ICO, ou ICO-seq est la première adaptation du séquençage de l’ARN à haut débit aux microbes. Cette méthode a évalué la fonction microbienne à l’échelle du génome. Pour les microbes d’ingénierie, cette méthode peut élucider comment les changements au génome microbien peuvent perturbant ses fonctions.
Obtenir de la levure à partir d’une culture de suspension, et compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Suspendre à nouveau les cellules de PBS à une concentration d’environ 750 000 cellules par millilitre. Ensuite, mélanger le point de fusion ultra-bas agarose en PBS, et chauffer le mélange à 90 degrés Celsius, jusqu’à ce que l’agarose fonde.
Charger le mélange d’agarose dans une seringue, avec un filtre attaché de 0,22 micron. Placez une pompe à seringues devant un chauffe-espace réglé à 80 degrés Celsius et placez la seringue dans la pompe. Remplir une deuxième seringue avec la suspension de levure, et remplir une troisième seringue avec de l’huile fluorée, avec 2% de fluorosurfactant ionique.
Chargez les deux seringues dans les pompes à seringues. Connectez le tube des seringues à l’appareil A.Placez un tube conique de 15 millilitres dans un seau à glace et guidez le tube de sortie dans le tube conique. Réglez le débit de chaque seringue et recueillez environ un millilitre d’émulsion dans le tube conique de 15 millilitres.
Après avoir attendu cinq minutes que l’agarose dans le tube se fixe, ajouter un volume égal de 20% perfluoro-octanol dans l’huile fluorée à l’émulsion. Mélanger l’émulsion et le perfluoro-octanol en inversant le tube conique à quelques reprises. Centrifugeuse l’émulsion cassée à 2000 fois G pendant deux minutes.
Assurez-vous que les hydrogels ont granulé au-dessus des phases d’huile et de PFO. Retirer les phases d’huile et de PFO. Ajouter deux millilitres de tampon tet(W) pour suspendre à nouveau les hydrogels.
Transférer la suspension dans un nouveau tube conique de 15 millilitres. Centrifugez le tube à nouveau à 2000 fois G pendant deux minutes. Retirer le supernatant et suspendre à nouveau les hydrogels dans le tet(W).
Après avoir fait tourner les hydrogels à 2000 fois G pendant deux minutes, suspendez les hydrogels en deux millilitres de milieu de culture de levure. Incuber le tube pendant la nuit à 30 degrés Celsius, avec des secousses. Chaque souche pousse à des rythmes différents.
Le choix d’un média approprié et le temps d’incubation est essentiel pour s’assurer que la levure se développent dans l’hydrogel, mais ne pas dépasser, conduisant à des cellules s’échappant dans les médias. Tout d’abord, transférer les hydrogels dans un tube conique de 15 millilitres. Centrifuger le tube à 2000 fois G pendant deux minutes.
Laver les hydrogels deux fois avec PBS, puis une fois dans le tampon sphéroplasting. Effectuer une dilution 40x de l’enzyme sphéroplasting dans le tampon sphéroplasting. Ensuite, ajouter un millilitre de l’enzyme diluée aux hydrogels.
Incuber le tube d’hydrogels à 37 degrés Celsius pendant une heure. La levure traitée aura l’air plus transparente. Du tube contenant la suspension hydrogel, retirez 0,8 millilitres de la suspension du fond du tube et transférez-la à une seringue non plafonnée d’un millilitre.
Placez la seringue dans le porte-seringue imprimé en 3D. Centrifugeuse de la seringue et du support à 2000 fois G pendant deux minutes. Avant de procéder, assurez-vous que les hydrogels sont bien emballés au fond de la seringue.
Placer 240 000 perles de goutte-seq dans un tube conique de 15 millilitres. Centrifuger le tube à 1000 fois G pendant une minute. Retirer le supernatant et suspendre à nouveau les perles en deux millilitres de tampon de lyse de levure de 0,9 x, avec du chlorure de sodium de 500 millimlaires.
Insérez une barre de remue-remuer et transférez la suspension de la perle sur une seringue de trois millilitres. Préparer une autre seringue contenant plusieurs millilitres de surfactant PFPE-PEG dans de l’huile fluorée. Obtenez la seringue précédemment préparée des hydrogels emballés de clone de levure.
Évacuez la tête d’acquiescement et capuchonez la seringue. Insérez les trois seringues, les hydrogels, la suspension de perle et l’huile dans les pompes à seringues. Connectez les seringues par tube à l’appareil B, le dispositif d’encapsulation.
Placer l’extrémité du tube de sortie dans un tube conique de 50 millilitres sur la glace. Réglez le débit de chaque seringue. Recueillir environ 1000 millilitres d’émulsion, ou faire fonctionner l’appareil jusqu’à ce qu’il n’y ait plus d’hydrogels.
Suivez ensuite le protocole drop-seq pour la synthèse cDNA, la préparation de la bibliothèque et le séquençage. À l’aide d’un dispositif microfluidique, les cellules de levure ont été encapsulées dans des gouttelettes de 160 micromètres. Un séparateur de huit fois a divisé ces gouttelettes en huit gouttelettes de 60 micromètres.
L’incubation pendant la nuit a entraîné la croissance de colonies de levure isogéniques dans certains hydrogels. Avant de charger les hydrogels de levure dans le deuxième dispositif microfluidique, ils ont été lavés et immergés dans une solution pour digérer les parois cellulaires. La digestion appropriée a été vérifiée par microscopie, avec les cellules traitées de levure ayant une morphologie plus réfléchissante.
Un flux de perles de capture de l’ARNm dans le tampon de lyse a été mélangé avec un flux d’hydrogels de levure à emballage rapproché avant la jonction de drop-making du deuxième dispositif microfluidique. Dans l’émulsion qui en a résulté, environ 10 % des gouttelettes recueillies contenaient une perle avec une colonie lysée. Ce flux de travail isogénique de séquençage de colonie a été employé pour analyser la réponse opaque blanche de commutation de C.albicans.
Le composant principal, le PC, l’analyse et une réduction de la dimensionnalité tSNE ont indiqué une concordance générale entre l’ensemble de données de l’échantillon et un ensemble de données de référence. L’analyse de TSNE a indiqué trois faisceaux de cellules. Alors que le deuxième groupe était principalement composé de cellules de l’ensemble de données de l’échantillon, les grappes zéro et une étaient composées de cellules provenant des deux échantillons.
La superposition de l’expression WH11 sur le tSNE indiquait que le groupe un contenait probablement des colonies blanches. L’expression STF2 a augmenté dans le premier groupe, ce qui correspond aux données précédemment obtenues. Dans les grappes zéro et deux, WH11 et STF2 ont été considérablement moins réglementés que le premier groupe.
Les microbes androgènes ont un potentiel sans cesse croissant pour produire en masse des produits biologiques pour le traitement d’une grande variété de maladies. Après cette procédure, on peut appliquer une variété d’outils bioinformatiques pour analyser plus en détail les données de séquençage.
