En la biomasa lignocelulósica, la actividad de las enzimas que analizan los polisacáridos está limitada por la existencia de interacciones inespecíficas con lignina. El análisis FRET es un enfoque relevante para la evolución a escala nanométrica. Obtener todas las secciones después puede ser un desafío dependiendo de la biomasa.
Tómese su tiempo haciendo la seccionamiento con el microtoma y realice lavados suaves. La recopilación de mediciones de espectro y vida útil fluorescente permite una determinación cuantitativa sensible e inequívoca de FRET entre moléculas de lignina y TAG in situ. Este método emplea el uso de técnicas complicadas, como la sección de muestras en la adquisición y análisis de microscopía multidimensional que pueden ser fáciles de aprender con una demostración visual.
Para preparar muestras de plantas de madera, trigo, fibras o fragmentos, utilice cuchillas de afeitar para cortar muestras de un centímetro de largo sin dañar la estructura del material y colocar las muestras al vacío para eliminar el aire. Sumerja las muestras durante 24 horas en concentraciones sucesivas del 30% y del 50% de PEG diluidas en agua a temperatura ambiente con agitación suave. Seguido de 24 horas sumergido en una concentración del 100% de PEG a 70 grados centígrados.
Después de la inmersión 100%PEG, coloque las muestras en cápsulas en una placa de 70 grados centígrados y disminuya progresivamente la temperatura de la placa en incrementos de cinco grados centígrados hasta que la placa alcance la temperatura ambiente. Cuando las muestras se hayan enfriado, utilice un microtoma y cuchillas desechables para obtener cuidadosamente secciones planas de 30 a 60 micrómetros de espesor de cada bloque PEG. Retire el PEG de las secciones con tres lavados de agua suave de cinco minutos.
Después del último lavado, incubar hasta tres secciones por tubo con 500 microlitros de sonda fluorescente recién preparada durante 72 horas protegida de la luz. Al final de la incubación de tinción, utilice un cepillo para transferir las secciones a un portaobjetos antes de montar las secciones entre un portaobjetos de vidrio y un patrón de cubierta número 1.5H. Para determinar el ancho de la ventana espectral del detector sFLIM, coloque los cristales de urea en una caja de cultivo con un fondo de cristal de 0,17 micrómetros y coloque la caja en un soporte de muestra de microscopio.
Seleccione el objetivo 20X y un láser de zafiro dopado de titanio con una longitud de onda de 900 nanómetros y 2% de potencia y encienda el escaneo. Para realizar mediciones sFLIM, cambie el sistema al modo sFLIM. Para recoger la segunda señal armónica en el detector sFLIM, ajuste gradualmente la longitud de onda de excitación láser de 900 a 980 nanómetros hasta que se recoja la segunda señal armónica en el segundo canal espectral.
A continuación, determine la longitud de la ventana espectral. Cambie al modo no escaneado no escaneado para enviar fotones fluorescentes al detector sFLIM. Establezca la Adquisición de sFLIM en el modo de activación para permitir el recuento de fotones en el contador de fotones único.
Cuando el instrumento esté listo, coloque una sección de planta de paja de trigo nativa de control entre la diapositiva y el resbalón de la cubierta en la etapa del microscopio y ajuste el sistema al modo continuo para permitir el escaneo láser. Establezca una colección de 30 segundos y compruebe que el discriminador de fracción constante está entre uno por 10 y uno por 10 y el sexto. A continuación, seleccione el área de medición en la muestra y haga clic en Inicio.
Al final de la medición, guarde el archivo sdt y repita la medición para al menos nueve muestras más. Se debe encontrar un equilibrio entre lograr suficientes fotones recogidos para el fotón evitando la compra de pulsos y los efectos de foto inducidas que pueden alterar la vida útil de la florescencia. Analizar los datos sFLIM adquiridos, importar la paja de trigo nativo solo archivos de datos en el software de contador de fotones único y abrir opción y modo para seleccionar Incompleto Multi exponencial 12,5 nanosegundos.
En Opciones y preferencias, seleccione Calcular respuesta instrumental automáticamente y seleccione el Modelo de ajuste exponencial. Para cada canal, aplique el modelo de ajuste y guarde los parámetros de ajuste en una hoja de cálculo. Para una comparación entre los canales y los experimentos, calcule la vida útil principal de la fluorescencia en una hoja de cálculo.
Para calcular la vida útil media de al menos 10 muestras en todos los canales, analice la vida útil del fluorescente principal en los canales de donantes para determinar el valor de canal dedicado que eligió el número de fotón más alto y corresponde a la emisión máxima de lignina. Para comparar los valores sFLIM y EFRET entre la muestra de paja de trigo nativa de control y una muestra experimental, considere una muestra positiva de EFRET asociada con una disminución de la vida útil homogénea entre el control y las muestras experimentales que se analizarán como un evento FRET. En este experimento representativo, las curvas sFLIM muestran algunas de las modificaciones que se pueden lograr entre la muestra de referencia y los dos casos de interacción.
De hecho, el aumento de fluorescencia en las regiones espectrales correspondientes al rango de emisión de Rhodamine se visualizan fácilmente. La observación cuidadosa de las tres primeras curvas de descomposición del fotón de canal, también revela una inflexión más fuerte para la paja de trigo nativo con Dextrina etiquetada con Rhodamine, que para la paja de trigo nativo incubada con PEG etiquetada con Rhodamine. Después de ajustar las curvas de descomposición del fotón y calcular el tiempo de vida de la fluorescencia principal de cada canal, la firma FRET se vuelve más obvia.
Por ejemplo, mientras que el tiempo de vida de la fluorescencia aumenta y disminuye alternativamente a lo largo del espectro de fluorescencia para la muestra de paja de trigo nativa, se observa una firma clara FRET para ambas secciones nativas de paja de trigo incubadas con PEG etiquetada con Rhodamine y paja de trigo nativa con Dextrin etiquetada con muestras de Rhodamine. En el contexto de la hidrólisis de biomasa lignocelulósica, este método puede transferirse fácilmente a estudios de interacción enzimática en varias muestras de biomasa que requieren una caracterización rigurosa de cada nueva biomasa. Dado que sFLIM no requiere la fijación de la muestra, allana el camino para los estudios dinámicos de interacción de lignina enzimática y es probable que guíe estrategias de ingeniería enzimática y pretratamientos de biomasa.
Como la mayoría de las veces, las mediciones de tiempo de vida requieren el uso de fuentes láser infrarrojas por pulsos. En consecuencia, se deben tomar las precauciones de seguridad adecuadas.
