interphase, die untere Phase und die Partikelverunreinigung auf der Oberseite der wässrigen Phase schwimmen, wenn die wässrige Phase zurückgewonnen wird. Zusätzlich werden zwei Waschschritte mit 500 μL und 250 μL Waschlösung 2/3 hinzugefügt, um Verunreinigungen in der Filtermembran für eine optimierte Qualität zu eliminieren. Darüber hinaus wird ein Startprobenmaterial von mehr als 200 mg nicht empfohlen, da dies die klare Bildung einer Interphase erschweren kann. Ebenso wird ein Probenmaterial von weniger als 25 mg nicht empfohlen, da es möglicherweise nicht ausreicht, genügend RNA-Proben für die nachgeschaltete Analyse zu extrahieren.
Das unglaubliche Wachstum der Mikrobiomforschung hat die Messungen mikrobieller Spezies und Gene zu metatranskriptionellen Studien des mikrobiellen Profils vorangetrieben8. MicroRNAs im Stuhl wurden als Marker für Krankheiten 9,10,11 untersucht. Seit dem ersten Bericht über fäkale microRNA-vermittelte Wirt-Mikroben-Interaktionen3 beginnen zunehmende Studien, die Beiträge von Wirt und Ernährung im Darmökosystem zu untersuchen12,13,14. Aufgrund des Reichtums an Mikroben im Darmlumen und Kot erfordern Studien, die sich auf den Wirtsarm der Wirt-Mikroben-Interaktion konzentrieren, eine minimale RNA-Kontamination von Mikroben. Daher ist ein RNA-Extraktionsprotokoll, das Schritte der Zelllyse15 enthält, nicht ideal für die Untersuchung von RNAs, die aus Wirt und Nahrung freigesetzt werden. Daher haben wir dieses Protokoll angepasst, um Lyseschritte zur Minimierung von RNA-Kontaminationen von lebenden Bakterien und lebenden Wirtszellen im Kot zu eliminieren.
Dieses Protokoll funktioniert für Studien, bei denen extrazelluläre RNA im Stuhl- oder Darmlumengehalt ein interessantes Ziel ist. RNA, die mit diesem Protokoll isoliert wird, ist Gesamt-RNA, einschließlich microRNA als Hauptkomponente. Dieses Protokoll unterscheidet nicht, ob die RNA in Exosom, Mikrovesikel oder in einer vesikelfreien Form vorliegt.

Extrazelluläre RNA wird als ein bedeutender Faktor erkannt, der viele biologische Prozesse vermittelt1. Extrazelluläre RNA im Kot wurde erstmals 2008 als Marker für Darmkrebs und aktive Colitis ulcerosa2 berichtet und kürzlich als normaler Bestandteil des Darmlumens und -kots nachgewiesen und vermittelt die Wirt-Mikroben-Kommunikation 3,4,5. Der Zweck dieses RNA-Isolationsprotokolls ist es, qualitativ hochwertige extrazelluläre RNA aus Stuhlproben von Tieren und Menschen zu extrahieren. Das Protokoll wurde von einem kommerziellen miRNA Isolation Kit adaptiert. Die gewonnene RNA wird für nachgeschaltete Analysen wie RNA-Sequenzierung, RT-PCR und Micro-Array verwendet. Das Protokoll enthält mehrere wichtige und nützliche Tipps, um die Menge und Qualität der RNA im Kot von Tieren und Menschen zu maximieren. Der Grund für die Entwicklung und Optimierung dieser Methode der RNA-Isolierung (einschließlich microRNA) besteht darin, die mikrobielle RNA im Kot zu verringern, die Variablen in den Forschungsstudien zu begrenzen und die RNA-Zusammensetzung im Darm zu analysieren, ohne verschiedene Störfaktoren und Kontaminationsquellen zu berücksichtigen. Bemerkenswert ist, dass diese RNA-Isolierung die Freisetzung von RNA aus lebenden Zellen und lebenden Mikroben (zelluläre RNA) minimiert. Es konzentriert sich auf extrazelluläre RNAs, die von Darmzellen freigesetzt oder über die Nahrung aufgenommen wurden. Grundsätzlich ist diese Methode nicht für Studien geeignet, bei denen das mikrobielle Transkriptom untersucht wird.

<table><tbody><tr><td>Acid-Phenol: Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>AM9720</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, no calcium, no magnesium</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Gloves</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>mirVana miRNA Isolation Kit</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>AM1561</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-Free microcentrifuge tubes (1.5 mL, 2 mL)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-Free Water (Not DEPC-treated)</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>Pipettor and Nuclease-Free Pipette tips (with filter)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PowerLyzer 24 Homogenizer</td><td>QIAGEN</td><td>13155</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Shaker</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

fecal (micro) rna isolation

Es wird deutlich, dass RNA im Darmlumen und Kot von Tieren und Menschen existiert. Das unten beschriebene Protokoll isoliert die Gesamt-RNA einschließlich microRNAs aus Stuhlproben von Tieren und Menschen. Ziel ist es, Gesamt-RNA mit hoher Reinheit und Menge für nachgeschaltete Analysen wie RNA-Sequenzierung, RT-PCR und Micro-Array zu isolieren. Die Vorteile dieses optimierten Protokolls in der miRNA-Isolierung sind die Fähigkeit, hochgereinigte RNA-Produkte mit zusätzlichen beschriebenen Waschschritten zu isolieren, eine erhöhte Menge an RNA, die mit einer verbesserten Methode bei der Resuspension der Probe erhalten wird, und wichtige Tipps zur Dekontamination. Eine Einschränkung ist die Unfähigkeit, größere Proben von mehr als 200 mg zu verarbeiten und zu reinigen, da diese Probengrößen eine Schwierigkeit bei der klaren Bildung der Interphase verursachen würden. Folglich kann die große Probengröße die zu extrahierende wässrige Phase wie im Protokoll beschrieben mit organischen Stoffen kontaminieren, die die Qualität der am Ende isolierten RNA beeinträchtigen. Für die meisten nachgeschalteten Analysen reichen jedoch RNA-Isolate aus einer Probe von bis zu 200 mg aus.

Repräsentative RNAs wurden aus 50 mg Mauskotproben (2 Mauskotpellets) bzw. 100 mg menschlichen Stuhlproben isoliert und in 50 μL nukleasefreiem Wasser eluiert. Die Spektralphotometeranalyse der Konzentration legt nahe, dass insgesamt 49 μg bzw. 16 μg RNA isoliert wurden (Tabelle 1). Die RNA-Reinheit war hoch, was durch ein A260/A280-Verhältnis von ~2,0 und ein A260/A230-Verhältnis von ~1,8 angezeigt wird (Tabelle 1). Wie berichtet3, ist die Mehrheit der RNAs im Kot microRNA und diese microRNAs können im Exosom existieren. In Übereinstimmung damit legt ein Chip-basierter Elektrophorese-Assay von RNA nahe, dass repräsentative RNA-Isolate aus Maus- und menschlichen Fäkalien in 18S- und 28S-rRNA-Zusammensetzungen niedrig sind oder fehlen und die Größe der RNA-Isolate in die kleine RNA-Region fällt (Abbildung 1A). Eine weitere kleine RNA-Elektrophorese mit der chipbasierten Elektrophorese zeigt, dass ein großer Teil der RNAs von microRNA-Größe ist (Abbildung 1B). Dies steht im Einklang mit der Beobachtung, dass die mit einem kleinen RNA-Bioanalysator durchgeführte Quantifizierung mit der mit früheren Assays6 vergleichbar ist.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Beispiel-ID</td>
			<td>Elutionsvolumen (μL)</td>
			<td>RNA-Konzentration (ng/μL)</td>
			<td>A260/A280</td>
			<td>A260/A230</td>
			<td>Ertrag (ng)</td>
		</tr><tr><td>Maus</td>
			<td>50</td>
			<td>978.333</td>
			<td>2.036</td>
			<td>1.897</td>
			<td>48916.65</td>
		</tr><tr><td>Mensch</td>
			<td>50</td>
			<td>330.759</td>
			<td>1.981</td>
			<td>1.849</td>
			<td>16537.95</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 1: Repräsentative Nanotropfenanalyse von RNA, die mit diesem Protokoll isoliert wurde. Repräsentative RNAs wurden aus 2 Mauskotpellets oder 100 mg menschlichen Stuhlproben isoliert, die in 50 μL nukleasefreiem Wasser eluiert wurden. Die RNA-Konzentration, das Verhältnis von A260/A280 und das Verhältnis von A260/A230 wurden mit Nanotropfen gemessen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61908/61908fig01.jpg"> Abbildung 1: Repräsentative chipbasierte Elektrophorese-Analysen der Größenverteilung fäkaler RNA-Isolate. (A) Repräsentative RNAs, die aus 2 Mauskotpellets (linkes Bild) und 100 mg menschlichen Stuhlproben (rechtes Bild) unter Verwendung des hier beschriebenen Protokolls isoliert wurden, wurden mit dem Chip-basierten Elektrophorese-Assay charakterisiert. Dieser Assay legt nahe, dass die Mehrheit der RNA-Isolate kleine RNA waren. (B) Die Isolate wurden dann für die kleine RNA-Elektrophorese mit dem chipbasierten Elektrophoresesystem unterzogen, um die Größenverteilung der Isolate zu analysieren. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61908/61908fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>

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Fecal micro RNA Isolation

Dieses Protokoll isoliert hochwertige Gesamt-RNA aus Kotproben von Tieren und Menschen. Ein kommerzielles miRNA-Isolierkit wird mit signifikanter Adaption verwendet, um reine RNA mit optimierter Quantität und Qualität zu isolieren. Die RNA-Isolate eignen sich für die meisten nachgeschalteten RNA-Assays wie Sequenzierung, Micro-Array und RT-PCR.

Fäkale (Mikro-) RNA-Isolierung

It is becoming clear that RNA exists in the gut lumen and feces in animals and humans. The protocol described below isolates total RNA including microRNAs ...

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Unit 1

Fecal (micro) RNA Isolation

Diagnostic and Radiological Studies of the GI System

SCIENTISTS IN ACTION

4.5K Aufrufe.  Brigham and Women's Hospital and Harvard Medical School. Dieses Protokoll isoliert hochwertige Gesamt-RNA aus Kotproben von Tieren und Menschen. Ein kommerzielles miRNA-Isolierkit wird mit signifikanter Adaption verwendet, um reine RNA mit optimierter Quantität und Qualität zu isolieren. Die RNA-Isolate eignen sich für die meisten nachgeschalteten RNA-Assays wie Sequenzierung, Micro-Array und RT-PCR.

Serie: Fecal micro RNA Isolation

Perturbations of Circulating miRNAs in Irritable Bowel Syndrome Detected Using a Multiplexed High-throughput Gene Expression Platform

The gene expression platform assay allows for robust and highly reproducible quantification of the expression of up to 800 transcripts (mRNA or miRNAs) in a single reaction. The miRNA assay counts transcripts by directly imaging and digitally counting miRNA molecules that are labeled with color-coded fluorescent barcoded probe sets (a reporter probe and a capture probe). Barcodes are hybridized directly to mature miRNAs that have been elongated by ligating a unique oligonucleotide tag (miRtag) to the 3&#39; end. Reverse transcription and amplification of the transcripts are not required. Reporter probes contain a sequence of six color positions populated using a combination of four fluorescent colors. The four colors over six positions are used to construct a gene-specific color barcode sequence. Post-hybridization processing is automated on a robotic prep station. After hybridization, the excess probes are washed away, and the tripartite structures (capture probe-miRNA-reporter probe) are fixed to a streptavidin-coated slide via the biotin-labeled capture probe. Imaging and barcode counting is done using a digital analyzer. The immobilized barcoded miRNAs are visualized and imaged using a microscope and camera, and the unique barcodes are decoded and counted. Data quality control (QC), normalization, and analysis are facilitated by a custom-designed data processing and analysis software that accompanies the assay software. The assay demonstrates high linearity over a broad range of expression, as well as high sensitivity. Sample and assay preparation does not involve enzymatic reactions, reverse transcription, or amplification; has few steps; and is largely automated, reducing investigator effects and resulting in high consistency and technical reproducibility. Here, we describe the application of this technology to identifying circulating miRNA perturbations in irritable bowel syndrome.

We describe the use of a multiplexed high-throughput gene expression platform that quantitates gene expression by barcoding and counting molecules in biological substrates without the need for amplification. We used the platform to quantitate microRNA (miRNA) expression in whole blood in subjects with and without irritable bowel syndrome.

Störeinflüsse von Zirkulierende miRNAs in Irritable Bowel Syndrome erkannt einen Multiplexed Hochdurchsatz-Gene Expression-Plattform

The gene expression platform assay allows for robust and highly reproducible quantification of the expression of up to 800 transcripts (mRNA or miRNAs) in ...

Forschung

Genetik

Retrospective MicroRNA Sequencing: Complementary DNA Library Preparation Protocol Using Formalin-fixed Paraffin-embedded RNA Specimens

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of cancer development. By using non-invasive or pre-malignant lesions from patients who later develop invasive disease, gene expression analyses may help identify early molecular alterations that predispose to cancer risk. It has been well described that nucleic acids recovered from FFPE tissues have undergone severe physical damage and chemical modifications, which make their analysis difficult and generally requires adapted assays. MicroRNAs (miRNAs), however, which represent a small class of RNA molecules spanning only up to ~18&#8211;24 nucleotides, have been shown to withstand long-term storage and have been successfully analyzed in FFPE samples. Here we present a 3&#39; barcoded complementary DNA (cDNA) library preparation protocol specifically optimized for the analysis of small RNAs extracted from archived tissues, which was recently demonstrated to be robust and highly reproducible when using archived clinical specimens stored for up to 35 years. This library preparation is well adapted to the multiplex analysis of compromised/degraded material where RNA samples (up to 18) are ligated with individual 3&#39; barcoded adapters and then pooled together for subsequent enzymatic and biochemical preparations prior to analysis. All purifications are performed by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE), which allows size-specific selections and enrichments of barcoded small RNA species. This cDNA library preparation is well adapted to minute RNA inputs, as a pilot polymerase chain reaction (PCR) allows determination of a specific amplification cycle to produce optimal amounts of material for next-generation sequencing (NGS). This approach was optimized for the use of degraded FFPE RNA from specimens archived for up to 35 years and provides highly reproducible NGS data.

Formalin-fixed paraffin-embedded specimens represent a valuable source of molecular biomarkers of human diseases. Here we present a laboratory-based cDNA library preparation protocol, initially designed with fresh frozen RNA, and optimized for the analysis of archived microRNAs from tissues stored up to 35 years.

Retrospektive RNA Sequenzierung: Komplementäre DNA Bibliothek Vorbereitung Protokoll mit Formalin fixierten Paraffin-eingebetteten RNA-Proben

&#8211;Archived, clinically classified formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues can provide nucleic acids for retrospective molecular studies of ...

Isolating, Sequencing and Analyzing Extracellular MicroRNAs from Human Mesenchymal Stem Cells

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, milk and urine. One subset of these RNAs are the posttranscriptional regulators &#8211; microRNAs (miRNAs). To delineate the miRNAs produced by specific cell types, in vitro culture systems can be used to harvest and profile exRNAs derived from one subset of cells. The secreted factors of mesenchymal stem cells are implicated in alleviating numerous diseases and is used as the in vitro model system here. This paper describes the process of collection, purification of small RNA and library generation to sequence extracellular miRNAs. ExRNAs from culture media differ from cellular RNA by being low RNA input samples, which calls for optimized procedures. This protocol provides a comprehensive guide to small exRNA sequencing from culture media, showing quality control checkpoints at each step during exRNA purification and sequencing.

This protocol demonstrates how to purify extracellular microRNAs from cell culture media for small RNA library construction and next generation sequencing. Various quality control checkpoints are described to allow readers to understand what to expect when working with low input samples like exRNAs.

Isolieren, Sequenzierung und Analyse von extrazellulären MicroRNAs aus humanen mesenchymalen Stammzellen

Extracellular and circulating RNAs (exRNA) are produced by many cell types of the body and exist in numerous bodily fluids such as saliva, plasma, serum, ...

A Complete Pipeline for Isolating and Sequencing MicroRNAs, and Analyzing Them Using Open Source Tools

Half of all human transcripts are thought to be regulated by microRNAs. Therefore, quantifying microRNA expression can reveal underlying mechanisms in disease states and provide therapeutic targets and biomarkers. Here, we detail how to accurately quantify microRNAs. Briefly, this method describes isolating microRNAs, ligating them to adaptors suitable for high-throughput sequencing, amplifying the final products, and preparing a sample library. Then, we explain how to align the obtained sequencing reads to microRNA hairpins, and quantify, normalize, and calculate their differential expression. Versatile and robust, this combined experimental workflow and bioinformatic analysis enables users to begin with tissue extraction and finish with microRNA quantification.

Here, we describe a step-by-step strategy for isolating small RNAs, enriching for microRNAs, and preparing samples for high-throughput sequencing. We then describe how to process sequence reads and align them to microRNAs, using open source tools.

Eine vollständige Pipeline zum Isolieren und Sequenzieren von MicroRNAs und deren Analyse mithilfe von Open Source Tools

Half of all human transcripts are thought to be regulated by microRNAs. Therefore, quantifying microRNA expression can reveal underlying mechanisms in ...

Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their translational repression. Changes in miRNA expression have been shown to be involved in the development of all major complex diseases. Furthermore, recent findings showed that miRNAs can be secreted to the extracellular environment and enter the bloodstream and other body fluids where they can circulate with high stability. The function of such circulating miRNAs remains largely elusive, but systematic high throughput approaches, such as miRNA profiling arrays, have lead to the identification of miRNA signatures in several pathological conditions, including neurodegenerative disorders and several types of cancers. In this context, the identification of miRNA expression profile in the cerebrospinal fluid, as reported in our recent study, makes miRNAs attractive candidates for biomarker analysis.
There are several tools available for profiling microRNAs, such as microarrays, quantitative real-time PCR (qPCR), and deep sequencing. Here, we describe a sensitive method to profile microRNAs in cerebrospinal fluids by quantitative real-time PCR. We used the Exiqon microRNA ready-to-use PCR human panels I and II V2.R, which allows detection of 742 unique human microRNAs. We performed the arrays in triplicate runs and we processed and analyzed data using the GenEx Professional 5 software.
Using this protocol, we have successfully profiled microRNAs in various types of cell lines and primary cells, CSF, plasma, and formalin-fixed paraffin-embedded tissues.

We describe a protocol of real time PCR to profile microRNAs in the cerebrospinal fluid (CSF). With the exception of RNA extraction protocols, the procedure can be extended to RNA extracted from other body fluids, cultured cells, or tissue specimens.

Liquor microRNA Profiling mittels quantitativer Real-Time PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their ...

Medizin

Circulating MicroRNA Quantification Using DNA-binding Dye Chemistry and Droplet Digital PCR

Circulating (of cell-free) microRNAs (miRNAs) are released from cells into the blood stream. The amount of specific microRNAs in the circulation has been linked to a disease state and has the potential to be used as disease biomarker. A sensitive and accurate method for circulating microRNA quantification using a dye-based chemistry and droplet digital PCR technology has been recently developed. Specifically, using Locked Nucleic Acid (LNA)-based miRNA-specific primers with a green fluorescent DNA-binding dye in a compatible droplet digital PCR system it is possible to obtain the absolute quantification of specific miRNAs. Here, we describe how performing this technique to assess miRNA amount in biological fluids, such as plasma and serum, is both feasible and effective.

A sensitive and accurate method for cell-free microRNAs quantification using a dye-based chemistry and droplet digital PCR technology is described.

Zirkulierende MicroRNA Quantifizierung der Basis von DNA-bindenden Farbstoff Chemie und Droplet Digital-PCR

Circulating (of cell-free) microRNAs (miRNAs) are released from cells into the blood stream. The amount of specific microRNAs in the circulation has been ...

Biotechnik

Isolation and Profiling of MicroRNA-containing Exosomes from Human Bile

Exosome research in the last three years has greatly extended the scope towards identification and characterization of biomarkers and their therapeutic uses.
Exosomes have recently been shown to contain microRNAs (miRs). MiRs themselves have arisen as valuable biomarkers for diagnostic purposes. As specimen collection in clinics and hospitals is quite variable, miRNA isolation from whole bile varies substantially. To achieve robust, accurate and reproducible miRNA profiles from collected bile samples in a simple manner required the development of a high-quality protocol to isolate and characterize exosomes from bile. The method requires several centrifugations and a filtration step with a final ultracentrifugation step to pellet the isolated exosomes. Electron microscopy, Western blots, flow cytometry and multi-parameter nanoparticle optical analysis, where available, are crucial characterization steps to validate the quality of the exosomes. For the isolation of miRNA from these exosomes, spiking the lysate with a non-specific, synthetic miRNA from a species like Caenorhabditis elegans, i.e., Cel-miR-39, is important for normalization of RNA extraction efficiency. The isolation of exosome from bile fluid following this method allows the successful miRNA profiling from bile samples stored for several years at -80 &#176;C.

Bile fluid is a valuable source of extracellular vesicles/exosomes that contain potentially important biomarkers. This protocol represents a robust method to isolate exosomes from human bile for further analyses including miRNA profiling.

Isolation und Profilierung von microRNA-haltigen Exosomen von Human Bile

Exosome research in the last three years has greatly extended the scope towards identification and characterization of biomarkers and their therapeutic ...

Purification and microRNA Profiling of Exosomes Derived from Blood and Culture Media

Stable miRNAs are present in all body fluids and some circulating miRNAs are protected from degradation by sequestration in small vesicles called exosomes. Exosomes can fuse with the plasma membrane resulting in the transfer of RNA and proteins to the target cell. Their biological functions include immune response, antigen presentation, and intracellular communication. Delivery of miRNAs that can regulate gene expression in the recipient cells via blood has opened novel avenues for target intervention. In addition to offering a strategy for delivery of drugs or RNA therapeutic agents, exosomal contents can serve as biomarkers that can aid in diagnosis, determining treatment options and prognosis.	Here we will describe the procedure for quantitatively analyzing miRNAs and messenger RNAs (mRNA) from exosomes secreted in blood and cell culture media. Purified exosomes will be characterized using western blot analysis for exosomal markers and PCR for mRNAs of interest. Transmission electron microscopy (TEM) and immunogold labeling will be used to validate exosomal morphology and integrity. Total RNA will be purified from these exosomes to ensure that we can study both mRNA and miRNA from the same sample. After validating RNA integrity by Bioanalyzer, we will perform a medium throughput quantitative real time PCR (qPCR) to identify the exosomal miRNA using Taqman Low Density Array (TLDA) cards and gene expression studies for transcripts of interest.	
 These protocols can be used to quantify changes in exosomal miRNAs in patients, rodent models and cell culture media before and after pharmacological intervention. Exosomal contents vary due to the source of origin and the physiological conditions of cells that secrete exosomes. These variations can provide insight on how cells and systems cope with stress or physiological perturbations. Our representative data show variations in miRNAs present in exosomes purified from mouse blood, human blood and human cell culture media.	
 Here we will describe the procedure for quantitatively analyzing miRNAs and messenger RNAs (mRNA) from exosomes secreted in blood and cell culture media. Purified exosomes will be characterized using western blot analysis for exosomal markers and PCR for mRNAs of interest. Transmission electron microscopy (TEM) and immunogold labeling will be used to validate exosomal morphology and integrity. Total RNA will be purified from these exosomes to ensure that we can study both mRNA and miRNA from the same sample. After validating RNA integrity by Bioanalyzer, we will perform a medium throughput quantitative real time PCR (qPCR) to identify the exosomal miRNA using Taqman Low Density Array (TLDA) cards and gene expression studies for transcripts of interest.
 These protocols can be used to quantify changes in exosomal miRNAs in patients, rodent models and cell culture media before and after pharmacological intervention. Exosomal contents vary due to the source of origin and the physiological conditions of cells that secrete exosomes. These variations can provide insight on how cells and systems cope with stress or physiological perturbations. Our representative data show variations in miRNAs present in exosomes purified from mouse blood, human blood and human cell culture media

The presence of stable microRNAs (miRNAs) in exosomes has generated immense interest as a novel mode of intercellular communication, for their potential utility as biomarkers and as a route for therapeutic intervention. Here we demonstrate exosome purification from blood and culture media followed by quantitative PCR to identify miRNAs being transported.

Reinigung und microRNA Profiling von Exosomen aus Blut und Kultur Medien Abgeleitet

Stable miRNAs are present in all body fluids and some circulating miRNAs  are protected from degradation by sequestration in small vesicles called  ...

Biologie

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the immune system. Perturbation of the healthy gut microbiome has been suggested to play a role in the development of inflammatory diseases, including multiple sclerosis (MS). Environmental and genetic factors can influence the composition of the microbiome; therefore, identification of microbial communities linked with a disease phenotype has become the first step towards defining the microbiome&#8217;s role in health and disease. Use of 16S rRNA metagenomic sequencing for profiling bacterial community has helped in advancing microbiome research. Despite its wide use, there is no uniform protocol for 16S rRNA-based taxonomic profiling analysis. Another limitation is the low resolution of taxonomic assignment due to technical difficulties such as smaller sequencing reads, as well as use of only forward (R1) reads in the final analysis due to low quality of reverse (R2) reads. There is need for a simplified method with high resolution to characterize bacterial diversity in a given biospecimen. Advancements in sequencing technology with the ability to sequence longer reads at high resolution have helped to overcome some of these challenges. Present sequencing technology combined with a publicly available metagenomic analysis pipeline such as R-based Divisive Amplicon Denoising Algorithm-2 (DADA2) has helped advance microbial profiling at high resolution, as DADA2 can assign sequence at the genus and species levels. Described here is a guide for performing bacterial profiling using two-step amplification of the V3-V4 region of the 16S rRNA gene, followed by analysis using freely available analysis tools (i.e., DADA2, Phyloseq, and METAGENassist). It is believed that this simple and complete workflow will serve as an excellent tool for researchers interested in performing microbiome profiling studies.

Described here is a simplified standard operating procedure for microbiome profiling using 16S rRNA metagenomic sequencing and analysis using freely available tools. This protocol will help researchers who are new to the microbiome field as well as those requiring updates on methods to achieve bacterial profiling at a higher resolution.

Mikrobiota-Analyse mit zweistufiger PCR- und 16S-rRNA-Gensequenzierung der nächsten Generation

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

Ticks are important ectoparasites that can vector multiple pathogens. The salivary glands of ticks are essential for feeding as their saliva contains many effectors with pharmaceutical properties that can diminish host immune responses and enhance pathogen transmission. One group of such effectors are microRNAs (miRNAs). miRNAs are short non-coding sequences that regulate host gene expression at the tick-host interface and within the organs of the tick. These small RNAs are transported in the tick saliva via extracellular vesicles (EVs), which serve inter-and intracellular communication. Vesicles containing miRNAs have been identified in the saliva of ticks. However, little is known about the roles and profiles of the miRNAs in tick salivary vesicles and glands. Furthermore, the study of vesicles and miRNAs in tick saliva requires tedious procedures to collect tick saliva. This protocol aims to develop and validate a method for isolating miRNAs from purified extracellular vesicles produced by ex vivo organ cultures. The materials and methodology needed to extract miRNAs from extracellular vesicles and tick salivary glands are described herein.

Isolation of microRNAs from Tick Ex Vivo Salivary Gland Cultures and Extracellular Vesicles

The present protocol describes the isolation of microRNAs from tick salivary glands and purified extracellular vesicles. This is a universal procedure that combines commonly used reagents and supplies. The method also allows the use of a small number of ticks, resulting in quality microRNAs that can be readily sequenced.

Isolierung von microRNAs aus Zecken-Ex-vivo-Speicheldrüsenkulturen und extrazellulären Vesikeln

Ticks are important ectoparasites that can vector multiple pathogens. The salivary glands of ticks are essential for feeding as their saliva contains many ...