Name: analysis of n-glycans from raphanus sativus cultivars using pngase h+
Uploaded: 2018-06-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of N-glycans from Raphanus sativus Cultivars Using PNGase H+ at JoVE.com

עבודה זו נתמך בחלקה על ידי קרן מדעי הטבע של סין (גרנט מספרים 31471703, A0201300537 ו- 31671854 כדי לומר שראשי, להעניק מספר 31470435 G.Y.), ואת תוכנית כשרונות זרים 100 (גרנט מספר JSB2014012 כדי לומר).

1. דוגמה אוסף
<ol><li>לרכוש את הזנים השונים של צנון טרי (צנון sativus ל').</li>
</ol>2. בידוד של חלבון של צנון
<ol><li>Homogenize כ- 100 גרם של צנון טרי עם בלנדר מטבח למשך 10 דקות.</li>
	<li>להעביר את slurry 50 מ ל צנטריפוגה ובשעות צנטריפוגה-× 14,000 g ב- 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות להסיר את החומר לא מסיסים.</li>
	<li>להעביר את תגובת שיקוע בזהירות לתוך שפופרת צנטרפוגה 50 מ ל חדש ולהוסיף אמצעי שווה של 2 מ' חומצת חומץ טריכלור (TCA) פתרון. הערה: הוספת TCA לזרז חלבונים מסיסים (glyco).</li>
	<li>צנטריפוגה-× 14,000 g ב- 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ולהסיר את תגובת שיקוע החלבונים מגורען (glyco).</li>
	<li>לשטוף את גלולה עם 20 מ של מים יונים, צנטריפוגה ב × 14,000 g ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות להסיר oligosaccharides מסיסים, סוכרים.</li>
	<li>חזור על שלב 2.5. ארבע פעמים.</li>
	<li>מחדש להשעות את כדורי ב 1 מ"ל של מים יונים, העברת שפופרת צנטרפוגה mL 1.5 טריים.</li>
</ol>3. הכנת N- Glycans
<ol><li>µL 50 תערובת של חלבון פתרון משלב 2.7. (שווה ל- 5 גר' צנון טרי) עם מו 0.2 של recombinant H PNGase+ , חומצה אצטית 10 מ מ.</li>
	<li>דגירה תערובת התגובה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 12 שעות. לאחר הדגירה, צנטריפוגה-× 14,000 g עבור 5 דקות כדי להסיר את תוספת חלבון ואת האנזים.</li>
	<li>להעביר את תגובת שיקוע שפופרת צנטרפוגה mL 1.5 טריים.</li>
</ol>4. טיהור של N- Glycans
<ol><li>להכין את העמודה מיצוי מוצק-פאזי (SPE) להעשיר את N- glycans ולהסיר מלחי וזוהמה אחרים מן התערובת התגובה, להגדיל את מידת הבררנות של fluorogenic 2-aminobenzamide (2-AB) תיוג סוכן של N- glycan derivatization.<ol>
<li>להוסיף 3 מ ל מים יונים לשטוף את העמודה.</li>
		<li>להוסיף 3 מ"ל של 80% acetonitrile פתרון המכיל חומצה trifluoroacetic (TFA, 0.1% v/v) לפעיל SPE-העמודה.</li>
		<li>להוסיף 3 מ"ל של מים יונים equilibrate SPE-העמודה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להעביר את הדגימה מהשלב 3.3 אל העמודה וזורקים את הזרימה דרך.</li>
	<li>להוסיף 1.5 מיליליטר מים יונים כדי לשטוף את העמודה ולמחוק את הזרימה דרך.</li>
	<li>Elute N- glycans המשוחררים מן העמודה באמצעות 1.5 מ ל תמיסה מימית 20% acetonitrile, המכיל 0.1% TFA (v/v) לתוך שפופרת צנטרפוגה 2 מ"ל.</li>
	<li>הסר הממס על ידי אידוי צנטריפוגלי בטמפרטורת החדר. להתנדף עד המדגם יהיה יבש לחלוטין.</li>
</ol>5. קרינה פלואורסצנטית Derivatization של N- Glycans
<ol><li>להכין 1 מ"ל של פתרון 2-AB, בהיקף של 35 מ מ 2-AB ו- 0.1 M נתרן cyanoborohydride דימתיל סולפוקסיד/אצטית תמיסת חומצה (7:3, וי/v).</li>
	<li>להוסיף 5 µL 2-AB לפתרון הדגימות מיובשים (שלב 4.5.) נגזר 6 צנוניות שונים. מערבולת כל דגימה עד לחלוטין התפרקה.</li>
	<li>דגירה התערובת עבור 2 h ב- 65 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>ומצננים את הדגימה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות, ולהוסיף 5 µL של מים יונים 40 µL של acetonitrile. Centrifuge הצינורות ב g x 14,000 למשך 3 דקות.</li>
	<li>להעביר 48 µL מ תגובת שיקוע לתוך בקבוקון HPLC 300 µL שחזור גבוהה. אחסן את הדגימות - glycan Nderivatized ב-20 ° C עד לחודש אחד.</li>
</ol>6. HILIC-UPLC בניית פרופיל של N- glycans
<ol><li>לנתח את הדגימות באמצעות מערכת UPLC רגיל מחובר של detectorset זריחה מקוון באורכי עירור/פליטה של 330 nm/420 nm, בהתאמה.</li>
	<li>השתמש כרומטוגרפיה נוזלית של אינטראקציה הידרופובי (HILIC)-UPLC עמודה glycan בטמפרטורה עמודה של 60 מעלות צלזיוס לניתוח.</li>
	<li>להכין ממס A על ידי דילול 50 מ של מניות פתרון (1 מ' אמוניום formate פתרון, pH 4.5) עם 950 מ"ל של כרומטוגרפיה נוזלית מסות (LCMS)-כיתה מים. הכן את הפתרון המניות כדלקמן:<ol>
<li>43 מ ל חומצה פורמית להוסיף 700 מ"ל של איכות המזון-כיתה ח2O.</li>
		<li>להתאים את ה-pH ל 4.5 תוספת dropwise של פתרון אמוניה מימית (25% w/w).</li>
		<li>להעביר הממס צילינדר מדידה ולמלא עד 1000 מ"ל עם איכות המזון-כיתה ח2O. החנות ב 4-6 מעלות צלזיוס עד 3 חודשים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להשתמש acetonitrile איכות המזון-כיתה ב' הממס</li>
	<li>הפרד N- glycans באמצעות • תנאי מעבר הצבע הבאים:<ol>
<li>להתחיל על-ידי הוספת 95% ממס B לתוך א הממס להגדיר קצב הזרימה 0.5 mL/min מ-0 דקות 44.5.</li>
		<li>מ 0 דקות ל- 6 דקות, לצמצם בהדרגה את הפרופורציה של הממס B עם % to78 מעבר צבע ליניארי.</li>
		<li>מ- 6 דקות מינימום 44.5, לצמצם בהדרגה את הפרופורציה של הממס B עם מעבר צבע ליניארי 55.9%.</li>
		<li>מ מין 44.5 46.5 מינימום, במהירות להקטין את חלקם של הממס B במילוי הדרגתי לינארית מ- 55.9% ל- 0% להחזיק ב- 0% למשך 2 דקות ו ליזום כביסה של העמודה. להפחית את קצב הזרימה כדי 0.25 mL/min של 44.5 ל- 55 דקות.</li>
		<li>לשטוף את העמודה עוד יותר על ידי הגדלת B ממס עד 95% מן 48.5 דקות מינימום 50.5 והחזק ב 95% 4.5 דקות.</li>
		<li>Equilibrate מחדש את העמודה לתנאי ההתחלה 95% ממס B ב- 0.5 mL/min מ- 50.5 מינימום 57.</li>
	</ol>
</li>
	<li>מזריקים µL 45 המדגם לתוך המערכת UPLC.</li>
	<li>Elute את N- glycans מאת UPLC עם השמירה פעמים בין 15 ל-40 דקות.</li>
	<li>לאסוף את כל התצפיות UPLC שיא שבר באמצעות צינורות צנטריפוגה 2 מ"ל ויבש הדגימות אידוי צנטריפוגלי.</li>
	<li>להזריק כ 1 pmol של 2-AB שכותרתו לתוספי סטנדרטי (2−20 גלוקוז יחידות) כדי לכייל את הצמח -N- glycan פרופיל, וכדי להקצות פעמים • תנאי שלהם ליחידות גלוקוז סטנדרטית.</li>
</ol>7. MALDI-TOF MS ניתוח
<ol><li>להמיס דגימות מן µL 6.8 ב 5 שלב של איכות המזון-כיתה מים. לערבב 1 µL של הפתרון הדגימה, µL 1 6-עזה-2-thiothymine (ATT) פתרון (0.3% w/v ב- 70% v/v acetonitrile מימית), פיפטה התערובת על המוביל מדגם MALDI-TOF.</li>
	<li>לנתח את הדגימות שימוש בכלי ספקטרומטר מסה MALDI-TOF במצב יון חיובי על ידי לחיצה על לחצן התחל .</li>
	<li>נתח ספקטרום המונית באמצעות התוכנה הנלווית של ניתוח MALDI-תוף-MS.</li>
	<li>לפרש הספקטרום באמצעות של קוד פתוח glycan פרשנות תוכנה19. הגדר את פרמטרי החיפוש עבור 2-AB תיוג, [M + Na]+, ולהגדיר את פרמטר דיוק 2.0 Da.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Altmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Protein+Glycosylation+in+Allergy.">The Role of Protein Glycosylation in Allergy.</a> International Archives of Allergy and Immunology. 142 (2), 99-115 (2007).</li><li>Van Ree, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#946;+(1,+2)-xylose+and+&#945;+(1,+3)-fucose+residues+have+a+strong+contribution+in+IgE+binding+to+plant+glycoallergens.">&#946; (1, 2)-xylose and &#945; (1, 3)-fucose residues have a strong contribution in IgE binding to plant glycoallergens.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (15), 11451-11458 (2000).</li><li>Biswas, H., Chattopadhyaya, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+of+Curcuma+longa+rhizome+lectin:+Role+of+N-linked+glycosylation.">Stability of Curcuma longa rhizome lectin: Role of N-linked glycosylation.</a> Glycobiology. 26 (4), 410-426 (2016).</li><li>Lefebvre, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+N-glycosylation+sites+and+CXC+motifs+in+trafficking+of+Medicago+truncatula+Nod+factor+perception+protein+to+plasma+membrane.">Role of N-glycosylation sites and CXC motifs in trafficking of Medicago truncatula Nod factor perception protein to plasma membrane.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (14), 10812-10823 (2012).</li><li>Severino, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+glycan+moiety+on+the+structure-function+relationships+of+PD-L1,+type+1+ribosome-inactivating+protein+from+P.+dioica+leaves.">The role of the glycan moiety on the structure-function relationships of PD-L1, type 1 ribosome-inactivating protein from P. dioica leaves.</a> Molecular BioSystems. 6 (3), 570-579 (2010).</li><li>Lige, B., Ma, S., Van Huystee, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+the+site-directed+removal+of+N-glycosylation+from+cationic+peanut+peroxidase+on+its+function.">The effects of the site-directed removal of N-glycosylation from cationic peanut peroxidase on its function.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 386 (1), 17-24 (2001).</li><li>Ceriotti, A., Duranti, M., Bollini, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+N-glycosylation+on+the+folding+and+structure+of+plant+proteins.">Effects of N-glycosylation on the folding and structure of plant proteins.</a> Journal of Experimental Botany. 49 (324), 1091-1103 (1998).</li><li>Kamerling, J. P., Gerwig, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+the+Structural+Analysis+of+Carbohydrates.">Strategies for the Structural Analysis of Carbohydrates.</a> Comprehensive Glycoscience. , 1-68 (2007).</li><li>Huang, Y., Mechref, Y., Novotny, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscale+nonreductive+release+of+O-linked+glycans+for+subsequent+analysis+through+MALDI+mass+spectrometry+and+capillary+electrophoresis.">Microscale nonreductive release of O-linked glycans for subsequent analysis through MALDI mass spectrometry and capillary electrophoresis.</a> Analytical Chemistry. 73 (24), 6063-6069 (2001).</li><li>Triguero, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+and+enzymatic+N-glycan+release+comparison+for+N-glycan+profiling+of+monoclonal+antibodies+expressed+in+plants.">Chemical and enzymatic N-glycan release comparison for N-glycan profiling of monoclonal antibodies expressed in plants.</a> Analytical Biochemistry. 400 (2), 173-183 (2010).</li><li>Tretter, V., Altmann, F., Marz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide-N4-(N-acetyl-&#946;-glucosaminyl)asparagine+amidase+F+cannot+release+glycans+with+fucose+attached+&#945;1+&#8594;+3+to+the+asparagine-linked+N-acetylglucosamine+residue.">Peptide-N4-(N-acetyl-&#946;-glucosaminyl)asparagine amidase F cannot release glycans with fucose attached &#945;1 &#8594; 3 to the asparagine-linked N-acetylglucosamine residue.</a> European Journal of Biochemistry. 199 (3), 647-652 (1991).</li><li>Fan, J. -. Q., Lee, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detailed+studies+on+substrate+structure+requirements+of+glycoamidases+A+and+F.">Detailed studies on substrate structure requirements of glycoamidases A and F.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (43), 27058-27064 (1997).</li><li>Altmann, F., Paschinger, K., Dalik, T., Vorauer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+peptide-N4-(N-acetyl-&#946;-glucosaminyl)asparagine+amidase+A+and+its+N-glycans.">Characterisation of peptide-N4-(N-acetyl-&#946;-glucosaminyl)asparagine amidase A and its N-glycans.</a> European Journal of Biochemistry. 252 (1), 118-123 (1998).</li><li>Altmann, F., Schweiszer, S., Weber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+comparison+of+peptide:+N-glycosidases+F+and+A+reveals+several+differences+in+substrate+specificity.">Kinetic comparison of peptide: N-glycosidases F and A reveals several differences in substrate specificity.</a> Glycoconjugate Journal. 12 (1), 84-93 (1995).</li><li>Wang, T., Voglmeir, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PNGases+as+valuable+tools+in+glycoprotein+analysis.">PNGases as valuable tools in glycoprotein analysis.</a> Protein and Peptide Letters. 21 (10), 976-985 (2014).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+and+characterization+of+a+novel+extremely+acidic+bacterial+N-glycanase+with+combined+advantages+of+PNGase+F+and+A.">Discovery and characterization of a novel extremely acidic bacterial N-glycanase with combined advantages of PNGase F and A.</a> Bioscience Reports. 34 (6), 00149 (2014).</li><li>Du, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+sample+preparation+methodology+for+plant+N-.glycan+analysis+using+acid-stable+PNGase+H+.">Rapid sample preparation methodology for plant N-.glycan analysis using acid-stable PNGase H+.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 63 (48), 10550-10555 (2015).</li><li>Wang, T., Hu, X. -. C., Cai, Z. -. P., Voglmeir, J., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Qualitative+and+Quantitative+Analysis+of+Carbohydrate+Modification+on+Glycoproteins+from+seeds+of+Ginkgo+biloba.">Qualitative and Quantitative Analysis of Carbohydrate Modification on Glycoproteins from seeds of Ginkgo biloba.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65 (35), 7669-7679 (2017).</li><li>Ceroni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GlycoWorkbench:+a+tool+for+the+computer-assisted+annotation+of+mass+spectra+of+glycans.">GlycoWorkbench: a tool for the computer-assisted annotation of mass spectra of glycans.</a> Journal of Proteome Research. 7 (4), 1650-1659 (2008).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

פרוטוקול שהוצגו כאן מאפשר השוואת הפרופילים - glycan Nשל הזנים השונים של צנון. יתרון משמעותי של שיטה זו לעומת פרוטוקולים הקיימת היא כי אין שינויים מאגר בין המהדורה אנזימטי של N- glycans התגובה derivatization עם 2-AB נדרשים. השלב הקריטי ביותר של ההליך הטיהור של N- glycans באמצעות העמודה SPE, כמו כשל ל...

N- glycans בצמחים יש משכו תשומת לב מוגברת בשנים האחרונות, כמו מחקרים קודמים הדגישה N- glycans כמקור פוטנציאלי אימונולוגי cross-reactions זה עלול לעורר תגובות אלרגיות1,2 . זה כבר הוכיחה בעבר כי N- glycans על הצמח glycoproteins יכול להשפיע על פעילות קטליטית3,4, thermostability,5,מתקפל6 או לוקליזציה subcellular ו הפרשת7. על מנת לתאם את המבנים glycan עם הפונקציות המתאימות שלהם, N- glycans חייב קודם להשתחרר מן glycoproteins כימית או enzymatically. שיטת כימי קלאסית עבור שחרור N- והן O- glycans היא β-חיסול, שבו מדגם אלקליין הטיפול מלווה הפחתה borohydride להניב alditol8. עם זאת, הליך זה מונע תיוג עם fluorophore וגורמת דעיכה משמעותית של יחידות חד-סוכר מהקצה תוך צמצום של המבנה glycan. Deglycosylation הכימי מבוסס על טיפול אמוניה מימית/פחמתי הוא גם נפוץ בשיטה חלופית9. אף אחת מהשיטות האלה שחרור כימי השתנה חלבונים שלמים, מה שמאפשר ניתוח spectrometric המוני של glycan ללא תווית בריכות ללא ההפרעה של פפטיד שברי בטווח מסה זהה. אולם, חסרון אחד השיטות האלה הוא קצב מוגבר השפלה α1, 3-fucosylated N- glycans, מבנה פחמימות משותף נמצאו צמחים10. לחלופין, שיטות פרסום אנזימטי באמצעות פפטיד:N- glycanases (PNGases, EC 3.5.1.52) חלים גם נרחב. F PNGase רקומביננטי (מתוך Flavobacterium meningosepticum) הבחירה הנפוצה ביותר, מאפשרת השחרור של כל סוגי N- glycans, למעט המבנים הנושאת של הליבה α1,11,3 fucose12. לכן, A PNGase (מבודד מזרעים שקדים) משמש בדרך כלל לניתוח של הצמח N- glycans13. עם זאת, deglycosylates אנזים זה רק proteolytically, נגזר glycopeptides, ואין אפשרות deglycosylate מקורי glycoproteins14. לפיכך, בדיקה רב שלבי מדגם נדרש לפני ניתוח נוסף, אשר גורם לאובדן נרחב של glycans, במיוחד אלה של שפע נמוכה15. המטרה הכוללת של השיטה היא להציג זרימת עבודה ממוטב עבור שחרור - glycan Nוזריחה תיוג באופן פשוט וחזק. הרציונל הבסיסי הוא כי PNGase H+, אשר נתגלה לאחרונה ב- Terriglobus ורודה , יכול להתבטא recombinantly ב e. coli, יכול hydrolyze N- glycans ישירות מתוך לגרדום חלבון בחומצי התנאים16. יתרון מפתח של שימוש PNGase H+ על שיטות אלטרנטיביות היא כי תגובות תיוג פלורסנט יכולה להתבצע בצינור התגובה אותו מבלי לשנות את התגובה מאגרי17,18. הכנה פשוטה תנאים ושחזור גבוה של oligosaccharides נמוך-שפע להפוך שיטה זו כלי רב ערך הניתוח של N- glycans. פרוטוקול זה מתאים לניתוח של N- glycans ממינים שונים של הצמח.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Chemicals:&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trichloroacetic acid&amp;nbsp;</td><td>SCR, Shanghai</td><td>80132618</td><td></td></tr><tr><td>Acetic acid glacial</td><td>Huada, Guangzhou</td><td>64-19-7</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>General-reagent</td><td>G80988C</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoroacetic acid</td><td>Energy chemical</td><td>W810031</td><td></td></tr><tr><td>2-aminobenzamide</td><td>Heowns, Tianjin</td><td>A41900</td><td></td></tr><tr><td>Sodium cyanoborohydride</td><td>J&amp;amp;K Scientific Ltd</td><td>314162</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Huada, Guangzhou</td><td>67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>2AB-labeled dextran ladder, 200 pmol</td><td>Agilent Technologies</td><td>AT-5190-6998</td><td></td></tr><tr><td>6-Aza-2-thiothymine&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>275514</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Tools/Materials:&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kitchen blender</td><td>Bear, Guangzhou</td><td>LLJ-A10T1</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Techcomp</td><td>CT15RT</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugal Evaporator</td><td>Hualida, Taicang</td><td>LNG-T120</td><td></td></tr><tr><td>SPE column</td><td>Supelco</td><td>Supelclean ENVI Carb SPE column</td><td></td></tr><tr><td>MALDI-TOF mass spectrometer</td><td>Bruker</td><td>Autoflex</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;HPLC Analysis:&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>High-recovery HPLC vial</td><td>Agilent Technologies</td><td>&amp;nbsp;# 5188-2788</td><td></td></tr><tr><td>HPLC System</td><td>Shimadzu</td><td>Nexera</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence Detector for HPLC</td><td>Shimadzu</td><td>RF-20Axs&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Column oven</td><td>Hengxin</td><td>CO-2000</td><td></td></tr><tr><td>HPLC Column</td><td>Waters</td><td>Acquity UPLC BEH glycan column</td><td>2.1 &amp;times; 150 mm, 1.7 &amp;mu;m particle size</td></tr><tr><td>LCMS-grade Water</td><td>Merck Millipore</td><td>#WX00011</td><td></td></tr><tr><td>LCMS-grade Acetonitrile</td><td>Merck Millipore</td><td># 100029</td><td></td></tr><tr><td>Formic acid</td><td>Aladdin</td><td>F112034</td><td></td></tr><tr><td>Ammonia solution</td><td>Aladdin</td><td>A112080</td><td></td></tr></tbody></table>

analysis of n-glycans from raphanus sativus cultivars using pngase h+

בשנים האחרונות moieties פחמימות של צמחים קיבלו תשומת לב רבה, כפי שהם מקור פוטנציאלי של תגובות חיסוניות cross-reactive, מעורר אלרגיה. בנוסף, פחמימות מבנים גם לשחק תפקיד קריטי בחילוף החומרים הצמח. כאן, אנו מציגים שיטה פשוטה ומהירה להכנה של ניתוח N- glycans מן הזנים השונים של צנון (צנון sativus) שימוש ספציפיים - glycanase Nלשחרור של פחמימות הצמחי מבנים. כדי להשיג זאת, פוחת משקעים חומצת חומץ טריכלור גולמי של צנון homogenates היו מטופלים עם PNGase H+, הנקרא באמצעות 2-aminobenzamide כמו תגית פלורסנט. הדגימות - glycan Nשכותרתו לאחר מכן נותחו על ידי ביצועים אולטרה לייזר בסיוע מטריקס desorption יינון-שעת הטיסה (MALDI-TOF) ספקטרומטר מסה מבני נתונים היסטוריים והגליונות כרומטוגרפיה נוזלית (UPLC) הערכה כדי לכמת abundancies היחסית של המבנים נגזר צנון - glycan N. פרוטוקול זה יכול לשמש גם לניתוח של N- glycans ממינים צמח שונים אחרים, עשוי להיות שימושי עבור חקירה נוספת של הפונקציה ואפקטים של N- glycans על בריאות האדם.

איור 1 מציג מבט סכמטי של פרוטוקול המתואר, כולל את הבידוד של חלבונים (glyco-) צנון, הכנת N- glycans, ניתוח UPLC, ניתוח MALDI-תוף-MS של רכיבים אלה. איור 2 מציג chromatograms נציג UPLC של N- glycans derivatized של הזנים צנון שנותחה. איור 3 מראה את התוצאות...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of N-glycans from Raphanus sativus Cultivars Using PNGase H+ at JoVE.com

Analysis of N-glycans from Raphanus sativus Cultivars Using PNGase H+

ניתוח של N- glycans של צנון sativus הזנים באמצעות PNGase H+

אנו מתארים שיטה פשוטה ומהירה הכנה וניתוח של N- glycans מן הזנים השונים של צנון (צנון sativus).

In recent years, the carbohydrate moieties of plants have received considerable attention, as they are a potential source of cross-reactive, ...

analysis-of-n-glycans-from-raphanus-sativus-cultivars-using-pngase-h

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Analysis of N-glycans from Raphanus sativus Cultivars Using PNGase H+

6.6K Views.  Nanjing Agricultural University. אנו מתארים שיטה פשוטה ומהירה הכנה וניתוח של N- glycans מן הזנים השונים של צנון (צנון sativus).

Video: Analysis of N-glycans from Raphanus sativus Cultivars Using PNGase H+

Structural Characterization of Mannan Cell Wall Polysaccharides in Plants Using PACE

Plant cell wall polysaccharides are notoriously difficult to analyze, and most methods require expensive equipment, skilled operators, and large amounts of purified material. Here, we describe a simple method for gaining detailed polysaccharide structural information, including resolution of structural isomers. For polysaccharide analysis by gel electrophoresis (PACE), plant cell wall material is hydrolyzed with glycosyl hydrolases specific to the polysaccharide of interest (e.g., mannanases for mannan). Large format polyacrylamide gels are then used to separate the released oligosaccharides, which have been fluorescently labeled. Gels can be visualized with a modified gel imaging system (see Table of Materials). The resulting oligosaccharide fingerprint can either be compared qualitatively or, with replication, quantitatively. Linkage and branching information can be established using additional glycosyl hydrolases (e.g., mannosidases and galactosidases). Whilst this protocol describes a method for analyzing glucomannan structure, it can be applied to any polysaccharide for which characterized glycosyl hydrolases exist. Alternatively, it can be used to characterize novel glycosyl hydrolases using defined polysaccharide substrates.

A protocol for the structural analysis of polysaccharides by gel electrophoresis (PACE), using mannan as an example, is described.

אפיון מבניים של מנן פוליסכרידים דופן התא בצמחים באמצעות קצב

Plant cell wall polysaccharides are notoriously difficult to analyze, and most methods require expensive equipment, skilled operators, and large amounts ...

A Quantitative Glycomics and Proteomics Combined Purification Strategy

There is a growing desire in the biological and clinical sciences to integrate and correlate multiple classes of biomolecules to unravel biology, define pathways, improve treatment, understand disease, and aid biomarker discovery. N-linked glycosylation is one of the most important and robust post-translational modifications on proteins and regulates critical cell functions such as signaling, adhesion, and enzymatic function. Analytical techniques to purify and analyze N-glycans have remained relatively static over the last decade. While accurate and effective, they commonly require significant expertise and resources. Though some high-throughput purification schemes have been developed, they have yet to find widespread adoption and often rely on the enrichment of glycopeptides. One promising method, developed by Thomas-Oates et al., filter aided N-glycan separation (FANGS), was qualitatively demonstrated on tissues. Herein, we adapted FANGS to plasma and coupled it to the individuality normalization when labeling with glycan hydrazide tags strategy in order to achieve accurate relative quantification by liquid chromatography mass spectrometry and enhanced electrospray ionization. Furthermore, we designed new functionality to the protocol by achieving tandem, shotgun proteomics and glycosylation site analysis on hen plasma. We showed that N-glycans purified on filter and derivatized by hydrophobic hydrazide tags were comparable in terms of abundance and class to those by solid phase extraction (SPE); the latter is considered a gold standard in the field. Importantly, the variability in the two protocols was not statistically different. Proteomic data that was collected in-line with glycomic data had the same depth compared to a standard trypsin digest. Peptide deamidation is minimized in the protocol, limiting non-specific deamidation detected at glycosylation motifs. This allowed for direct glycosylation site analysis, though the protocol can accommodate 18O site labeling as well. Overall, we demonstrated a new in-line high-throughput, unbiased, filter based protocol for quantitative glycomics and proteomics analysis.

A high-throughput protocol was developed for combined proteomics and glycomics purification and LC-MS/MS quantification in plasma. Deamidation analysis of N-linked glycosylation motifs was specific to deglycosylated sites. Accurate quantitation of N-glycans was achieved by coupling filter aided N-glycan separation to the individuality normalization when labeling with glycan hydrazide tags strategy.

Glycomics כמוני ואסטרטגית טיהור המשולבת פרוטאומיקה

There is a growing desire in the biological and clinical sciences to integrate and correlate multiple classes of biomolecules to unravel biology, define ...

Chemistry

Chemo-enzymatic Synthesis of N-glycans for Array Development and HIV Antibody Profiling

We present a highly efficient way for the rapid preparation of a wide range of N-linked oligosaccharides (estimated to exceed 20,000 structures) that are commonly found on human glycoproteins. To achieve the desired structural diversity, the strategy began with the chemo-enzymatic synthesis of three kinds of oligosaccharyl fluoride modules, followed by their stepwise &#945;-selective glycosylations at the 3-O and 6-O positions of the mannose residue of the common core trisaccharide having a crucial &#946;-mannoside linkage. We further attached the N-glycans to the surface of an aluminum oxide-coated glass (ACG) slide to create a covalent mixed array for the analysis of hetero-ligand interaction with an HIV antibody. In particular, the binding behavior of a newly isolated HIV-1 broadly neutralizing antibody (bNAb), PG9, to the mixture of closely spaced Man5GlcNAc2 (Man5) and 2,6-di-sialylated bi-antennary complex type N-glycan (SCT) on an ACG array, opens a new avenue to guide the effective immunogen design for HIV vaccine development. In addition, our ACG array embodies a powerful tool to study other HIV antibodies for hetero-ligand binding behavior.

Chemo-enzymatic Synthesis of N-glycans for Array Development and HIV Antibody Profiling

A modular approach to the synthesis of N-glycans for attachment to an aluminum oxide-coated glass slide (ACG slide) as a glycan microarray has been developed and its use for the profiling of an HIV broadly neutralizing antibody has been demonstrated.

כימותרפיה-אנזימטי סינתזה של N- glycans עבור מערך פיתוח נוגדן HIV פרופיל

We present a highly efficient way for the rapid preparation of a wide range of N-linked oligosaccharides (estimated to exceed 20,000 structures) that are ...

N-glycan Profiling of Glycoproteins by Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography with Fluorescence and Mass Spectrometric Detection

Glycosylation is a vital modification found in proteins. N-glycan profiling of glycoproteins is required to detect novel biomarker candidates and determine glycan alterations in diseases. Most commercially available biopharmaceutical proteins are glycoproteins. The efficacy of these drugs is affected by glycosylation patterns. Therefore, an in-depth characterization method for the N-glycans is necessary. Here, we present a comprehensive approach for qualitative and quantitative analysis of N-glycans using hydrophilic interaction liquid chromatography equipped with fluorescence detection and tandem mass spectrometry (HILIC-FLD-MS/MS). N-glycans were released from glycoproteins with a facile method and labeled by a procainamide fluorophore tag in the strategy. Subsequently, the procainamide labeled N-glycans were analyzed by a HILIC-FLD-MS/MS technique. In this approach, N-glycan structures were confirmed by the tandem mass spectrometric analysis, whereas fluorescence detection was used for the quantitative analysis. An application for data analysis of the detected N-glycan peaks is described in the study. This protocol can be applied to any glycoprotein extracted from various species.

N-glycan Profiling of Glycoproteins by Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography with Fluorescence and Mass Spectrometric Detection

N-glycan profiling of glycoproteins is essential for discovering novel biomarkers and understanding glycan functions in cellular events. Additionally, N-glycan analysis of protein biopharmaceuticals is very important for human use. In this current article, a high-throughput strategy for identifying and quantifying N-glycan structures was presented using the HILIC-FLD-MS/MS technique.

Glycosylation is a vital modification found in proteins. N-glycan profiling of glycoproteins is required to detect novel biomarker candidates and ...

Pulse-chase Analysis of N-linked Sugar Chains from Glycoproteins in Mammalian Cells

Attachment of the Glc3Man9GlcNAc2 precursor oligosaccharide to nascent polypeptides in the ER is a common modification for secretory proteins. Although this modification was implicated in several biological processes, additional aspects of its function are emerging, with recent evidence of its role in the production of signals for glycoprotein quality control and trafficking. Thus, phenomena related to N-linked glycans and their processing are being intensively investigated. Methods that have been recently developed for proteomic analysis have greatly improved the characterization of glycoprotein N-linked glycans. Nevertheless, they do not provide insight into the dynamics of the sugar chain processing involved. For this, labeling and pulse-chase analysis protocols are used that are usually complex and give very low yields. We describe here a simple method for the isolation and analysis of metabolically labeled N-linked oligosaccharides. The protocol is based on labeling of cells with [2-3H] mannose, denaturing lysis and enzymatic release of the oligosaccharides from either a specifically immunoprecipitated protein of interest or from the general glycoprotein pool by sequential treatments with endo H and N-glycosidase F, followed by molecular filtration (Amicon). In this method the isolated oligosaccharides serve as an input for HPLC analysis, which allows discrimination between various glycan structures according to the number of monosaccharide units comprising them, with a resolution of a single monosaccharide. Using this method we were able to study high mannose N-linked oligosaccharide profiles of total cell glycoproteins after pulse-chase in normal conditions and under proteasome inhibition. These profiles were compared to those obtained from an immunoprecipitated ER-associated degradation (ERAD) substrate. Our results suggest that most NIH 3T3 cellular glycoproteins are relatively stable and that most of their oligosaccharides are trimmed to Man9-8GlcNAc2. In contrast, unstable ERAD substrates are trimmed to Man6-5GlcNAc2 and glycoproteins bearing these species accumulate upon inhibition of proteasomal degradation.

We describe a method for analysis of the alteration of N-linked glycans through the early life of glycoproteins after their biosynthesis in mammalian cells. This is achieved by pulse-chase analysis of metabolically labeled glycans, enzymatic release from glycoproteins and examination by HPLC.

Pulse-מרדף ניתוח של N-linked שרשראות סוכר מ גליקופרוטאינים בתאי יונקים

Attachment of the Glc3Man9GlcNAc2 precursor oligosaccharide to nascent polypeptides in the ER is a common modification for secretory proteins. Although ...

Biology

Nonspecific Proteolysis-Based Glycomics Strategy for Bacterial Glycoproteins

Protein glycosylation is one of the most common and complex post-translational modifications. Many techniques have been developed to characterize the specific roles of glycans, the relationship between their structures and their impact on the functions of proteins. A common method for glycan analysis is to employ exoglycosidase cleavage to release N-linked glycans from glycoproteins or glycopeptides using Peptide-N-Glycosidase F (PNGase F). However, the glycan-protein linkages in bacteria are different and there is no enzyme available to release glycans from bacterial glycoproteins. In addition, free glycans have also been described in mammalian cells, bacteria, yeast, plants, and fish. In this article, we present a method that can characterize the N-linked glycosylation system in Campylobacter jejuni by detecting asparagine (Asn)-linked and free glycans that are not attached to their target proteins. In this method, total proteins from C. jejuni were digested by Pronase E with a higher enzyme to protein ratio (2:1&#8722;3:1) and a longer incubation time (48&#8722;72 h). The resulted Asn-glycans and free glycans were then purified using porous graphitic carbon cartridges, permethylated, and analyzed by mass spectrometry.

This study presents a method for glycomics analysis of glycoproteins by a combination of pronase E digestion, permethylation, and mass spectrometry analysis. This method is capable of analyzing all types of N-linked glycans, including bacterial N-glycans.

Protein glycosylation is one of the most common and complex post-translational modifications. Many techniques have been developed to characterize the ...

<meta charset="utf8"></head><body>יצירת פרופיל של רקמות סרטן המעי הגס באמצעות גליקופרוטאומיקה מונחית גליקומיקס

Glycomics-Guided Glycoproteomics Facilitates Comprehensive Profiling of the Glycoproteome in Complex Tumor Microenvironments

Glycosylation is a common and structurally diverse protein modification that impacts a wide range of tumorigenic processes. Mass spectrometry-driven glycomics and glycoproteomics have emerged as powerful approaches to analyze liberated glycans and intact glycopeptides, respectively, offering a deeper understanding of the heterogeneous glycoproteome in the tumor microenvironment (TME). This protocol details the glycomics-guided glycoproteomics method, an integrated omics technology, which firstly employs porous graphitized carbon-LC-MS/MS-based glycomics to elucidate the glycan structures and their quantitative distribution in the glycome of tumor tissues, cell populations, or bodily fluids being investigated. This allows for a comparative glycomics analysis to identify altered glycosylation across patient groups, disease stages, or conditions, and, importantly, serves to enhance the downstream glycoproteomics analysis of the same sample(s) by creating a library of known glycan structures, thus reducing the data search time and the glycoprotein misidentification rate. Focusing on N-glycoproteome profiling, the sample preparation steps for the glycomics-guided glycoproteomics method are detailed in this protocol, and key aspects of the data collection and analysis are discussed. The glycomics-guided glycoproteomics method provides quantitative information on the glycoproteins present in the TME and their glycosylation sites, site occupancy, and site-specific glycan structures. Representative results are presented from formalin-fixed paraffin-embedded tumor tissues from colorectal cancer patients, demonstrating that the method is sensitive and compatible with tissue sections commonly found in biobanks. Glycomics-guided glycoproteomics, therefore, offers a comprehensive view into the heterogeneity and dynamics of the glycoproteome in complex TMEs, generating robust biochemical data required to better understand the glycobiology of cancers.

<meta charset="utf8"></head><body>גליקופרוטאומיקה מונחית גליקומיקס מאפשרת יצירת פרופיל מקיפה של הגליקופרוטאום במיקרו-סביבות גידוליות מורכבות

This protocol details the glycomics-guided glycoproteomics method, an integrated omics technology that offers comprehensive insights into the heterogeneous glycoproteome in complex tumor microenvironments required to better understand the glycobiology of cancers.

גליקופרוטאומיקה מונחית גליקומיקס מאפשרת יצירת פרופיל מקיפה של הגליקופרוטאום במיקרו-סביבות גידוליות מורכבות 

Glycosylation is a common and structurally diverse protein modification that impacts a wide range of tumorigenic processes. Mass spectrometry-driven ...

Cancer Research

Identification and Characterization of Protein Glycosylation using Specific Endo- and Exoglycosidases

Glycosylation, the addition of covalently linked sugars, is a major post-translational modification of proteins that can significantly affect processes such as cell adhesion, molecular trafficking, clearance, and signal transduction1-4. In eukaryotes, the most common glycosylation modifications in the secretory pathway are additions at consensus asparagine residues (N-linked); or at serine or threonine residues (O-linked) (Figure 1). Initiation of N-glycan synthesis is highly conserved in eukaryotes, while the end products can vary greatly among different species, tissues, or proteins. Some glycans remain unmodified ("high mannose N-glycans") or are further processed in the Golgi ("complex N-glycans"). Greater diversity is found for O-glycans, which start with a common N-Acetylgalactosamine (GalNAc) residue in animal cells but differ in lower organisms1.
The detailed analysis of the glycosylation of proteins is a field unto itself and requires extensive resources and expertise to execute properly. However a variety of available enzymes that remove sugars (glycosidases) makes possible to have a general idea of the glycosylation status of a protein in a standard laboratory setting. Here we illustrate the use of glycosidases for the analysis of a model glycoprotein: recombinant human chorionic gonadotropin beta (hCG&beta;), which carries two N-glycans and four O-glycans 5. The technique requires only simple instrumentation and typical consumables, and it can be readily adapted to the analysis of multiple glycoprotein samples.
Several enzymes can be used in parallel to study a glycoprotein. PNGase F is able to remove almost all types of N-linked glycans6,7. For O-glycans, there is no available enzyme that can cleave an intact oligosaccharide from the protein backbone. Instead, O-glycans are trimmed by exoglycosidases to a short core, which is then easily removed by O-Glycosidase. The Protein Deglycosylation Mix contains PNGase F, O-Glycosidase, Neuraminidase (sialidase), &beta;1-4 Galactosidase, and &beta;-N-Acetylglucosaminidase. It is used to simultaneously remove N-glycans and some O-glycans8 . Finally, the Deglycosylation Mix was supplemented with a mixture of other exoglycosidases (&alpha;-N-Acetylgalactosaminidase, &alpha;1-2 Fucosidase, &alpha;1-3,6 Galactosidase, and &beta;1-3 Galactosidase ), which help remove otherwise resistant monosaccharides that could be present in certain O-glycans.
SDS-PAGE/Coomasie blue is used to visualize differences in protein migration before and after glycosidase treatment. In addition, a sugar-specific staining method, ProQ Emerald-300, shows diminished signal as glycans are successively removed. This protocol is designed for the analysis of small amounts of glycoprotein (0.5 to 2 &mu;g), although enzymatic deglycosylation can be scaled up to accommodate larger quantities of protein as needed.

Using specific glycosidases to remove sugars from glycoproteins followed by SDS-PAGE is a valuable method to detect glycan modifications on protein samples and is a good choice for initial glycobiology studies. Changes following deglycosylation can be detected as shifts in gel mobility or by staining with glycan sensitive reagents.

זיהוי ואפיון של חלבונים באמצעות glycosylation ספציפי אנדו ו exoglycosidases

Glycosylation, the addition of covalently linked sugars, is a major post-translational modification of proteins that can significantly affect processes ...

ניתוח של N- glycans של צנון sativus הזנים באמצעות PNGase H⁺

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

אפיון מבניים של מנן פוליסכרידים דופן התא בצמחים באמצעות קצב

Glycomics כמוני ואסטרטגית טיהור המשולבת פרוטאומיקה

כימותרפיה-אנזימטי סינתזה של N- glycans עבור מערך פיתוח נוגדן HIV פרופיל

N-glycan Profiling of Glycoproteins by Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography with Fluorescence and Mass Spectrometric Detection

Pulse-מרדף ניתוח של N-linked שרשראות סוכר מ גליקופרוטאינים בתאי יונקים

Nonspecific Proteolysis-Based Glycomics Strategy for Bacterial Glycoproteins

גליקופרוטאומיקה מונחית גליקומיקס מאפשרת יצירת פרופיל מקיפה של הגליקופרוטאום במיקרו-סביבות גידוליות מורכבות

גליקופרוטאומיקה מונחית גליקומיקס מאפשרת יצירת פרופיל מקיפה של הגליקופרוטאום במיקרו-סביבות גידוליות מורכבות

גליקופרוטאומיקה מונחית גליקומיקס מאפשרת יצירת פרופיל מקיפה של הגליקופרוטאום במיקרו-סביבות גידוליות מורכבות

זיהוי ואפיון של חלבונים באמצעות glycosylation ספציפי אנדו ו exoglycosidases