ICO, או ICO-seq הוא ההתאמה הראשונה של רצף RNA בתפוקה גבוהה למיקרואורגניזמים. שיטה זו העריכה את התפקוד המיקרוביאלי בקנה מידה גנום רחב. עבור מיקרואורגניזמים מהונדסים, שיטה זו יכולה להבהר כיצד שינויים בגנום המיקרוביאלי יכולים לטרטר את תפקודיו.
להשיג שמרים מתרבות השעיה, ולספירת התאים באמצעות hemocytometer. להשעות מחדש את התאים PBS בריכוז של כ 750, 000 תאים למיליליטר. לאחר מכן, מערבבים נקודת התכה אולטרה-נמוכה התעוררו ב- PBS, ומחממים את התערובת ב -90 מעלות צלזיוס, עד שהתעוררות נמסה.
טוענים את תערובת ההתעוררות למזרק, עם מסנן 0.22 מיקרון מצורף. מניחים משאבת מזרק מול תנור חלל להגדיר 80 מעלות צלזיוס ולה מניחים את המזרק במשאבה. ממלאים מזרק שני בהשעיית השמרים, וממלאים מזרק שלישי בשמן פלואורי, עם 2% פלואורו-אורפקט יוני.
העמיסו את שני המזרקים לתוך משאבות המזרק. חבר את הצינורות מהמזרקים למכשיר A.Place צינור חרוט 15 מיליליטר בדלי קרח, ולהנחות את צינור השקע לתוך הצינור חרוט. הגדר את קצב הזרימה עבור כל מזרק, ולאסוף כמיליליטר אחד של אמולסיה בצינור חרוט 15 מיליליטר.
לאחר המתנה של חמש דקות עד שהתעוררה בצינור, הוסיפו נפח שווה של 20% פרפלואורו-אוקטנול בשמן פלואורי לאמולסיה. מערבבים את אמולסיה ואת perfluoro-octanol על ידי היפוך הצינור חרוט כמה פעמים. צנטריפוגה אמולסיה שבורה ב 2, 000 פעמים G במשך שתי דקות.
ודא הידרוג'ל יש גלולות מעל שלבי שמן ו- PFO. הסר את שלבי השמן וה- PFO. הוסף שני מיליליטר של מאגר tet(W) כדי להשעות מחדש את ההידרוגלים.
העבר את ההשעיה לצינור חרוט חדש של 15 מיליליטר. צנטריפוגה הצינור שוב ב 2, 000 פעמים G במשך שתי דקות. הסר את העל-טבעי והשהה מחדש את ההידרוגלים ב- tet(W)again.
לאחר ספינינג במורד הידרוג'ל ב 2, 000 פעמים G במשך שתי דקות, להשעות מחדש את הידרוג'לים בשני מיליליטר של תרבות שמרים בינוני. דגירה הצינור לילה ב 30 מעלות צלזיוס, עם רעידות. כל זנים גדלים בשיעורים שונים.
בחירת זמן מדיה ודגירה מתאים היא חיונית כדי להבטיח כי השמרים לגדול בתוך הידרוג'ל, אבל לא לגדול יתר על כן, המוביל תאים לברוח לתוך התקשורת. ראשית, להעביר את הידרוג'ל לצינור חרוט 15 מיליליטר. צנטריפוגה הצינור ב 2, 000 פעמים G במשך שתי דקות.
לשטוף את הידרוג'לים פעמיים עם PBS ולאחר מכן פעם אחת במאגר spheroplasting. בצע דילול פי 40 של אנזים spheroplasting במאגר spheroplasting. לאחר מכן, להוסיף מיליליטר אחד של האנזים מדולל הידרוג'לים.
דגירה הצינור של הידרוג'ל ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. השמרים המטופלים ייראו שקופים יותר. מהצינור המכיל את ההשעיה הידרוג'ל, למשוך 0.8 מיליליטר של ההשעיה מתחתית הצינור, ולהעביר אותו למזרק אחד מיליליטר לא מנוצל.
מניחים את המזרק במחזיק המזרק המודפס בתלת-ממד. צנטריפוגה המזרק והמחזיק ב 2,000 פעמים G במשך שתי דקות. לפני שתמשיך, ודא כי הידרוג'ל ארוזים היטב בחלק התחתון של המזרק.
מניחים 240, 000 בחנוזי טיפה-סק בצינור חרוט 15 מיליליטר. צנטריפוגה הצינור ב 1, 000 פעמים G לדקה אחת. הסר את supernatant, ולהשעות מחדש את חרוזים בשני מיליליטר של חיץ תזה שמרים 0.9x, עם 500 מילימולר נתרן כלורי.
מכניסים בר ערבוב, ומעבירים את ההשעיה של חרוז למזרק של שלושה מיליליטר. הכינו מזרק נוסף, המכיל כמה מיליליטר של חומר שטח PFPE-PEG בשמן פלואורי. השג את המזרק שהוכן בעבר של שיבוט שמרים הידרוג'ל ארוז.
לפנות את ראש הזיכוי, ולכסות את המזרק. הכנס את שלושת המזרקים, ההידרוגלים, מתלי חרוזים, ואת השמן למשאבות מזרק. חבר את המזרקים באמצעות צינורות למכשיר B, התקן אנקפסולציה.
מניחים את קצה צינור השקע לתוך צינור חרוט 50 מיליליטר על קרח. הגדר את קצב הזרימה עבור כל מזרק. לאסוף כ 1, 000 מיליליטר של אמולסיה, או להפעיל את המכשיר עד שלא נותרו הידרוג'לים.
לאחר מכן בצע את פרוטוקול רצף הירידה עבור סינתזת cDNA, הכנת ספריה וריווח. באמצעות מכשיר מיקרופלואידי, תאי שמרים היו אנקפסולציה טיפות 160 מיקרומטר. מפצל פי שמונה חילק את טיפות אלה לשמונה טיפות 60 מיקרומטר.
הדגירה הלילית גרמה למושבות שמרים איזוגניות לגדול בתוך חלק מההידרוגלים. לפני טעינת הידרוג'ל השמרים לתוך המכשיר microfluidic השני, הם נשטפו ושקעו בתמיסה לעכל את קירות התא. עיכול נכון אומת על ידי מיקרוסקופיה, עם תאי שמרים מטופלים שיש מורפולוגיה רפלקטיבית יותר.
זרם של חבילות לכידת mRNA במאגר תיזה היה מעורבב עם זרם של הידרוג'ל שמרים קרוב לפני צומת טיפה עושה של המכשיר microfluidic השני. באמולסה שנוצרה, כ-10% מהטפות שנאספו הכילו חרוז אחד עם מושבה lysed. זרימת עבודה זו של רצף מושבה isogenic שימש כדי לנתח את התגובה מיתוג אטום לבן של C.albicans.
הרכיב העיקרי, המחשב האישי, הניתוח והפחתת ממדי tSNE הצביעו על קונקורדיות כללית בין ערכת הנתונים לדוגמה לבין ערכת נתוני הפניה. ניתוח TSNE חשף שלושה אשכולות של תאים. בעוד אשכול 2 היה מורכב בעיקר של תאים מתוך ערכת הנתונים לדוגמה, אשכולות אפס ואחד היו מורכבים תאים משתי הדגימות.
שכבת-על של ביטוי WH11 ב- tSNE הצביעה על כך שאשכול אחד הכיל ככל הנראה מושבות לבנות. ביטוי STF2 גדל באשכול אחד, בהתאם לנתונים שהושגו בעבר. באשכולות אפס ושניים, WH11 ו- STF2 היו מוסדרים באופן משמעותי בהשוואה לאשכול 1.
למיקרואורגניזמים אנדרוגנים יש פוטנציאל הולך וגדל לייצור ביולוגי המוני לטיפול במגוון רחב של מחלות. בעקבות הליך זה, ניתן ליישם מגוון כלים ביואינפורמטיים כדי לנתח עוד יותר את נתוני רצף.
