הפרוטוקול מאפשר תיוג ספציפי של גרעיני מיטוכונדריה בתאים חיים ואת המחקר הכמותי של תנועתם ברזולוציה גבוהה. הדגירה עם הצבע הפלואורסצנטי רק עוקפת את הצורך בחלבון פלואורסצנטי על פני ביטוי, נמנעת מממצאים ומגבלות קשורים ומאפשרת להחיל את הפרוטוקול שלנו על תאים שאינם ניתנים לניתוק. כדי להשיג כתמי גרעין מועדפים, יש להשתמש זהב SYBR ושום דבר אחר בתנאים שיש לנו אופטימיזציה.
אחרת, ה-DNA התאי הכולל עשוי להיות מוכתם. יום אחד לפני הליך התיוג, תרבות ארבע פעמים 10 לתאי הלה החמישיים בשני מיליליטר של מדיום בצלחת פטרי 35 מ"מ. למחרת בבוקר, לשטוף את התאים בשני מיליליטר של PBS לפני הוספת מיליליטר אחד של פנול אדום תרבות חינם בינוני אחד מיליליטר של פתרון תיוג 2X המתאים.
לאחר 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני, בזהירות שאפו את הצבע המכיל על טבעי מכל צלחת פטרי 35 מ"מ ולשטוף את התאים עם שני מיליליטר של PBS. ואז להאכיל את התאים עם פנול טרי אדום תאים חופשיים תרבות בינוני ולהחזיר את התרבות לחממת תרבות התא מוגן מפני אור עד הדמיה חיה. להדמיית תאים חיים, לפחות שעה לפני מפגש ההדמיה, הנח את החממה העליונה על שלב מיקרוסקופ התאורה המובנה ברזולוציית העל והגדר את הטמפרטורה ל-37 מעלות צלזיוס ואת ריכוז הפחמן הדו-חמצני ל- 5%, הפעל את כל מרכיבי המיקרוסקופ כולל הלייזרים ובחר בהגדלה גבוהה, מטרת טבילה בצמצם מספרי גבוה כפי שהומלץ עבור מיקרוסקופ תאורה מובנה ברזולוציית על ידי יצרן המיקרוסקופ.
כאשר הלייזרים התחממו, התקינו את צלחת פטרי 35 מ"מ על שלב המיקרוסקופ ולהשתמש עיניים כדי לאתר אזור עניין עם תאים מחוברים לתחתית המנה. כדי להשיג תמונות מיקרוסקופיות תאורה מובנות ברזולוציית-על, השתמש במצלמת התקן מרוכבים של מטען מרוכך בקצה האחורי. בתוכנת רכישת התמונה, הגדר רווח גבוה להכפלת אלקטרונים כפי שהומלץ למצלמה.
לפני רכישת סדרת זמן לשגות עבור מעקב גרעין, לרכוש תמונה מיקרוסקופית תאורה מובנית שני צבעים ברזולוציה סופר של אותו שדה מבט בערוץ אחד עבור כתמים מיטוכונדריאלי ועוד אחד עבור זהב SYBR. הגדר את ערוץ צבע התמונה המיטוכונדריאלית לגירוש ו הפליטה המתאימים לכתם המיטוכונדריאלי המשמש והגדר את מסנן הפליטה המתאים של excitation ו- bang Pass עבור צבע הזהב של SYBR. הגדר את כוח הלייזר הנמוך ביותר האפשרי עבור שני הערוצים.
אם המיקרוסקופ רוכש ערוצים ברצף בלבד, כבה את הערוץ לגילוי הכתמים המיטוכונדריאליים. untick תיבת מחסנית Z בתוכנה כדי לכבות את רכישת מחסנית Z כדי להגדיר את הרכישה של מטוס מוקד יחיד ולהגדיר את זמן החשיפה הקצר ביותר האפשרי מצלמה. הגדר שלושה סיבובים של הרשת ורכוש תמונות דו מימדיות של התאים המסווים במספר ערכי כוח לייזר וכמה פעמים חשיפה כדי למטב את כוח הלייזר בזמן החשיפה למצלמה.
בחר את זמני החשיפה של לייזר ומצלמה המניבים תמונות מיקרוסקופיות תאורה מובנות עם כתמים בהירים במיטוכונדריה עם מעט או ללא חפצים ולהתחיל ברכישת סדרת לשגות בזמן באמצעות ההגדרות הממוטבות. לניתוח תמונות לשגות זמן, לפתוח את תמונות מיקרוסקופיה תאורה מובנית המרה ותוכנה לניתוח תמונה מתאימה כי יש מודול מעקב אחר נקודה ולחץ להוסיף כתמים חדשים כדי להפעיל את אשף יצירת כתמים. תחת הכרטיסיה יצירה, לחץ על עקוב אחר נקודות לאורך זמן והמשך לשלב השני של האשף.
הגדר את קוטר ה- x-y המשוער ל- 0.1 עד 0.15 מיקרומטר. לחץ על חיסור רקע והמשך לשלב השלישי באשף. גרור את הקו האנכי בהיסטוגרמה כדי להתאים את סף מסנן האיכות עד שרוב הנוקלאוטידים מזוהים כנקודות בממצאים אינם מזוהים בתוך כל מסגרת.
המשך אל השלב הרביעי והחמישי של האשף ובחר את אלגוריתם התנועה הרגרסיבית האוטומטית. הגדר את המרחק המרבי ל- 0.5 מיקרומטר ואת גודל הפער המרבי לאפס. כאשר הפרמטרים מכווננים היטב מאפשרים לתוכנה לזהות את כל הנקודות ולבנות מסלולים כראוי, לחץ על לחצן החץ עכשיו כדי לאשר את יצירת הרצועות ולחץ על סמל הסטטיסטיקה כדי לחלץ את סטטיסטיקת הרצועות.
לאחר מכן בחרו בפרמטרי הסטטיסטיקה הדרושים ולחצו על 'שמירה בשם' כדי לייצא את הערכים כקבצי CSV של נקודות לכמות ולפריטים חזותיים. תיוג עם ריכוזים גבוהים של זהב SYBR או PicoGreen תוצאות כתמים בשפע של הגרעינים וכתמים punctate בתוך הציטופלסמה. בריכוזים נמוכים יותר, אות זהב SYBR קלוש מופיע בתוך הגרעינים בתבנית של כתמים בהירים נצפתה בתוך הציטופלסמה.
תיוג PicoGreen בריכוזים נמוכים מניב בעיקר כתמים גרעיניים. כתמים בו זמנית עם ריכוזים נמוכים של זהב SYBR בצבע מיטוכונדריאלי אדום רחוק מגלה כי כמעט כל כתמי זהב SYBR מתרחשת בתוך המיטוכונדריה תוך תיוג בריכוזים גבוהים תוצאות כתמים משמעותיים של הגרעינים ציטופלסמה. דימות זמן-Lapse מגלה כי לאחר 45 דקות כתמי הגרעין קרובים לרוויה.
קיבעון גורם לחלוקה מחדש קלה של הצבע לגרעין, בעוד חלחלה של התאים הקבועים מבטלת את דפוס הכתמים המנוקד של המיטוכונדריה ומשפרת את הכתמים הגרעיניים. אם זהב SYBR מתווסף לתאים לאחר קיבעון ו permeablization, אז הצבע מופץ באופן אחיד על פני הציטופלסמה ואת הגרעין וכתוצאה מכך אובדן הספציפיות הכתמים. הדמיה תלת-ממדית של תא חי על-ידי מיקרוסקופ תאורה מובנה ברזולוציית-על חושפת את הגרעין המיטוכונדריאלי כנקודות בהירות בתוך המיטוכונדריה.
מעקב אחר מיקומו של הגרעין ברזולוציה מעבר למגבלת ההתפזרות מראה כי רוב הגרעינים מפגינים תנועות אקראיות למרחקים קצרים שכנראה מוגבלות לרשת המיטוכונדרית. חשוב לציין כי פרוטוקול זה אינו תואם את הקיבעון של המדגם. עם זאת, הפרוטוקול שלנו צריך להיות תואם למגוון רחב של בדיקות מבוססות הדמיה של תאים חיים לחקר מורפולוגיה, דינמיקה ופעילויות של מולקולות ואברונים.
המחקר שלנו ממחיש את היתרונות של ארגון מחדש של צבעים לא אורגניים לטכניקות מבוססות תאים. זה עשוי לעורר את המחקר של צבעים פלואורסצנטיים אחרים עבור היישום שלהם במחקרים הסלולר.
