使用天然多酚姜黄素对脑组织淀粉样斑块进行标记和成像

与淀粉样抗体相比，该协议是准确标记β-淀粉样斑块的最有效和最具成本效益的方法，目前淀粉样抗体是标记这些斑块的黄金标准。这种技术需要更少的时间，并且与任何常用的淀粉样标签方法一样有效。姜黄素与淀粉样斑块紧密结合，在大脑 PET 扫描期间用作成像探针，并使用视网膜扫描进行相对非侵入性筛查。

姜黄素还与阿尔茨海默病、帕金森病中的α合成素和亨廷顿舞蹈症中的突变亨廷顿蛋白结合在一起。与潘查南·迈蒂一起演示这个程序的将是研究生扎克里·鲍尔斯和来自我实验室的研究科学家亚历山德拉·普莱蒙斯。在确认麻醉的12个月大的阿尔茨海默氏症模型小鼠对疼痛反射缺乏反应后，将小鼠放在手术托盘上的超前位置，然后通过隔膜将切口切入腹部。

将 21 量量灌注针插入切口，并在右侧尿管上做一个小切口，使灌注液从体内排出。使用重力注入灌注系统，让冰冷 0.1 摩尔 PBS 液体以每分钟 20 到 25 毫升的流速流入针头 5 到 6 分钟。如果灌注正确进行，将观察到一个明确的肝脏。

适当的动物灌注是必不可少的，因为如果血液没有完全去除，姜黄素可能会与血管结合，并产生绿色荧光背景信号。当所有 PBS 已交付后，将缓冲阀切换到冰冷的 4% 半甲醛溶液 8 到 10 分钟，然后使用剪刀和钳子将大脑从头骨中释放出来。然后用铲子将大脑放入4%的半成甲醛小瓶中，至少是组织体积的10倍，储存4摄氏度，直到处理。

为了获得低温分段，请按顺序将大脑浸入分级蔗糖溶液中，每次浓度为24小时，然后使用负22摄氏度的低温热器获得40微米分段，将每井10至20节放在含有PBS的六井板中，并辅以0.02%的azide。获得所有样品后，将部分存放在摄氏四度，直到进一步处理。为了获得石蜡分段，脱水后固定透水脑组织与连续分级酒精溶液每浓度两小时，然后两个一小时100%酒精浸入和两个一小时二甲苯浸入室温。

最后一次二甲苯浸入后，用一对一二甲苯至石蜡溶液两次穿透组织，在56摄氏度的玻璃锥形玻璃中孵育一小时，用铝箔覆盖，然后将组织浸入56摄氏度石蜡中4至6小时。在孵育结束时，在室温下使用旋转微切，获得5微米厚的部分，在收集时将部分放置在45摄氏度的组织水浴中。对于低温统计组织部分淀粉样β斑块的姜黄素标签，每次洗涤用PBS冲洗三次，每次洗涤五分钟，然后将部分浸入70%乙醇中，在室温下煮两分钟。

当这些部分孵育时，将一毫升的库存姜黄素溶解在甲醇中，用70%乙醇稀释溶液，最终工作浓度为10微摩尔。在孵育结束时，将部分浸入工作姜黄素溶液中，在室温下以每分钟 50 次旋转沉浸 10 分钟。在染色期结束时，丢弃姜黄素溶液，用三次两分钟用70%乙醇清洗。

上次洗涤后，将截面转移到聚硅涂层玻璃滑轨上，并使用适当的有机安装介质将盖滑到每个滑轨上。然后使用 10 倍或 20 倍的物镜以及适当的激发和发射过滤器查看荧光显微镜上的部分。对于深石蜡组织部分的组化学标记，将五微米厚的部分浸入二甲苯中两次，在室温下浸入五分钟，然后进行分级一分钟酒精溶液浸入的补液。

在孵育结束时，用分级酒精溶液清洗部分，每次浓度两分钟，然后用两次五分钟二甲苯浸入液清洗。第二次二甲苯浸入后，将每个部分安装到显微镜幻灯片上，并配有适当的安装介质，用于荧光显微镜成像，如所证明的。对于使用抗A-β抗体标记低温分段样品，在12孔板的个别孔中用新鲜PBS清洗样品三次，然后阻断PBS中10%正常山羊血清和0.5%三吨x-100在室温下一小时的非特异性结合。

在孵育结束时，丢弃阻断溶液，在4摄氏度和每分钟150次旋转下，用β特异性抗体孵育样品。第二天早上，每次洗涤用3个10分钟的新鲜PBS清洗，然后用适当的二次抗体与红色荧光团结合孵育，在室温下保持1小时，防止光线。在孵育结束时，用PBS洗三次，然后用70%酒精洗一次。

酒精洗涤后，在室温下用10微摩尔姜黄素孵育10分钟，然后3分钟70%酒精洗涤。上次洗涤后，每次浓缩一分钟，用90%和100%酒精脱水，每次浸入2次，每次浸泡用新鲜的二甲苯清除两次。。然后安装并成像演示的部分。

对于细胞内淀粉样蛋白β共定位，用抗淀粉样β抗体染色部分，随后在室温下用姜黄素染色，每分钟50次旋转，防止光线受到光。在孵育结束时，在室温下用适当的核染料对进行10分钟的反染色，每分钟50次旋转，防止光线，然后用PBS进行三次洗涤。然后安装和成像部分的荧光显微镜，如所示。

虽然用姜黄素增加孵育时间会稍微增加 A beta 斑块的荧光强度，但观察到的斑块数量在一到五分钟的染色时间之间没有显著差异。姜黄素可用于染色一个β斑块和冷冻，石蜡嵌入，和人类阿尔茨海默病组织样本。在姜黄素染色前用β特异性抗体标记表明，姜黄素与结合抗体的同一斑块中与Β完全结合。

使用标有β寡聚物的姜黄素染色后，姜黄素与寡聚物共同定位可以在β斑块中观察到。同样，姜黄素还与细胞内空间中的 A beta 特异性抗体共同本地化，确认该污渍可以标记细胞内 A β。姜黄素标签也比传统的淀粉样结合染料更突出。

姜黄提取物中发现的姜黄素衍生物标签 A beta 斑块相对与人类阿尔茨海默病脑组织中姜黄素，无论使用什么类型的安装介质。此外，姜黄素免疫荧光信号和反染色强度即使在染色与典型的核污渍和其他细胞标记后保持。我们遇到了恒定部分应该比40微米薄。

此训练程序应保持在30分钟以下，最佳姜黄素浓度为1至2微摩尔。双水平迟钝生物标志物可以在同一组织上进行，并可以提供更高特异性的脑细胞类型正在被水平。鉴于姜黄素可以减少淀粉样斑块的负荷，目前正在细胞和分子水平上研究这个过程的精确机制。