פרוטוקול זה הוא השיטה היעילה והחסכונית ביותר לתיוג מדויק של לוחות בטא עמילואיד, בהשוואה לנוגדנים ספציפיים לאמילואיד, שהם כיום תקן הזהב לתיוג לוחות אלה. טכניקה זו לוקחת פחות זמן והיא יעילה באותה מידה כמו כל אחת משיטות תיוג עמילואיד הנפוצות. כורכומין נקשר בחוזקה ללוחות עמילואיד והוא יכול לשמש כגשוש הדמיה במהלך סריקות PET של המוח להקרנות פולשניות יחסית באמצעות סריקת רשתית.
כורכומין נקשר גם לסבך נוירופיברילי או טאו במחלת אלצהיימר, אלפא סינוקליין במחלת פרקינסון, וחלבונים מוטנטים של הנטינגטון במחלת הנטינגטון. הדגמת ההליך עם Panchanan Maiti יהיה זאקרי באוורס, סטודנט לתואר שני, ואלכסנדרה פלמונס, מדען מחקר מהמעבדה שלי. לאחר אישור חוסר תגובה רפלקס כאב בעכבר מודל מחלת אלצהיימר בן 12 חודשים, מניחים את העכבר בתמורת סופין על מגש ניתוח ולעשות חתך לתוך הבטן ודרך הסרעפת.
הכנס מחט זלולה 21 מד לתוך החתך ולעשות חתך קטן על auricle הימנית כדי לאפשר לנוזל זלולה לנקז מהגוף. השתמש במערכת זלוש כבידה המוזנים כדי לאפשר קר כקרח 0.1 נוזל PBS טוחן לזרום לתוך המחט במשך חמש עד שש דקות בקצב זרימה של 20 עד 25 מיליליטר לדקה. אם תדלוק מבוצע כראוי, כבד ברור יצפה.
חיסון נכון של בעלי חיים הוא חיוני כי אם הדם לא יוסר לחלוטין, כורכומין עלול להיקשר לכלי הדם וכתוצאה מכך אות רקע פלואורסצנטי ירוק. כאשר כל PBS נמסר, להעביר את שסתום החיץ לתספורת קר כקרח 4% paraformaldehyde במשך שמונה עד 10 דקות לפני השימוש מספריים ומדפים כדי לשחרר את המוח מהגולגולת. לאחר מכן השתמשו במתית כדי למקם את המוח בבקבוקון של 4% paraformaldehyde לפחות פי 10 מנפח הרקמה לאחסון של ארבע מעלות צלזיוס עד לעיבוד.
כדי להשיג קטעים לניתוח קריוסטט, לטבול ברצף את המוח בפתרונות סוכרוז מדורגים בארבע מעלות צלזיוס במשך 24 שעות לריכוז לפני השימוש cryostat ב שלילי 22 מעלות צלזיוס כדי לקבל 40 מקטעי מיקרומטר, הצבת 10 עד 20 קטעים ל הבאר בצלחת שש באר המכיל PBS בתוספת 0.02% azide כפי שהם מתקבלים. לאחר שכל הדגימות נרכשו, אחסן את החלקים בארבע מעלות צלזיוס עד לעיבוד נוסף. כדי להשיג קטעים עבור ניתוח פרפין, לייבש רקמת המוח מנוון פוסט קבוע עם פתרונות אלכוהול מדורגים רציפים במשך שעתיים לריכוז, ואחריו שתי שעה אחת 100% אלכוהול טבילות ושתי טבילות קסילן שעה אחת בטמפרטורת החדר.
לאחר טבילת הקסילן האחרונה, לחדור את הרקמה עם קסילן אחד לאחד תווי פרפין פעמיים במשך שעה אחת לכל דגירה ב 56 מעלות צלזיוס בזכוכית חרוטית מכוסה רדיד אלומיניום לפני טבילת הרקמות ב 56 מעלות צלזיוס פרפין במשך ארבע עד שש שעות. בסוף הדגירה, להשתמש microtome סיבובי בטמפרטורת החדר כדי לקבל חמישה חלקים עבים מיקרומטר הצבת החלקים באמבט מים רקמת צלזיוס 45 מעלות כפי שהם נאספים. לתיוג כורכומין של לוחות עמילואיד בטא בקטעי רקמת קריוסטט, יש לשטוף את החלקים ב-PBS שלוש פעמים במשך חמש דקות לכביסה לפני שאתנו את החלקים ב-70% אתנול לשתי דקות בטמפרטורת החדר.
בעוד החלקים הם דגירה, להמיס מילימול אחד של כורכומין מלאי במתנול לדלל את הפתרון לריכוז עבודה סופי של 10 micromolar עם 70% אתנול. בסוף הדגירה, לטבול את החלקים בתסכום כורכומין עובד במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ב 50 סיבובים לדקה. בסוף תקופת הכתמים, להשליך את תסכול הכורכומין ולשטוף את החלקים עם שלוש שתי דקות שטיפות 70%אתנול.
לאחר הכביסה האחרונה, מעבירים את החלקים לשקופיות זכוכית מצופות פולינזין ומעבירים החלקת כיסוי על כל שקופית עם מדיום הרכבה אורגני מתאים. לאחר מכן הצג את הסעיפים במיקרוסקופ של florescence באמצעות מטרה של 10 או 20x ומסנני העירור וההפחתה המתאימים. לתיוג היסטוכימי של מקטעי רקמות פרפיניים עמוקים, טובלים את חמשת החלקים העבים של המיקרומטר בקסילן פעמיים במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר לטבילה, ולאחר מכן התייבשות עם טבילות בתווית אלכוהול דקה אחת.
בסוף הדגירה, לשטוף את החלקים עם פתרונות אלכוהול מדורגים במשך שתי דקות לריכוז ואחריו ניקוי עם שתי טבילות קסילן חמש דקות. לאחר טבילת הקסילן השנייה, הר כל קטע בשקופית מיקרוסקופ עם תלוש כיסוי ואמצעי הרכבה מתאים להדמיית מיקרוסקופיית פלורסנס כפי שהוכח. לתיוג של דגימות סעיף קריוסטט עם נוגדנים נגד A-beta, לשטוף את הדגימות שלוש פעמים עם PBS טרי לשטוף בארות בודדות של צלחת 12 באר לפני חסימת כל כריכה לא ספציפית עם 10% נורמלי סרום עזים PBS ו 0.5% טריטון x-100 במשך שעה בטמפרטורת החדר.
בסוף הדגירה, להשליך את פתרון החסימה דגירה הדגימות עם נוגדן ספציפי a-beta לילה בארבע מעלות צלזיוס ו 150 סיבובים לדקה. למחרת בבוקר, לשטוף את החלקים עם שלוש 10 דקות שטיפות PBS טרי לכל לשטוף, ואחריו דגירה עם נוגדן משני מתאים גדוש פלואורופור אדום במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר מוגן מפני אור. בסוף הדגירה, לשטוף את החלקים שלוש פעמים עם PBS ואחריו לשטוף אחד עם 70% אלכוהול.
לאחר שטיפת האלכוהול, הדגירה את החלקים עם כורכומין 10 מיקרומולרי במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ואחריו שלוש דקות 70% אלכוהול שוטף. לאחר הכביסה האחרונה, לייבש את החלקים עם 90%ו 100% אלכוהול במשך דקה אחת לכל ריכוז ולנקות את החלקים פעמיים במשך חמש דקות לטבילה עם קסילן טרי לכל דגירה. לאחר מכן תן ודמיין את המקטעים כפי שהוכח.
עבור לוקליזציה תאית עמילואיד בטא שיתוף, להכתים את החלקים עם נוגדן בטא אנטי עמילואיד ואחריו כתמים עם כורכומין בטמפרטורת החדר ו 50 סיבובים לדקה מוגן מפני אור כפי שהוכח. בסוף הדגירה, יש להתגשם בצבע גרעיני מתאים למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ו-50 סיבובים לדקה המוגנים מפני אור ואחריו שלוש שטיפות ב-PBS. לאחר מכן הר ודמיין את החלקים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית כפי שהוכח.
למרות הגדלת זמן הדגירה עם כורכומין מעט מגביר את עוצמת הפלואורסצנטיות של לוחות בטא A, מספר הלוחות שנצפו אינו שונה באופן משמעותי בין אחת לחמש דקות של זמן הכתם. כורכומין יכול לשמש כדי להכתים לוחות בטא ו cryosectioned, פרפין מוטבע, ודגימות רקמת מחלת אלצהיימר אנושית. תיוג עם נוגדן ספציפי בטא לפני כתמי כורכומין מגלה כי הכורכומין הוא מקומי לחלוטין עם בטא באותם לוחות שקושרים את הנוגדן.
לאחר הכתמה עם כורכומין שכותרתו אוליגומרים בטא, כורכומין שיתוף לוקליזציה עם אוליגומרים ניתן לראות לוחות בטא. באופן דומה, כורכומין גם שיתוף לוקליזציה עם נוגדן מסוים בטא בחללים תאיים, המאשר כי הכתם יכול תווית בטא תאית A. תיוג כורכומין בולט גם יותר צבעים עמילואיד קונבנציונלי מחייב.
נגזרות כורכומין נמצאו תמציות tumeric תווית לוחות בטא יחסית כורכומין ברקמת המוח מחלת אלצהיימר אנושית ללא קשר לסוג של מדיום הרכבה בשימוש. בנוסף, אותות immunofluorescence כורכומין ועוצמת נגד נשמרים גם לאחר הכתם עם כתמים גרעיניים טיפוסי סמני תאים אחרים. פגשנו כי חלקים קבועים צריכים להיות דקים יותר מ 40 מיקרון.
הליך אימון זה צריך להישמר תחת 30 דקות ואת ריכוז הכורכומין האופטימלי הוא אחד עד שני micromolar. סמנים ביולוגיים מפגרים בהפלה כפולה יכולים להתבצע על אותה רקמה יכולים לספק ספציפיות רבה יותר של אילו סוגים של תאי מוח מאוזנים. בהתחשב בכך כורכומין יכול להפחית את עומס רובד עמילואיד, המנגנונים המדויקים של איך תהליך זה מתרחש נחקר כעת הן ברמה התאית והן ברמה המולקולרית.
