يسمح البروتوكول وضع العلامات المحددة للنيات الميتوكوندريا في الخلايا الحية والدراسة الكمية لاقتراحها بدقة عالية. الحضانة مع صبغة الفلورسنت يتجاوز فقط الحاجة إلى البروتين الفلورسنت على التعبير، وتجنب التحف ذات الصلة والقيود والسماح لدينا بروتوكول ليتم تطبيقها على الخلايا غير قابلة لtransfectable. لتحقيق تلطيخ نووكلويد تفضيلية، ينبغي للمرء استخدام الذهب SYBR ولا شيء آخر في ظل الظروف التي قمنا الأمثل.
وإلا، قد يكون الحمض النووي الخلوي الكلي ملطخاً. قبل يوم واحد من إجراء وضع العلامات ، والثقافة أربع مرات 10 إلى الخلايا الخامسة HeLa في مليلترين من المتوسط في طبق بيتري 35 ملليمتر. في صباح اليوم التالي، وغسل الخلايا في ملليلترين من برنامج تلفزيوني قبل إضافة ملليلتر واحد من الفينول الأحمر ثقافة حرة المتوسطة وميليلتر واحد من الحل المناسب 2X وضع العلامات.
بعد 30 دقيقة في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون، وpirpirate بعناية صبغة تحتوي على عظمى من كل 35 ملليمتر بيتري الطبق وغسل الخلايا مع مليلتر اثنين من برنامج تلفزيوني. ثم تغذية الخلايا مع الفينول الأحمر الطازجة خلية حرة ثقافة المتوسطة والعودة إلى الثقافة الحاضنة ثقافة الخلية محمية من الضوء حتى التصوير الحي. للتصوير الخلية الحية، على الأقل قبل ساعة من جلسة التصوير، وضع مرحلة حاضنة أعلى على درجة الغمر الغمر الإنارة الفائقة القرار وتحديد درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية وتركيز ثاني أكسيد الكربون إلى 5٪ التبديل على جميع مكونات المجهر بما في ذلك أشعة الليزر واختيار التكبير عالية، وارتفاع فتحة رقمية هدف الغمر كما هو موصى به لمجهر الإضاءة هيكلت فائقة القرار من قبل الشركة المصنعة.
عندما يكون الليزر قد استعدت، تثبيت 35 ملليمتر بتري طبق على مرحلة المجهر واستخدام العين لتحديد منطقة ذات فائدة مع الخلايا تعلق على الجزء السفلي من الطبق. للحصول على فائق القرار هيكلة الصور المجهرية الإضاءة، واستخدام نهاية نهاية عالية نهاية عالية تهمة ضرب آلة شحن مقرونة الكاميرا الجهاز. في برنامج الحصول على الصور، تعيين مكاسب ضرب الإلكترون عالية على النحو الموصى به للكاميرا.
قبل الحصول على سلسلة الفاصل الزمني لتتبع النوى، والحصول على اثنين من لون القرار فائقة هيكلة صورة المجهر الإضاءة من نفس المجال من الرؤية في قناة واحدة لالطاخ الميتوكوندريا وآخر واحد للذهب SYBR. تعيين صورة قناة لون الميتوكوندريا إلى الإثارة المناسبة والانبعاثات لطخة الميتوكوندريا المستخدمة وتعيين الإثارة المناسبة وبانغ تمرير مرشح الانبعاثات لصبغة الذهب SYBR. تعيين أدنى قوة الليزر ممكن لكلا القناتين.
إذا كان المجهر يكتسب القنوات بالتسلسل فقط، إيقاف القناة للكشف عن وصمة عار الميتوكوندريا. قم بفك خانة المربع Z-المكدس في البرنامج لإيقاف عملية الاستحواذ على Z-stack لتعيين الحصول على مستوى بؤري واحد وتعيين أقصر وقت ممكن للتعرض للكاميرا. تعيين ثلاثة دورات من الشبكة والحصول على صور ثنائية الأبعاد من الخلايا المسمى في العديد من قيم الطاقة الليزر وعدة مرات التعرض لتحسين قوة الليزر في وقت التعرض للكاميرا.
حدد قوة الليزر والكاميرا مرات التعرض التي تسفر عن الصور المجهرية الإضاءة منظم مع النقاط المضيئة في الميتوكوندريا مع القطع الأثرية قليلة أو معدومة والبدء في الحصول على سلسلة الفاصل الزمني باستخدام الإعدادات الأمثل. لتحليل الصور الفاصل الزمني، فتح الصور المجهرية الإضاءة المنظمة المحولة وبرنامج تحليل الصور المناسبة التي لديها وحدة تتبع بقعة وانقر فوق إضافة بقع جديدة لبدء تشغيل المعالج إنشاء البقع. ضمن علامة التبويب إنشاء ، انقر فوق تعقب البقع عبر الوقت ثم انتقل إلى الخطوة الثانية من المعالج.
تعيين قطر س ص المقدرة إلى 0.1 إلى 0.15 ميكرومتر. انقر فوق طرح الخلفية ثم انتقل إلى الخطوة الثالثة في المعالج. اسحب الخط العمودي في المدرج التكراري لضبط عتبة مرشح الجودة حتى يتم الكشف عن غالبية النوكليوتيدات كما لا يتم الكشف عن بقع في النتائج داخل كل إطار.
تابع إلى الخطوتين الرابعة والخامسة من المعالج وحدد خوارزمية الحركة التلقائية. تعيين المسافة القصوى إلى 0.5 ميكرومتر والحد الأقصى لحجم الفجوة إلى الصفر. عندما المعلمات ضبطها بدقة تسمح للبرنامج للكشف عن جميع البقع وبناء المسارات بشكل صحيح ، انقر فوق الزر الآن لتأكيد إنشاء المسارات وانقر فوق رمز الإحصاءات لاستخراج الإحصاءات المسارات.
ثم حدد معلمات الإحصاءات اللازمة وانقر على حفظ باسم لتصدير القيم كملفات CSV نقطة للحصول على الكم والتصور. وضع العلامات مع تركيزات عالية من الذهب SYBR أو نتائج PicoGreen في وفرة من تلطيخ النوى وتلطيخ punctate داخل السيتوبلازم. في تركيزات أقل، تظهر إشارة الذهب SYBR باهتة داخل النوى في نمط من النقاط المضيئة ويلاحظ داخل السيتوبلازم.
PicoGreen وضع العلامات بتركيزات منخفضة تسفر في الغالب عن تلطيخ نووي. في وقت واحد تلطيخ مع تركيزات منخفضة من الذهب SYBR في صبغة الميتوكوندريا الحمراء البعيدة يكشف أن ما يقرب من كل من تلطيخ الذهب SYBR يحدث داخل الميتوكوندريا في حين وضع العلامات في تركيزات عالية النتائج في تلطيخ كبير من النوى والسيتوبلازم. يكشف التصوير بالفاصل الزمني أنه بعد 45 دقيقة يقترب تلطيخ النوكلويد من التشبع.
التثبيت يسبب إعادة توزيع طفيف للصبغة إلى النواة، في حين أن الثبات للخلايا الثابتة يزيل نمط تلطيخ منقط من الميتوكوندريا ويعزز تلطيخ النووية. إذا تم إضافة الذهب SYBR إلى الخلايا بعد التثبيت وblmeablization، ثم يتم توزيع الصبغة بشكل موحد عبر السيتوبلازم والنواة مما أدى إلى فقدان خصوصية تلطيخ. التصوير الحي ثلاثي الأبعاد للخلايا بواسطة مجهر الإضاءة المنظم فائق الدقة يكشف عن نوى الميتوكوندريا كنقاط مضيئة داخل الميتوكوندريا.
إن تتبع مواضع النوى بدقة تتجاوز حد الانعراج يدل على أن غالبية النوى تعرض حركات عشوائية قصيرة المسافة ربما تكون محصورة في شبكة الميتوكوندريا. من المهم ملاحظة أن هذا البروتوكول غير متوافق مع تثبيت العينة. ومع ذلك، ينبغي أن يكون لدينا بروتوكول متوافق مع مجموعة واسعة من التصوير الخلية الحية القائمة على أساس المقايسات لدراسة مورفولوجيا، وديناميات وأنشطة الجزيئات والعضيات.
توضح دراستنا مزايا إعادة توجيه الأصباغ غير العضوية للتقنيات القائمة على الخلايا. قد تلهم استكشاف الأصباغ الفلورية الأخرى لتطبيقها في الدراسات الخلوية.
