פרוטוקול זה מאפשר ניתוח של אנדוקרדיום פרימיטיבי בכיוון מישורי. אנו יכולים לנתח את התפלגות התאים האנדוקרדיאליים, את האניזוטרופיה של צווים אחרים, ולתאר את צורתו של תא אנדוקרדיאלי יחיד במהלך התפתחות המסתם. בהשוואה למקטעי הרקמה הקלאסיים, הדמיית הפנים של האזור הרגנרטיבי של המסתם הפנימי מאפשרת ניתוח של קוטביות תאים מישורית ודינמיקה של תאים אנדוקרדיאליים במהלך התפתחות המסתם בעוברים שלמים.
ניתן להשתמש בשיטה זו כדי להעמיק את הידע על קוטביות התאים המישוריים במהלך התפתחות לב-ריאה. התחילו בהנחת הרחם שנכרת מעכברות הרות שהומתו בצלחת פטרי המכילה PBT קר כקרח. הסר את הפענוח הבודד מהרחם תחת מיקרוסקופ מנתח באמצעות מלקחיים עדינים.
באמצעות פינצטה עדינה, לעשות חתך בחלק הלבן של decidua, שבו העובר הוא. הסר אותו בעדינות, הימנע ממשיכה, והעבר את העוברים לצלחת פטרי חדשה עם PBT טרי באמצעות P-1000 עם קצה מנותק, משאיר קוטר גדול מספיק כדי שהעובר יעבור דרכו מבלי להישבר. עבור גנוטיפ, לקחת חתיכה קטנה של שק החלמון כ 0.5 מילימטרים רבועים או חתיכה של הזנב מן הקצה האחורי, לספור חמישה עד 10 סומיטים לכיוון הראש ולעכל אותו 100 מיליליטר של החיץ המתאים.
מתחת למכסה האדים, העבירו את העוברים לקור כקרח 4%PFA בצינור מיקרוצנטריפוגה של שני מיליליטר בארבע מעלות צלזיוס. לתקן את העוברים משעתיים עד לילה בארבע מעלות צלזיוס על נוטור. מתחת למכסה האדים, הסר את המקבע 4%PFA מצינורות המיקרוצנטריפוגה מבלי לגעת בעוברים.
יש להשליך את ה-PFA בגורם מכיל מתאים. שטפו את העוברים חמש פעמים ב-PBT קר במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. באמצעות מלקחיים עדינים, להסיר את הלב ולהעביר אותו לצינור microcentrifuge חדש 1.5 מיליליטר עם PBT טרי.
החליפו את PBT ב-PBS Triton ושטפו את הדגימות שלוש פעמים, חמש דקות כל אחת, בטמפרטורת החדר על שייקר מסלולי. החלף את PBS Triton בתמיסת חסימה המכילה PBS Triton עם סרום בקר 10% מומת בחום. דגירה משעתיים עד לילה בארבע מעלות צלזיוס על שייקר מסלולי.
החלף את התמיסה החוסמת בתמיסה חוסמת המכילה נוגדן ראשוני בריכוז הרצוי. דגירה למשך הלילה על שייקר מסלולי בארבע מעלות צלזיוס. לאחר דגירה של לילה בארבע מעלות צלזיוס, דגרו את הדגימות במשך שעה וחצי בטמפרטורת החדר על שייקר מסלולי.
שלב זה חיוני להגדלת יחס האות לרעש. הסר ושמור את תמיסת הנוגדנים העיקרית בארבע מעלות צלזיוס, עד שלושה ניסויים עתידיים. הוסיפו נתרן אזיד לריכוז סופי של 0.02% לשימור מיטבי.
לאחר מכן, שטפו את העוברים שלוש פעמים עם PBS Triton במשך שלוש דקות כל אחד. שטפו את העוברים עם PBS Triton שלוש פעמים במשך 30 דקות ושמרו אותם על שייקר מסלולי בארבע מעלות צלזיוס. לאחר השטיפה האחרונה, הוסיפו מיליליטר אחד של תמיסת חסימה המכילה נוגדן משני מצומד פלואורסצנטי כנגד המין המארח העיקרי של הנוגדנים.
לאחר מכן מוסיפים DAPI לתמיסה ומדגרים את העוברים למשך הלילה על שייקר מסלולי בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה הלילה בארבע מעלות צלזיוס, דגירה על העוברים במשך שעה וחצי בטמפרטורת החדר על שייקר מסלולי. שלב זה חיוני להגדלת יחס האות לרעש.
חזור על שלבי הכביסה של PBS Triton כפי שצוין בכתב היד של הטקסט. שים את הלבבות על צלחת פטרי 35 מ"מ המכילה PBS. באמצעות חוט טונגסטן ומלקחיים עדינים, לבודד את התעלה atrioventricular או את דרכי היציאה לחתוך אותם לאורך.
הכן תלושי כיסוי, שקופיות, מלקחיים, פיפטה P-200 עם הקצוות המתאימים, מגבת נייר וכל מדיה מימית המבוססת על גליצרול לפלואורסצנציה ללא DAPI. הדביקו שתי רצועות של סרט הדבקה על שקופית המופרדות ב-0.3 עד 0.6 ס"מ כדי ליצור חלל חדר תלת-ממדי שיאפשר לדגימות לשמר את צורתן המקורית מבלי למעוך אותן. לאחר מכן, באמצעות כ 20 microliters של חיץ, בזהירות לזרוק את הדגימות על השקופית בין רצועות הקלטת באמצעות קצה P-200 פיפטה לחתוך.
השתמש במיקרוסקופ מנתח כדי להגדיל את הדיוק. באמצעות מלקחיים עדינים, מניחים את הדגימות כאשר האנדוקרדיום פונה כלפי מעלה ושריר הלב כלפי מטה על המגלשה. הסירו עודפי PBS בעזרת מגבת נייר והימנעו מלגעת בדגימה.
לאחר מכן, ייבשו את הדגימות במשך דקה עד שתי דקות בטמפרטורת החדר כדי לגרום לדגימות להידבק לשקופית. הוסף 40 מיקרוליטרים של מדיה הרכבה על בסיס מימי לרקמה. מניחים את הכיסוי להחליק על שתי פיסות הסרט ומורידים אותו באיטיות על הרקמה בעזרת מחט או מלקחיים.
הימנעו מיצירת בועות אוויר. אטמו את הכיסוי באמצעות טיפת לק אחת על כל קודקוד של הכיסוי. לאחר שהלק יבש, נקו את עודפי ההרכבה מצידי הכיסוי על ידי שימוש במגבת נייר סופגת.
יש להימנע מהזזת הכיסוי. הוסיפו לק לאורך קצוות הכיסוי כדי לאטום אותו לחלוטין, ובכך למנוע התאדות של חומרי ההדפסה. באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי זקוף או הפוך, צלם תמונות בהגדלה של 10X לתצוגה כללית וב- 63X עם זום 3X לתמונות מפורטות.
צורת התא של אנדוקרדיום נותחה במהלך היווצרות השסתומים ברזולוציה תאית. תאים בודדים או שיבוטים של כמה תאים ביטאו GFP באנדוקרדיום. הביטוי והשילוב של GFP עם לוקליזציה תת-תאית של VE-cadherin היו גישה יעילה לחקר הקשר בין דינמיקה של AJ לבין היווצרות פילופודיה ותאי קדם-EMT, מאחר שתאים אלה פיתחו בליטות ממברנה כאשר AJs מתמוססים.
הבדלים בעוצמת הכתם של VE-cadherin באנדוקרדיום הצביעו על נוכחות של התכווצות אניזוטרופית באנדוקרדיום העוברי של התעלה האטריובנטריקולרית בשלבים טרום-וולוולריים. כל הלב הוכתם בנוגדן VE-cadherin ב-E8.5 ו-E9.5. ב- E8.5, האנדוקרדיום של התעלה האטריובנטריקולרית נטה להיות בעל ארגון אפיתל יציב, וקודקודים שנוצרו על ידי יותר מארבעה תאים לא זוהו.
ב-E9.5 נצפו קודקודים של עד שישה תאים היוצרים מבנים דמויי רוזטה, בדומה לארגון התאי שתואר קודם לכן באפיתל העובר סידור מחדש פעיל של תאים, מה שמרמז על כך שאנדוקרדיום התעלה האטריובנטריקולרית עבר סידור מחדש דינמי של התאים במהלך התפתחות המסתם. עקומת למידה נחוצה כדי להפוך למומחה בטכניקה זו. יתר על כן, מומלץ מאוד להשתמש מלקחיים ריבוניים חוט טונגסטן.
כיום, הדמיה של אנדוקרדיום טרום valvular היה מוגבל חתכים. הגישה שלנו מציעה את האפשרות לחקור התנהגות אנדוקרדיומית עוברית מנקודת מבט מישורית.
