Mit dieser Methode können wir herzröhrenbildung, Looping und volle Kammerbildung ohne weitere experimentelle Manipulationen des Mausembryons direkt prüfen. Obwohl wir MLC-2v-tdTomato Mäuse als Beispiel verwenden, kann diese einfache Methode häufig mit anderen fluoreszierenden Reporter-Mauslinien verwendet werden. Der Hauptvorteil dieses Protokolls ist, dass es sehr einfach ist und keine komplexen Techniken oder Geräte erfordert.
Es kann bei regulärer Laboreinstellung durchgeführt werden. Nach der Paarung Weibchen mit männlichen Mäusen, beide MLC-2v-tdTomato 8 bis 10 Wochen alt, überprüfen Sie die Dämme auf Vaginalstecker jeden Morgen. Legen Sie die schwangeren Muttern, eingeschläfert an verschiedenen Tagen nach dem Koitum, in Supine-Position und sprühen Sie den Bauch mit 70% Ethanol.
Verwenden Sie scharfe chirurgische Schere und Zange, um die Bauchhöhle durch Schnitt der Haut und Bauchwand zu öffnen. Nach dem Auffinden bilateraler Gebärmutterhörner im dorsalen Teil der Bauchhöhle, trennen Sie die gesamte Gebärmutter mit scharfen chirurgischen Scheren und Zangen, um vorsichtig über den Eileitern auf beiden Seiten zu schneiden. Legen Sie die gesamte sezierte Gebärmutter in eine 10 Zentimeter lange Petrischale mit eiskaltem PBS.
Mit scharfen chirurgischen Scheren und Zangen, trennen Sie sorgfältig jeden Fruchtwassersack entlang des Gebärmutterhorns. Verwenden Sie eine Pinzette, um jeden Embryo in eine 35-Millimeter-Kulturplatte zu übertragen, die mit eiskaltem PBS gefüllt ist. Öffnen Sie mit scharfen chirurgischen Scheren und Zangen einen Fruchtwassersack und entblößen Sie jeden Embryo, indem Sie die Nabelschnur abschneiden und dann zusätzliche embryonale Gewebe so weit wie möglich ausschneiden, ohne die Embryonen zu beschädigen.
Unter einem Sezieren mikroskop mit einem Faseroptikmikroskop-Beleuchtung sende den Kopf des Embryos ab und überträgt ihn in ein 1,5-Milliliter-Rohr mit 100 Mikroliter Puffer A für die spätere Genotypisierung, um mit den Ergebnissen der epifluoreszierenden Bildgebung zu korrelieren. Öffnen Sie mit feinen Zangen die Brust des Embryos. Mit scharfen chirurgischen Scheren und Zangen, entfernen Sie das Herz weg von der Lunge und Vaskulatur.
Verwenden Sie eine Pinzette, um das sezierte embryonale Herz mit PBS in eine 35-Millimeter-Kulturplatte zu übertragen. Platzieren Sie die Platte mit Maus-Embryonalherzen unter einem epifluoreszierenden Sezierendes Mikroskop. Verwenden Sie feine Zangen, um die embryonalen Herzen so zu positionieren, dass sich entwickelnde Ventrikel dem Prüfer gegenüberstehen.
Passen Sie den Fokus mit einem 0,63-fachen Objektiv im Hellfeldmodus an. Nehmen Sie Hellfeldbelichtungen auf und erfassen Sie mehrere Bilder. Um die tdTomato-Expression zu visualisieren, schalten Sie einen Lichtwellenleiter aus, und stellen Sie den Filter für rote Fluoreszenz ein.
Bei Bedarf die Fokussierung des Bildes nachjustieren, Helligkeit und Kontrast anpassen, rotfluoreszierende Belichtungen aufnehmen und mehrere Bilder aufnehmen. Für embryonale Genotypisierung, kochen zuvor isolierte Kopfproben in Puffer A bei 100 Grad Celsius für 30 Minuten. Zentrifugieren Sie für zwei Minuten bei 11, 360 mal G.Transfer 20 Mikroliter Überstand in eine neue 1,5 Milliliter Tube mit 20 Mikroliter Puffer B und mischen.
Verwenden Sie 4,5 Mikroliter des gemischten Überstandes als DNA-Vorlage und kombinieren Sie ihn mit 0,5 Mikrolitern jedes der 10 mikromolarenspezifischen Vorwärts- und umgekehrten Primer, 10 Mikroliter 2x-vorgemischter Polymerase und Reaktionspuffer und fügen Sie dann Wasser zu einem Gesamtvolumen von 20 Mikrolitern hinzu. Führen Sie eine PCR aus, wie im Manuskript beschrieben. Laden Sie die abgeschlossene Reaktion in 100 Base n-Paar DNA-Leiter auf einem 1%Agarose-Gel und laufen Sie bei 140 Volt in 1x TAE Puffer für 25 Minuten.
Legen Sie das fertige Gel auf einen UV-Transilluminator und schalten Sie das UV-Licht ein, um die DNA-Bänder zu identifizieren. MLC-2v gilt als der früheste Marker für die ventrikuläre Kammerspezifikation während der Herzentwicklung. Bei MLC-2v-tdTomato-Reporter-Knock-in-Mäusen wird die relativ schwache Expression von tdTomato im linearen Herzröhrchen bei E8.0 bei E8.5 stärker, wie durch eine epifloureszierende Gesamtbildgebung der Embryonen gezeigt wird.
Mit hilfe einer vollmontierten epifloureszenten Bildgebung des sezierten Herzens kann die ventrikuläre Kammerbildung während der Herzentwicklung der Maus leicht bestimmt werden. Im sezierten Herzen eines ganzen Mausembryons bei E10.5 wurde der MLC-2v-tdTomato-Reporterausdruck im ventrikulären Teil des Herzens und nicht im Zuflusstrakt, im Abflusstrakt oder in den zukünftigen Vorhöfen gezeigt. Bei E12.5 bis E13.5 wird der tdTomato-Reporter ausschließlich in den Ventrikeln des vierkammerigen Herzens ausgedrückt.
Das ähnliche ventrikuläre Expressionsmuster wurde im sezierten Mausembryon bei E16.5 gezeigt. Nach der gesamten Bildgebung wurde der Genotyp der Embryonen mit zwei Primern für die PCR-Genotypisierung bestimmt, die homozygote Embryonen bestätigten, die das tdTomato-Knock-in-Allel, heterozygot und die wilden Embryonen trugen. Diese Methode ist ziemlich einfach und einfach durchzuführen.
Der entscheidende Schritt ist die Sezieren von embryonalen Herzen. Das Verständnis der Herzanatomie während der Herzentwicklung ist notwendig, um das Herz erfolgreich vom gesamten Embryo zu isolieren.
