פרוטוקול זה הוא משמעותי משום שהוא מאפשר הפלה וביטוי יתר של גנים בדג מתפתח, ואת הכמות של אלה השפעות במורד הזרם על תאי הדם. פרוטוקול זה מהיר, קל לביצוע, חסכוני וקל לאוטומציה עם גישה למכשור הנכון. הדגמת הליך זה תהיה קריסטן רוב, חוקרת לתואר ראשון במעבדה.
התחל על ידי העברת בין חמש ל 200, 48 שעות לאחר הפריה עוברים לתוך צלחת פלסטיק 10 ס"מ פטרי. להטות את המנה כך העובר לשקוע לקצה התחתון, ולהסיר כמה שיותר E3 בינוני מן המנה ככל האפשר. לאחר מכן להוסיף 500 מיקרוליטרים של פרוטאז dechorionation לעוברים.
לאחר חמש דקות בטמפרטורת החדר, להטות את כל העוברים לקצה התחתון של הצלחת שוב בעדינות להקיש על הצד של המנה, המאפשר לעוברים לשפשף בעדינות על החלק התחתון של הצלחת כדי להסיר לחלוטין את chorions שלהם. באמצעות בקבוק לסחוט להוסיף כ 20 מיליליטר של E3 בינוני כדי לדלל את הפרוטאז, ולאפשר לעוברים להתיישב. ואז decant המדיום, ולשטוף את העוברים שלוש פעמים נוספות עם מדיום טרי כפי שהוכח רק כדי להסיר את כל העקבות של פרוטאז.
כדי להכין את העוברים לניתוק, השתמש בפיפט P1000 כדי להעביר חמישה עד עשרה עוברים לצינור צנטריפוגה אחד, 1.5 מיליליטר מיקרו, ושואף את המדיום E3 שהועבר. לאחר מכן הוסיפו מיליליטר אחד של 10 מילימולאר DTT במדיום E3 לדג הזברה העוברי, והניחו את צינור המיקרוצנטריפוגה במצב אופקי במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר כדי להסיר את ציפוי הריר. לניתוק עוברים, שטפו את העוברים שטופלו ב-DTT שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של DPBS בתוספת סידן ומגנזיום לכביסה.
לפני הוספת 500 מיקרוליטרים של DPBS בתוספת סידן ומגנזיום, וחמישה microliters של חמישה מיליגרם למיליליטר, פרוטאז דיסוציאציה. ואז להדגיר את הדגימות ב 37 מעלות צלזיוס על שייקר מסלולי אופקי ב 185 מהפכות לדקה במשך 60 דקות. הקפד לבדוק מעת לעת על העוברים, כך שאתה לא מעל לעכל אותם.
כאשר מדגם לא הומוגני לחלוטין עם כמה רקמה מוצקה נוכח ניתן לראות, triturate העוברים עם P1000 פיפטה עד המדגם מנותק לחלוטין. כדי להכין את התאים העובריים של זברה-דג מנותקים לציטומטריית זרימה, העבירו את כל דגימת התא למאגר העליון של צינור תחתונה עגול של 5 מיליליטר פוליסטירן, עם כובע מסננת תאים של 35 מיקרומטר. לשטוף את הכובע עם ארבעה מיליליטר של PBS ללא סידן או מגנזיום, וכדור התאים על ידי צנטריפוגה.
ואז resuspend התאים ב 500 מיקרוליטרים של PBS ללא סידן ומגנזיום לכל צינור. לניתוח ציטומטרי זרימה של תאים עובריים זברה, בעדינות מערבולת התא השעיות לפני הוספת דילול של אחד לאלף של כתם תא מת אדום לכל צינור. תוך 30 דקות מיישום כתם התא המת, רוקנו את מיכל הפסולת, מלאו את מיכל הנדן בתמיסה המתאימה, והתחילו את המערכת הנוזלית של ציטומטר הזרימה.
בתוכנת הניתוח, צייר חמש חלקות והגדר את העלילה הראשונה למדידה קדימה לעומת פיזור צדדי. הגדר את הפיזור קדימה ליניארי, ואת פיזור הצד ללוגריתמי. הגדר את החלקה השניה כך תמדוד גובה פיזור קדימה לעומת רוחב פיזור קדימה, ואת החלקה השלישית למדידת גובה הפיזור לעומת רוחב הפיזור הצדדי.
הגדר את העלילה הרביעית כדי למדוד את כתם התא המת האדום על ציר ה- x, ואת פיזור הצד על ציר y כדי לאפשר אפליה של חיים מתאים מתים. העלילה החמישית צריכה להיות מוגדרת כדי למדוד את הפלואורופור של בחירה. כאשר כל ההתוויות הוגדרו, טען את הדגימה על הסייטומטר והפחת את קצב הזרימה כך שהתאים לא ייגמרו במהירות.
התאם את הגדרות הפיזור קדימה וצד כך שניתן יהיה לצפות בבירור בחלק הארי של אוכלוסיית התאים, וצייר שער סביב אוכלוסיית התאים. תייג את תאי השער האלה. עם עלילת הנקודה השנייה מגודרת על התאים, שער על פיזור קדימה ואת סינגלים פיזור בצד כדי לא לכלול כפילויות.
בחלקה הרביעית, להתאים את הגדרות כתם התא המת האדום, כך שיש אוכלוסייה שלילית בבירור. צייר שער סביב תאים אלה ולתייג את השער הזה תאים חיים. בחלקה החמישית, שער על התאים החיים ולצייר שער סביב התאים החיוביים, ואז להפעיל כל מדגם איסוף לפחות 25, 000 אירועים תא חי.
כאשר כל הדגימות נותחו, בצע את הליך הכיבוי כדי לכבות את fluidics, למלא את מיכל נדן ולרוקן את מיכל האשפה. לאחר ניתוח אחוז תאי הדם האדומים החיוביים של GFP מכל דגימת זברה עוברית, ניתן לחשב את הממוצע של כל קבוצת הביקורת. בדרך כלל, הממוצע מוגדר כאחד וכל האחוזים מחושבים מנקודת התייחסות זו.
בניתוח מייצג זה, נקבע כי הפחתת תעתיק ISM1 עם מורפולינו ספציפי, להפחית את מספר תאי הדם האדומים החיוביים GFP נוכח בתוך 48 שעות לאחר הפריה עוברים. הצלת ירידה זו ברמות מורפולינו ISM1 עם mRNA אקסוגני, להחזיר את מספר תאי הדם האדומים לנורמלי. עיכול נכון על הדגימות הוא קריטי.
אם אתה מעכל יתר על הערך או מעכל, לא תקבל את התוצאות הנכונות. אם מכשיר פקס זמין, החוקרים יכולים לאסוף את תאי הדם על ידי מיון עבור תרבות במבחנה, רצף RNA ו RT-PCR כמותי.
