בביומסה lignocellulosic הפעילות של אנזימים המנתחים פוליסכרידים מוגבלת על ידי קיומן של אינטראקציות לא ספציפיות עם ליגנין. ניתוח FRET הוא גישה רלוונטית לאבולוציה בסולם הננו. קבלת כל החלקים לאחר יכול להיות אתגר בהתאם ביומסה.
קח את הזמן שלך עושה את הסעיף עם microtome ולבצע שטיפה עדינה. איסוף מדידות אורך חיים וספקטרום פלואורסצנטי מאפשר קביעת FRET רגישה כמותית וחד משמעית בין מולקולות ליגנין ו- TAG במקום. שיטה זו משתמשת בטכניקות מסובכות, כמו ניתוח מדגם על רכישת מיקרוסקופיה רב מימדית וניתוח שיכול להיות קל ללמוד עם הדגמה חזותית.
כדי להכין דגימות צמחים מעץ, חיטה, סיבים או שברים, השתמשו בסכיני גילוח כדי לחתוך דגימות ארוכות בסנטימטר אחד מבלי לפגוע במבנה החומר ולמקם את הדגימות תחת ואקום כדי להסיר כל אוויר. להטביע את הדגימות במשך 24 שעות רצופות 30%ו 50% ריכוזים של PEG מדולל במים בטמפרטורת החדר עם ערבוב עדין. ואחריו 24 שעות שקוע בריכוז של 100% PEG ב 70 מעלות צלזיוס.
לאחר טבילת 100%PEG, מניחים את הדגימות בכמוסות על פלטה חמה של 70 מעלות ומקטינים בהדרגה את טמפרטורת הלוח במרווחים של חמש מעלות צלזיוס עד שהצלחת מגיעה לטמפרטורת החדר. כאשר הדגימות התקררו, השתמש במיקרוטום ובלהבים חד פעמיים כדי להשיג בזהירות חלקים שטוחים בעובי 30 עד 60 מיקרומטר מכל בלוק PEG. הסר את PEG מהקטעים עם שלוש חמש דקות מים עדינים שוטף.
לאחר הכביסה האחרונה, דגירה עד שלושה חלקים לצינור עם 500 microliters של בדיקה פלואורסצנטי מוכן טרי במשך 72 שעות מוגן מפני אור. בסוף דגירה ויטראז', להשתמש במברשת כדי להעביר את החלקים לשקופית לפני הרכבה את החלקים בין שקופית זכוכית מספר 1.5H כיסוי להחליק. כדי לקבוע את רוחב החלון הספקטרלי של גלאי SFLIM, מניחים גבישי אוריאה בתיבת תרבות עם תחתית זכוכית 0.17 מיקרומטר וממקמים את התיבה על מחזיק דגימת מיקרוסקופ.
בחר את המטרה 20X לייזר ספיר מנומנם טיטניום עם אורך גל 900 ננומטר ו 2% כוח ולהדליק את הסריקה. לביצוע מדידות SFLIM, העברו את המערכת למצב SFLIM. כדי לאסוף את האות ההרמוני השני בגלאי sFLIM, התאימו בהדרגה את אורך גל העירור בלייזר מ-900 ל-980 ננומטר עד לאסוף את האות ההרמוני השני בערוץ הספקטרלי השני.
לאחר מכן קבע את אורך החלון הספקטרלי. עבור למצב סרוק שאינוD כדי לשלוח פוטונים פלואורסצנטיים לגלאי SFLIM. הגדר את רכישת sFLIM למצב הפוך לזמין כדי לאפשר לפוטון לסמוך על מונה הפוטון הבודד.
כאשר המכשיר מוכן, מניחים קטע צמח בקרה מקורי קש חיטה לבד בין השקופית ואת החלקת המכסה על שלב המיקרוסקופ ולהגדיר את המערכת למצב רציף כדי לאפשר את סריקת הלייזר. הגדר אוסף זמן של 30 שניות ובדוק שמפלה השבר הקבוע הוא בין 10 ל- 10 לרביעית ופעם אחת 10 עד השישית. לאחר מכן בחרו באזור המדידה בדגימה ולחצו על 'התחל'.
בסוף המדידה, שמרו את קובץ ה-sdt וחזרו על המדידה לתשע דגימות נוספות לפחות. יש למצוא איזון בין השגת מספיק פוטונים שנאספו עבור הפוטון תוך הימנעות דופק לקנות את אפקטים המושרה תמונה שיכולים לשנות את חיי florescence. למעלה לנתח את הנתונים sFLIM שנרכשו, לייבא את קש החיטה המקומי לבד קבצי נתונים לתוך תוכנת מונה פוטון יחיד לפתוח אפשרות מצב לבחור לא שלם Multi מעריכי 12.5 ננו שניות.
תחת אפשרויות והעדפות, בחרו 'חשב תגובה אינסטרומנטלית אוטומטית' ובחרו במודל 'התאמה מעריכית'. עבור כל ערוץ, החל את מודל ההתאמה ושמור את פרמטרי ההתאמה בגיליון אלקטרוני. לשם השוואה בין הערוצים והניסויים לחשב את חיי הפלואורסצנטיות העיקריים בגיליון אלקטרוני.
כדי לחשב את אורך החיים הממוצע עבור לפחות 10 דגימות בכל הערוצים, נתח את אורך החיים הפלואורסצנטי העיקרי בערוצים התורמים כדי לקבוע את ערך הערוץ הייעודי שבחר את מספר הפוטון הגבוה ביותר ומתאים לתנוכה המרבית של ליגנין. כדי להשוות את ערכי SFLIM ו- EFRET בין דגימת קש החיטה המקורית של הבקרה לבין מדגם ניסיוני, שקול EFRET חיובי הקשור לירידה הומוגנית לכל החיים בין הפקד לבין הדגימות הניסיוניות שיש לנתח כאירוע FRET. בניסוי מייצג זה, עקומות sFLIM מראות חלק מהשינויים שניתן להשיג בין מדגם הייחוס לבין שני מקרי האינטראקציה.
ואכן, עליית הפלואורסצנטיות באזורים ספקטרליים המתאימים לטווח פליטת רודאמין הם דמיינו בקלות. התבוננות זהירה של שלוש עקומות ריקבון פוטון הערוץ הראשון, גם מגלה פיתול חזק יותר עבור קש חיטה מקומי עם דקסטרין מתויג עם רודאמין, מאשר עבור קש חיטה ילידי דגירה עם PEG מתויג עם רודמין. לאחר התאמת עקומות ריקבון פוטון וחישוב כל ערוץ הראשי פלואורסצנטיות זמן החיים, חתימת FRET הופך להיות ברור יותר.
לדוגמה, בעוד שזמן החיים של הפלואורסצנטיות לחילופין עולה ויצטמצם לאורך הספקטרום הפלואורסצנטי עבור דגימת קש החיטה המקומית, חתימת FRET ברורה נצפית עבור שני חלקי קש חיטה מקומיים עם PEG מתויגים עם רודאמין וקש חיטה מקומי עם דקסטרין מתויג עם דגימות רודמין. בהקשר של הידרוליזה ביומסה lignocellulosic, שיטה זו יכולה בקלות להיות מועברת מחקרים אינטראקציה אנזים בדגימות ביומסה שונות הדורשות אפיון קפדני של כל ביומסה חדשה. מאז SFLIM אינו דורש קיבעון של המדגם הוא סולל את הדרך למחקרי אינטראקציה אנזים דינמי ליגנין והוא עשוי להנחות אסטרטגיות הנדסת אנזימים ביומסה טרום טיפולים.
כמו רוב הזמן, מדידות זמן החיים דורשים שימוש במקורות לייזר אינפרא אדום דופק. יש לנקוט באמצעי הבטיחות המתאימים בהתאם.
