באמצעות שיטה זו אנו יכולים ישירות בדיקה היווצרות צינור הלב, לולאה, היווצרות תא מלא ללא מניפולציות ניסיוניות נוספות של עובר העכבר. אמנם, אנו משתמשים MLC-2v-tdTomato עכברים כדוגמה, שיטה פשוטה זו יכולה להיות בשימוש נרחב עם קווי עכבר כתב פלואורסצנטי אחרים. היתרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא שזה פשוט מאוד ואינו דורש שום טכניקות מורכבות או ציוד.
זה יכול להתבצע בהגדרת מעבדה רגילה. לאחר הזדווגות נקבה עם עכברים זכרים, שניהם MLC-2v-tdTomato 8 עד 10 שבועות, לבדוק את הסכרים עבור תקעים בנרתיק בכל בוקר. הניחו את הסכרים ההריונים, המתת דם בימים שונים לאחר הקוטום, בתמרורי סופין וריסוס הבטן עם 70% אתנול.
השתמש מספריים כירורגיים חדים מדפים כדי לפתוח את חלל הבטן על ידי חתך של העור והן את דופן הבטן. לאחר איתור קרני רחם דו-צדדיות בחלק הגבי של חלל הבטן, הפרד את הרחם כולו באמצעות מספריים כירורגיים חדים ומדפים לחתוך בזהירות מעל oviducts משני הצדדים. מניחים את הרחם כולו נותח בצלחת פטרי 10 ס"מ עם PBS קר כקרח.
באמצעות מספריים כירורגיים חדים ומלקחיים, בזהירות להפריד כל שאק מי המיצוק לאורך קרן הרחם. השתמש פינצטה כדי להעביר כל עובר לתוך צלחת תרבות 35 מילימטר מלא PBS קר כקרח. באמצעות מספריים ומלקחיים כירורגיים חדים, פתח את שיכר מי המיצוק וחשוף כל עובר על ידי ניתוק חבל הטבור ולאחר מכן לקצץ רקמות עובריות נוספות ככל האפשר מבלי לפגוע בעוברים.
תחת מיקרוסקופ ניתוח עם מאיר מיקרוסקופ סיבים אופטיים, לחתוך את ראשו של העובר ולהעביר אותו צינור 1.5 מיליליטר עם 100 microliters של חיץ A עבור genotyping מאוחר יותר כדי לתאם עם התוצאות של הדמיה epifluorescent. באמצעות מדפים עדין, לפתוח את החזה של העובר. עם מספריים כירורגיים חדים ומדפים, להסיר את הלב מן הריאות ואת כלי הדם.
השתמש פינצטה כדי להעביר את הלב העוברי נותק לתוך צלחת תרבות 35 מילימטר עם PBS. מניחים את הצלחת עם לבבות עובריים עכבר תחת מיקרוסקופ ניתוח epifluorescent. השתמש במטלות עדין כדי למקם את הלבבות העובריים כך פיתוח החדרים פונים הבוחן.
התאם את המוקד באמצעות מטרה של 0.63x במצב שדה בהיר. צלף חשיפות של שדות בהירים וללכוד תמונות מרובות. כדי לדמיין ביטוי tdTomato, כבה מאיר מיקרוסקופ סיבים אופטיים והגדר את המסנן עבור פלואורסצנטיות אדומה.
התאימו מחדש את התמקדות התמונה במידת הצורך, התאימו את הבהירות והניגודיות, צלמו חשיפות פלואורסצנטיות אדומות ולכדו תמונות מרובות. עבור genotyping עובר, להרתיח דגימות ראש מבודדות בעבר במאגר A ב 100 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. צנטריפוגה במשך שתי דקות ב 11, 360 פעמים G.Transfer 20 microliters של על טבעי לתוך צינור חדש 1.5 מיליליטר עם 20 microliters של חיץ B ומערבבים.
השתמש 4.5 microliters של supernatant מעורב כתבנית DNA ולשלב אותו עם 0.5 microliters של כל אחד 10 מיקרומולרים ספציפיים קדימה והפכו פריימרים, 10 microliters של פולימראז 2x-premixed ומאגר תגובה ולאחר מכן להוסיף מים לנפח כולל של 20 microliters. הפעל PCR כמתואר בכתב היד. לטעון את התגובה הושלמה 100 סולם DNA זוג בסיס על 1% ג'ל agarose ולהפעיל ב 140 וולט ב 1x TAE חיץ במשך 25 דקות.
מניחים את הג'ל שהושלם על טרנסילומינטור UV ולהדליק את אור UV כדי לזהות את להקות DNA. MLC-2v נחשב הסמן המוקדם ביותר עבור מפרט התא חדרי במהלך התפתחות הלב. ב MLC-2v-tdTomato כתב לדפוק בעכברים, ביטוי חלש יחסית של tdTomato בצינור הלב ליניארי ב E8.0 מתחזק ב E8.5 כפי שמוצג באמצעות הדמיה אפיפלורסנטית כל הר של העוברים.
באמצעות הדמיה אפיפלורסנטית כולה של הלב המנותק, ניתן לקבוע בקלות היווצרות תא חדרית במהלך התפתחות לב העכבר. בלב המנותח של עובר עכבר שלם ב- E10.5, ביטוי הכתב MLC-2v-tdTomato הוצג בחלק החדרי של הלב ולא בדרכי הזרימה, בדרכי הזרימה או באטריה העתידית. ב E12.5 כדי E13.5, כתב tdTomato בא לידי ביטוי באופן בלעדי בחדרי הלב ארבעה תאים.
תבנית הביטוי הדומה ספציפית חדרית הוצגה בעובר העכבר המנותק ב- E16.5. לאחר הדמיה שלמה, גנוטיפ של העוברים נקבע באמצעות שני סטים של פריימרים עבור PCR genotyping, המאשר עוברים הומוזיגים הנושאים את אלל דפיקות tdTomato, הטרוזיגים, ואת העוברים מסוג פראי. שיטה זו היא די פשוטה ופשוטה לביצוע.
הצעד הקריטי הוא לנתח לבבות עובריים. הבנת אנטומיה לבבית במהלך התפתחות הלב יש צורך לבודד בהצלחה את הלב מן העובר כולו.
