Name: analysis of n-glycans from raphanus sativus cultivars using pngase h+
Uploaded: 2018-06-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of N-glycans from Raphanus sativus Cultivars Using PNGase H+ at JoVE.com

أيد هذا العمل جزئيا "مؤسسة العلوم الطبيعية الصينية" (منح أرقام 31471703، A0201300537، و 31671854 إلى J.V. ول، منح عدد 31470435 G.Y.)، وهذه الخطة المواهب الأجنبية 100 (رقم المنحة JSB2014012 إلى J.V.).

1. جمع العينات
<ol><li>شراء أصناف مختلفة من الفجل الطازج (الزعفران فجل L.).</li>
</ol>2-عزل البروتين من فجل
<ol><li>مجانسة حوالي 100 جرام فجل الطازج مع خلاط مطبخ لمدة 10 دقائق.</li>
	<li>نقل الملاط إلى 50 مل أنبوبة الطرد المركزي وأجهزة الطرد المركزي في × 14,000 ز عند 4 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة إزالة المواد غير قابلة للذوبان.</li>
	<li>نقل المادة طافية بعناية في أنبوب 50 مل أجهزة الطرد مركزي جديدة وإضافة وحدة تخزين متساوية من حل حمض التريكلوروسيتيك (TCA) م 2. ملاحظة: إضافة كلورفورم الميثيل سوف يعجل بالبروتينات القابلة للذوبان (جليكو).</li>
	<li>الطرد المركزي في × 14,000 ز عند 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة وإزالة المادة طافية من البروتينات الأعلاف (جليكو).</li>
	<li>أغسل بيليه مع 20 مل من المياه وأجهزة الطرد المركزي في × 14,000 ز عند 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لإزالة oligosaccharides القابلة للذوبان والسكريات.</li>
	<li>كرر الخطوة 2، 5. أربع مرات.</li>
	<li>إعادة تعليق الكريات في 1 مل من المياه ونقلها إلى أنبوب الطرد مركزي طازجة 1.5 مل.</li>
</ol>3-إعداد N-جليكانس
<ol><li>ميكس 50 ميليلتر من حل البروتين من الخطوة 2.7. (ما يعادل 5 غ فجل الطازجة) مع مو 0.2 من بنغازي المؤتلف ح+ في حمض الخليك 10 ملم.</li>
	<li>احتضان الخليط رد الفعل عند 37 درجة مئوية ح 12. وبعد التفريخ، الطرد المركزي في × 14,000 ز لمدة 5 دقائق لإزالة الزائدة من البروتين والانزيم.</li>
	<li>نقل المادة طافية إلى أنبوب الطرد مركزي طازجة 1.5 مل.</li>
</ol>4-تنقية N-جليكانس
<ol><li>إعداد العمود الاستخراج المرحلة الصلبة (SPE) لإثراء N-جليكانس وإزالة الأملاح، وغيرها من الشوائب من خليط رد الفعل، زيادة القدرة الانتقائية لعامل وضع العلامات (2-AB) 2-أمينوبينزاميدي فلوروجينيك N-جليكان derivatization.<ol>
<li>أضف 3 مل مياه لغسل العمود.</li>
		<li>أضف 3 مل محلول الاسيتو الانيتريل 80% يحتوي على حامض trifluoroacetic (تفا، 0.1% v/v) إلى نشط جمعية مهندسي البترول العمود.</li>
		<li>أضف 3 مل مياه حجته العمود جمعية مهندسي البترول.</li>
	</ol>
</li>
	<li>نقل العينة من الخطوة 3، 3 على العمود وتجاهل في التدفق من خلال.</li>
	<li>إضافة 1.5 مل مياه ليغسل العمود وتجاهل في التدفق من خلال.</li>
	<li>الوت N-جليكانس المفرج عنهم من العمود باستخدام 1.5 مل محلول 20% الاسيتو الانيتريل مائي، يحتوي على 0.1% تفا (v/v) في أنبوب الطرد مركزي 2 مل.</li>
	<li>إزالة المذيب بالطرد المركزي التبخر في درجة حرارة الغرفة. تتبخر حتى تكون العينة جافة تماما.</li>
</ol>5-الأسفار Derivatization من N-جليكانس
<ol><li>إعداد 1 مل من محلول 2-AB، تتألف من 35 مم 2-آب وم 0.1 سيانوبوروهيدريدي الصوديوم في حل ثنائي ميثيل حمض الخليك/سلفوكسيد (7:3، v/v).</li>
	<li>إضافة 5 ميليلتر 2-آب حل للعينات المجففة (الخطوة 4.5.) المستمدة من ستة الفجل مختلفة. دوامة حل كل عينة حتى تماما.</li>
	<li>احتضان هذا الخليط ح 2 في 65 درجة مئوية.</li>
	<li>السماح لتبرد عينة وصولاً إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق، وإضافة 5 ميليلتر من المياه و 40 ميليلتر من الاسيتو الانيتريل. الطرد المركزي هذه الأنابيب في 14,000 س ز لمدة 3 دقائق.</li>
	<li>نقل 48 ميليلتر من المادة طافية في قنينة ميليلتر انتعاش عالية 300 [هبلك]. تخزين العينات-جليكان نديريفاتيزيد في-20 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.</li>
</ol>6-هيليك-UPLC التنميط من N-جليكانس
<ol><li>تحليل العينات باستخدام نظام أوبلك قياسية متصلة ديتيكتورسيت fluorescence عبر إنترنت عند أطوال موجية الإثارة/الانبعاثات من 330 نيوتن متر/420 نانومتر، على التوالي.</li>
	<li>استخدام لوني سائل في تفاعل مسعور (هيليك)-أوبلك جليكان عمود عند درجة حرارة 60 درجة مئوية للتحليل عمود.</li>
	<li>إعداد بالمذيبات بتمييع 50 مل من محلول الأسهم (الحل فورمات الأمونيوم 1 متر، والرقم الهيدروجيني 4.5) مع 950 مل من سائل الفصل اللوني-الكتلي (LCMS)-الصف المياه. إعداد الحل الأسهم على النحو التالي:<ol>
<li>إضافة 43 مل حمض الفورميك إلى 700 مل ح لكمس-الصف2o.</li>
		<li>قم بضبط درجة الحموضة إلى 4.5 بإضافة دروبويسي من محلول مائي الأمونيا (25% w/w).</li>
		<li>نقل المذيب لإسطوانة قياس وملء يصل إلى 1000 مل مع الصف لكمس ح2"سين مخزن" في 4-6 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3 أشهر.</li>
	</ol>
</li>
	<li>استخدام الصف لكمس الاسيتو الانيتريل كباء المذيبات</li>
	<li>فصل N-جليكانس مع شطف التدرج التالي:<ol>
<li>ابدأ بإضافة 95% ب المذيبات في المذيبات ألف مجموعة معدل التدفق في 0.5 مل/دقيقة من 0 إلى 44.5 دقيقة.</li>
		<li>تدريجيا من 0 دقيقة بدقيقة 6، يخفض نسبة المذيب ب مع ٪ to78 تدرج خطي.</li>
		<li>تدريجيا من 6 دقيقة بدقيقة 44.5، يخفض نسبة المذيب ب مع تدرج خطي إلى 55.9 في المائة.</li>
		<li>من 44.5 دقيقة بدقيقة 46.5، سرعة انخفاض نسبة المذيب ب مع تدرج خطي من 55.9 في المائة إلى 0% واضغط على 0% لمدة 2 دقيقة، والشروع في غسل العمود. خفض معدل التدفق إلى 0.25 مل/دقيقة من 44.5 إلى 55 دقيقة.</li>
		<li>أغسل العمود كذلك بزيادة ب المذيبات إلى 95% من 48.5 دقيقة بدقيقة 50.5 بنسبة 95% لدقيقة 4.5.</li>
		<li>إعادة توازن العمود إلى شروط الانطلاق من المذيبات 95% ب في 0.5 مل/دقيقة من 50.5 إلى 57 دقيقة.</li>
	</ol>
</li>
	<li>حقن ميليلتر 45 من العينة في النظام أوبلك.</li>
	<li>الوت N-جليكانس التي أوبلك مع الاحتفاظ بأوقات بين 15 و 40 دقيقة.</li>
	<li>جمع كل جزء ذروة UPLC لوحظ استخدام أنابيب الطرد المركزي 2 مل وتجفيف العينات بالتبخر الطرد المركزي.</li>
	<li>حقن حوالي 1 بمول من 2-آب المسمى ديكستران القياسية (2−20 الجلوكوز وحدات) لمعايرة المصنع-N-جليكان التنميط، وتعيين أوقات شطف الخاصة بهم إلى وحدات الجلوكوز موحدة.</li>
</ol>7-استخدام-TOF الكتلي
<ol><li>حل العينات المأخوذة من الخطوة 6.8 في 5 ميليلتر من لكمس-الصف المياه. ميكس 1 ميليلتر الحل عينة وميليلتر 1 6-عزة-2-ثيوثيميني (توري) الحل (0.3% w/v في الاسيتو الانيتريل المائية 70% v/v)، وماصة المخلوط على الناقل TOF استخدام عينة.</li>
	<li>تحليل العينات استخدام أداة مطياف كتلة TOF استخدام في وضع أيون إيجابية عن طريق الضغط على زر ابدأ .</li>
	<li>تحليل الأطياف الشامل باستخدام برنامج تحليل استخدام-TOF-MS المصاحبة لها.</li>
	<li>تفسير الأطياف باستخدام مصادر مفتوحة جليكان تفسير برامج19. تعيين معلمات البحث 2-آب وسم، [M + Na]+، وتعيين المعلمة دقة 2.0 دا.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Altmann, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Protein+Glycosylation+in+Allergy.">The Role of Protein Glycosylation in Allergy.</a> International Archives of Allergy and Immunology. 142 (2), 99-115 (2007).</li><li>Van Ree, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#946;+(1,+2)-xylose+and+&#945;+(1,+3)-fucose+residues+have+a+strong+contribution+in+IgE+binding+to+plant+glycoallergens.">&#946; (1, 2)-xylose and &#945; (1, 3)-fucose residues have a strong contribution in IgE binding to plant glycoallergens.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (15), 11451-11458 (2000).</li><li>Biswas, H., Chattopadhyaya, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+of+Curcuma+longa+rhizome+lectin:+Role+of+N-linked+glycosylation.">Stability of Curcuma longa rhizome lectin: Role of N-linked glycosylation.</a> Glycobiology. 26 (4), 410-426 (2016).</li><li>Lefebvre, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+N-glycosylation+sites+and+CXC+motifs+in+trafficking+of+Medicago+truncatula+Nod+factor+perception+protein+to+plasma+membrane.">Role of N-glycosylation sites and CXC motifs in trafficking of Medicago truncatula Nod factor perception protein to plasma membrane.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (14), 10812-10823 (2012).</li><li>Severino, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+glycan+moiety+on+the+structure-function+relationships+of+PD-L1,+type+1+ribosome-inactivating+protein+from+P.+dioica+leaves.">The role of the glycan moiety on the structure-function relationships of PD-L1, type 1 ribosome-inactivating protein from P. dioica leaves.</a> Molecular BioSystems. 6 (3), 570-579 (2010).</li><li>Lige, B., Ma, S., Van Huystee, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+the+site-directed+removal+of+N-glycosylation+from+cationic+peanut+peroxidase+on+its+function.">The effects of the site-directed removal of N-glycosylation from cationic peanut peroxidase on its function.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 386 (1), 17-24 (2001).</li><li>Ceriotti, A., Duranti, M., Bollini, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+N-glycosylation+on+the+folding+and+structure+of+plant+proteins.">Effects of N-glycosylation on the folding and structure of plant proteins.</a> Journal of Experimental Botany. 49 (324), 1091-1103 (1998).</li><li>Kamerling, J. P., Gerwig, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategies+for+the+Structural+Analysis+of+Carbohydrates.">Strategies for the Structural Analysis of Carbohydrates.</a> Comprehensive Glycoscience. , 1-68 (2007).</li><li>Huang, Y., Mechref, Y., Novotny, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscale+nonreductive+release+of+O-linked+glycans+for+subsequent+analysis+through+MALDI+mass+spectrometry+and+capillary+electrophoresis.">Microscale nonreductive release of O-linked glycans for subsequent analysis through MALDI mass spectrometry and capillary electrophoresis.</a> Analytical Chemistry. 73 (24), 6063-6069 (2001).</li><li>Triguero, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+and+enzymatic+N-glycan+release+comparison+for+N-glycan+profiling+of+monoclonal+antibodies+expressed+in+plants.">Chemical and enzymatic N-glycan release comparison for N-glycan profiling of monoclonal antibodies expressed in plants.</a> Analytical Biochemistry. 400 (2), 173-183 (2010).</li><li>Tretter, V., Altmann, F., Marz, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide-N4-(N-acetyl-&#946;-glucosaminyl)asparagine+amidase+F+cannot+release+glycans+with+fucose+attached+&#945;1+&#8594;+3+to+the+asparagine-linked+N-acetylglucosamine+residue.">Peptide-N4-(N-acetyl-&#946;-glucosaminyl)asparagine amidase F cannot release glycans with fucose attached &#945;1 &#8594; 3 to the asparagine-linked N-acetylglucosamine residue.</a> European Journal of Biochemistry. 199 (3), 647-652 (1991).</li><li>Fan, J. -. Q., Lee, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detailed+studies+on+substrate+structure+requirements+of+glycoamidases+A+and+F.">Detailed studies on substrate structure requirements of glycoamidases A and F.</a> Journal of Biological Chemistry. 272 (43), 27058-27064 (1997).</li><li>Altmann, F., Paschinger, K., Dalik, T., Vorauer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+peptide-N4-(N-acetyl-&#946;-glucosaminyl)asparagine+amidase+A+and+its+N-glycans.">Characterisation of peptide-N4-(N-acetyl-&#946;-glucosaminyl)asparagine amidase A and its N-glycans.</a> European Journal of Biochemistry. 252 (1), 118-123 (1998).</li><li>Altmann, F., Schweiszer, S., Weber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+comparison+of+peptide:+N-glycosidases+F+and+A+reveals+several+differences+in+substrate+specificity.">Kinetic comparison of peptide: N-glycosidases F and A reveals several differences in substrate specificity.</a> Glycoconjugate Journal. 12 (1), 84-93 (1995).</li><li>Wang, T., Voglmeir, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PNGases+as+valuable+tools+in+glycoprotein+analysis.">PNGases as valuable tools in glycoprotein analysis.</a> Protein and Peptide Letters. 21 (10), 976-985 (2014).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+and+characterization+of+a+novel+extremely+acidic+bacterial+N-glycanase+with+combined+advantages+of+PNGase+F+and+A.">Discovery and characterization of a novel extremely acidic bacterial N-glycanase with combined advantages of PNGase F and A.</a> Bioscience Reports. 34 (6), 00149 (2014).</li><li>Du, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+sample+preparation+methodology+for+plant+N-.glycan+analysis+using+acid-stable+PNGase+H+.">Rapid sample preparation methodology for plant N-.glycan analysis using acid-stable PNGase H+.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 63 (48), 10550-10555 (2015).</li><li>Wang, T., Hu, X. -. C., Cai, Z. -. P., Voglmeir, J., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Qualitative+and+Quantitative+Analysis+of+Carbohydrate+Modification+on+Glycoproteins+from+seeds+of+Ginkgo+biloba.">Qualitative and Quantitative Analysis of Carbohydrate Modification on Glycoproteins from seeds of Ginkgo biloba.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 65 (35), 7669-7679 (2017).</li><li>Ceroni, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GlycoWorkbench:+a+tool+for+the+computer-assisted+annotation+of+mass+spectra+of+glycans.">GlycoWorkbench: a tool for the computer-assisted annotation of mass spectra of glycans.</a> Journal of Proteome Research. 7 (4), 1650-1659 (2008).</li></ol>

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

يسمح البروتوكول وقد قدمنا هنا المقارنة بين الملامح-جليكان نمن أصناف شتى من الفجل. ميزة كبيرة لهذا الأسلوب مقارنة بالبروتوكولات القائمة أنه لا توجد تغييرات العازلة بين إطلاق سراح الانزيمية N-جليكانس ورد derivatization مع 2-آب مطلوبة. أن الخطوة الأكثر أهمية لهذا الإجراء هو تنقية N-جل?...

N-جليكانس في النباتات قد لفتت الانتباه المتزايد في السنوات الأخيرة، كما أبرزت البحوث السابقة N-جليكانس كمصدر محتمل كروسريكشنز المناعية التي قد تثير حساسية ردود1،2 . وقد ثبت سابقا أن N-جليكانس على جليكوبروتينس النباتية يمكن أن تؤثر على نشاط الحفاز3،4، ثبات وقابلة للطي5،6 أو التعريب سوبسيلولار و 7من إفراز. من أجل ربط هياكل جليكان مع المهام المنوطة بها، N-جليكانس يجب أولاً الإفراج عن من جليكوبروتينس أما كيميائيا أو انزيماتيكالي. هو الأسلوب الكيميائية الكلاسيكية للإفراج عن كل من N-و يا-جليكانس β-القضاء، الذي يرافق العلاج عينة القلوية الحد مع بورهيدريد تؤتي الديتول8. ومع ذلك، هذا الإجراء يحول دون وضع العلامات مع فلوروفوري وتسبب تسوس كبيرة من وحدات أحادي من نهاية الحد من هيكل جليكان. ديجليكوسيليشن الكيميائية استناداً إلى معاملة هيدروكسيد الأمونيوم/كربونات هو أيضا طريقة بديلة المستخدمة عادة9. أيا من هذه الأساليب الإفراج عن المواد الكيميائية يحط البروتينات سليمة، مما يسمح التحليل الشامل والمطيافيه برك جليكان غير مسمى دون تدخل الشظايا الببتيد في نفس النطاق الشامل. ومع ذلك، هو عيب واحد من هذه الأساليب معدل التدهور المتزايد α1, N3-فوكوسيلاتيد-جليكانس، العثور على هيكل مشترك الكربوهيدرات في النباتات10. وبدلاً من ذلك، الإصدار الانزيمية أساليب استخدام الببتيد:N-جليكاناسيس (بنجاسيس، المفوضية الأوروبية 3.5.1.52) تطبق أيضا على نطاق واسع. المؤتلف و بنغازي (من فلافوباكتيريوم meningosepticum) هو الخيار الأكثر شيوعاً ويسمح بالإفراج عن جميع أنواع N-جليكانس، عدا الهياكل التي تحمل α1 الأساسية، فوكس 311،12. ولذلك يستخدم عادة ببنغازي (معزولة من بذور اللوز) لتحليل النبات N-جليكانس13. غير أن هذا الإنزيم ديجليكوسيلاتيس فقط بروتيوليتيكالي المستمدة من جليكوبيبتيديس، وهو غير قادر على ديجليكوسيلاتي جليكوبروتينس الأصلية14. ومن ثم، مطلوب من workup نموذج متعدد خطوة قبل مزيد من التحليل، الذي يتسبب في خسائر كبيرة في جليكانس، لا سيما تلك التي وفرة منخفضة15. والهدف العام للأسلوب تقديم سير العمل أمثل للإصدار-جليكان نوالأسفار التي وصفها بطريقة بسيطة وقوية. الأساس المنطقي هو أن ح بنغازي+، الذي تم اكتشافه مؤخرا في roseus تيريجلوبوس ويمكن التعبير عن ريكومبينانتلي في كولاي، يمكن أن يتحلل N-جليكانس مباشرة من السقالة البروتين في الحمضية 16من الشروط. مزايا رئيسية لاستخدام أكثر الأساليب البديلة من بنغازي ح+ أن ردود الفعل وضع العلامات الفلورية يمكن أن يؤديها في أنبوب رد الفعل نفسه دون تغيير في رد فعل المخازن المؤقتة17،18. شروط إعداد بسيطة والانتعاش عالية من oligosaccharides وفرة منخفضة تجعل هذا الأسلوب أداة قيمة في تحليل N-جليكانس. هذا البروتوكول مناسبة لتحليل N-جليكانس من مختلف الأنواع النباتية.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Chemicals:&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trichloroacetic acid&amp;nbsp;</td><td>SCR, Shanghai</td><td>80132618</td><td></td></tr><tr><td>Acetic acid glacial</td><td>Huada, Guangzhou</td><td>64-19-7</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>General-reagent</td><td>G80988C</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoroacetic acid</td><td>Energy chemical</td><td>W810031</td><td></td></tr><tr><td>2-aminobenzamide</td><td>Heowns, Tianjin</td><td>A41900</td><td></td></tr><tr><td>Sodium cyanoborohydride</td><td>J&amp;amp;K Scientific Ltd</td><td>314162</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Huada, Guangzhou</td><td>67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>2AB-labeled dextran ladder, 200 pmol</td><td>Agilent Technologies</td><td>AT-5190-6998</td><td></td></tr><tr><td>6-Aza-2-thiothymine&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>275514</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Tools/Materials:&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kitchen blender</td><td>Bear, Guangzhou</td><td>LLJ-A10T1</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Techcomp</td><td>CT15RT</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugal Evaporator</td><td>Hualida, Taicang</td><td>LNG-T120</td><td></td></tr><tr><td>SPE column</td><td>Supelco</td><td>Supelclean ENVI Carb SPE column</td><td></td></tr><tr><td>MALDI-TOF mass spectrometer</td><td>Bruker</td><td>Autoflex</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;HPLC Analysis:&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>High-recovery HPLC vial</td><td>Agilent Technologies</td><td>&amp;nbsp;# 5188-2788</td><td></td></tr><tr><td>HPLC System</td><td>Shimadzu</td><td>Nexera</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence Detector for HPLC</td><td>Shimadzu</td><td>RF-20Axs&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Column oven</td><td>Hengxin</td><td>CO-2000</td><td></td></tr><tr><td>HPLC Column</td><td>Waters</td><td>Acquity UPLC BEH glycan column</td><td>2.1 &amp;times; 150 mm, 1.7 &amp;mu;m particle size</td></tr><tr><td>LCMS-grade Water</td><td>Merck Millipore</td><td>#WX00011</td><td></td></tr><tr><td>LCMS-grade Acetonitrile</td><td>Merck Millipore</td><td># 100029</td><td></td></tr><tr><td>Formic acid</td><td>Aladdin</td><td>F112034</td><td></td></tr><tr><td>Ammonia solution</td><td>Aladdin</td><td>A112080</td><td></td></tr></tbody></table>

analysis of n-glycans from raphanus sativus cultivars using pngase h+

في السنوات الأخيرة، مويتيس الكربوهيدرات من النباتات قد حظي باهتمام كبير، كما مصدر محتمل للاستجابات المناعية تحسن، والمثيرة للحساسية. وباﻹضافة إلى ذلك، هياكل الكربوهيدرات أيضا أن تلعب دوراً حاسما في الأيض النباتية. وهنا، يقدم طريقة بسيطة وسريعة لإعداد وتحليل نون-جليكانس من أصناف مختلفة من الفجل (فجل الزعفران) باستخدام N-جليكاناسي محددة للإفراج عن هياكل الكربوهيدرات المشتقة من النباتات. ولتحقيق ذلك، رواسب الخام التريكلوروسيتيك حامض من الفجل هوموجيناتيس تعامل مع بنغازي ح+، والمسمى باستخدام 2-أمينوبينزاميدي كعلامة نيون. حللت العينات-جليكان نالمسمى فيما بعد بالليزر ساعد مصفوفة الامتزاز التأين وقت للطيران (استخدام-TOF) الطيف الكتلي لهيكلي مفصلة وفائقة الأداء اللوني السائل (أوبلك) فصل تقييم وتقدير أبوندانسيس النسبية لهياكل المستمدة من الفجل-جليكان ن. هذا البروتوكول يمكن أن تستخدم أيضا لتحليل N-جليكانس من مختلف الأنواع النباتية الأخرى، وقد يكون من المفيد إجراء مزيد من التحقيقات للدالة وآثار N-جليكانس على صحة الإنسان.

ويبين الشكل 1 نظرة تخطيطية لوصف البروتوكول، بما في ذلك عزل البروتينات (جليكو-) من فجل وإعداد N-جليكانس، وتحليل أوبلك وتحليل استخدام-TOF-مرض التصلب العصبي المتعدد لهذه المكونات. ويبين الشكل 2 الممثل تشروماتوجرامس أوبلك من ديريفاتيزيد ?...

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of N-glycans from Raphanus sativus Cultivars Using PNGase H+ at JoVE.com

Analysis of N-glycans from Raphanus sativus Cultivars Using PNGase H+

تحليل N-جليكانس من الزعفران فجل أصناف بنغازي استخدام ح+

يصف لنا طريقة بسيطة وسريعة لإعداد وتحليل نون-جليكانس من أصناف مختلفة من الفجل (الزعفران فجل).

In recent years, the carbohydrate moieties of plants have received considerable attention, as they are a potential source of cross-reactive, ...

analysis-of-n-glycans-from-raphanus-sativus-cultivars-using-pngase-h

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Analysis of N-glycans from Raphanus sativus Cultivars Using PNGase H+

6.6K Views.  Nanjing Agricultural University. يصف لنا طريقة بسيطة وسريعة لإعداد وتحليل نون-جليكانس من أصناف مختلفة من الفجل (الزعفران فجل).

Video: Analysis of N-glycans from Raphanus sativus Cultivars Using PNGase H+

Structural Characterization of Mannan Cell Wall Polysaccharides in Plants Using PACE

Plant cell wall polysaccharides are notoriously difficult to analyze, and most methods require expensive equipment, skilled operators, and large amounts of purified material. Here, we describe a simple method for gaining detailed polysaccharide structural information, including resolution of structural isomers. For polysaccharide analysis by gel electrophoresis (PACE), plant cell wall material is hydrolyzed with glycosyl hydrolases specific to the polysaccharide of interest (e.g., mannanases for mannan). Large format polyacrylamide gels are then used to separate the released oligosaccharides, which have been fluorescently labeled. Gels can be visualized with a modified gel imaging system (see Table of Materials). The resulting oligosaccharide fingerprint can either be compared qualitatively or, with replication, quantitatively. Linkage and branching information can be established using additional glycosyl hydrolases (e.g., mannosidases and galactosidases). Whilst this protocol describes a method for analyzing glucomannan structure, it can be applied to any polysaccharide for which characterized glycosyl hydrolases exist. Alternatively, it can be used to characterize novel glycosyl hydrolases using defined polysaccharide substrates.

A protocol for the structural analysis of polysaccharides by gel electrophoresis (PACE), using mannan as an example, is described.

توصيف الهيكلية من السكريات جدار الخلية المنان في النباتات باستخدام خطي

Plant cell wall polysaccharides are notoriously difficult to analyze, and most methods require expensive equipment, skilled operators, and large amounts ...

A Quantitative Glycomics and Proteomics Combined Purification Strategy

There is a growing desire in the biological and clinical sciences to integrate and correlate multiple classes of biomolecules to unravel biology, define pathways, improve treatment, understand disease, and aid biomarker discovery. N-linked glycosylation is one of the most important and robust post-translational modifications on proteins and regulates critical cell functions such as signaling, adhesion, and enzymatic function. Analytical techniques to purify and analyze N-glycans have remained relatively static over the last decade. While accurate and effective, they commonly require significant expertise and resources. Though some high-throughput purification schemes have been developed, they have yet to find widespread adoption and often rely on the enrichment of glycopeptides. One promising method, developed by Thomas-Oates et al., filter aided N-glycan separation (FANGS), was qualitatively demonstrated on tissues. Herein, we adapted FANGS to plasma and coupled it to the individuality normalization when labeling with glycan hydrazide tags strategy in order to achieve accurate relative quantification by liquid chromatography mass spectrometry and enhanced electrospray ionization. Furthermore, we designed new functionality to the protocol by achieving tandem, shotgun proteomics and glycosylation site analysis on hen plasma. We showed that N-glycans purified on filter and derivatized by hydrophobic hydrazide tags were comparable in terms of abundance and class to those by solid phase extraction (SPE); the latter is considered a gold standard in the field. Importantly, the variability in the two protocols was not statistically different. Proteomic data that was collected in-line with glycomic data had the same depth compared to a standard trypsin digest. Peptide deamidation is minimized in the protocol, limiting non-specific deamidation detected at glycosylation motifs. This allowed for direct glycosylation site analysis, though the protocol can accommodate 18O site labeling as well. Overall, we demonstrated a new in-line high-throughput, unbiased, filter based protocol for quantitative glycomics and proteomics analysis.

A high-throughput protocol was developed for combined proteomics and glycomics purification and LC-MS/MS quantification in plasma. Deamidation analysis of N-linked glycosylation motifs was specific to deglycosylated sites. Accurate quantitation of N-glycans was achieved by coupling filter aided N-glycan separation to the individuality normalization when labeling with glycan hydrazide tags strategy.

والكمي Glycomics والبروتيوميات المشتركة الاستراتيجية تنقية

There is a growing desire in the biological and clinical sciences to integrate and correlate multiple classes of biomolecules to unravel biology, define ...

Chemistry

Chemo-enzymatic Synthesis of N-glycans for Array Development and HIV Antibody Profiling

We present a highly efficient way for the rapid preparation of a wide range of N-linked oligosaccharides (estimated to exceed 20,000 structures) that are commonly found on human glycoproteins. To achieve the desired structural diversity, the strategy began with the chemo-enzymatic synthesis of three kinds of oligosaccharyl fluoride modules, followed by their stepwise &#945;-selective glycosylations at the 3-O and 6-O positions of the mannose residue of the common core trisaccharide having a crucial &#946;-mannoside linkage. We further attached the N-glycans to the surface of an aluminum oxide-coated glass (ACG) slide to create a covalent mixed array for the analysis of hetero-ligand interaction with an HIV antibody. In particular, the binding behavior of a newly isolated HIV-1 broadly neutralizing antibody (bNAb), PG9, to the mixture of closely spaced Man5GlcNAc2 (Man5) and 2,6-di-sialylated bi-antennary complex type N-glycan (SCT) on an ACG array, opens a new avenue to guide the effective immunogen design for HIV vaccine development. In addition, our ACG array embodies a powerful tool to study other HIV antibodies for hetero-ligand binding behavior.

Chemo-enzymatic Synthesis of N-glycans for Array Development and HIV Antibody Profiling

A modular approach to the synthesis of N-glycans for attachment to an aluminum oxide-coated glass slide (ACG slide) as a glycan microarray has been developed and its use for the profiling of an HIV broadly neutralizing antibody has been demonstrated.

توليف الكيماوي الانزيمية من N-جليكانس للتنمية الصفيف وأضداد الفيروس التنميط

We present a highly efficient way for the rapid preparation of a wide range of N-linked oligosaccharides (estimated to exceed 20,000 structures) that are ...

N-glycan Profiling of Glycoproteins by Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography with Fluorescence and Mass Spectrometric Detection

Glycosylation is a vital modification found in proteins. N-glycan profiling of glycoproteins is required to detect novel biomarker candidates and determine glycan alterations in diseases. Most commercially available biopharmaceutical proteins are glycoproteins. The efficacy of these drugs is affected by glycosylation patterns. Therefore, an in-depth characterization method for the N-glycans is necessary. Here, we present a comprehensive approach for qualitative and quantitative analysis of N-glycans using hydrophilic interaction liquid chromatography equipped with fluorescence detection and tandem mass spectrometry (HILIC-FLD-MS/MS). N-glycans were released from glycoproteins with a facile method and labeled by a procainamide fluorophore tag in the strategy. Subsequently, the procainamide labeled N-glycans were analyzed by a HILIC-FLD-MS/MS technique. In this approach, N-glycan structures were confirmed by the tandem mass spectrometric analysis, whereas fluorescence detection was used for the quantitative analysis. An application for data analysis of the detected N-glycan peaks is described in the study. This protocol can be applied to any glycoprotein extracted from various species.

N-glycan Profiling of Glycoproteins by Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography with Fluorescence and Mass Spectrometric Detection

N-glycan profiling of glycoproteins is essential for discovering novel biomarkers and understanding glycan functions in cellular events. Additionally, N-glycan analysis of protein biopharmaceuticals is very important for human use. In this current article, a high-throughput strategy for identifying and quantifying N-glycan structures was presented using the HILIC-FLD-MS/MS technique.

Glycosylation is a vital modification found in proteins. N-glycan profiling of glycoproteins is required to detect novel biomarker candidates and ...

Pulse-chase Analysis of N-linked Sugar Chains from Glycoproteins in Mammalian Cells

Attachment of the Glc3Man9GlcNAc2 precursor oligosaccharide to nascent polypeptides in the ER is a common modification for secretory proteins. Although this modification was implicated in several biological processes, additional aspects of its function are emerging, with recent evidence of its role in the production of signals for glycoprotein quality control and trafficking. Thus, phenomena related to N-linked glycans and their processing are being intensively investigated. Methods that have been recently developed for proteomic analysis have greatly improved the characterization of glycoprotein N-linked glycans. Nevertheless, they do not provide insight into the dynamics of the sugar chain processing involved. For this, labeling and pulse-chase analysis protocols are used that are usually complex and give very low yields. We describe here a simple method for the isolation and analysis of metabolically labeled N-linked oligosaccharides. The protocol is based on labeling of cells with [2-3H] mannose, denaturing lysis and enzymatic release of the oligosaccharides from either a specifically immunoprecipitated protein of interest or from the general glycoprotein pool by sequential treatments with endo H and N-glycosidase F, followed by molecular filtration (Amicon). In this method the isolated oligosaccharides serve as an input for HPLC analysis, which allows discrimination between various glycan structures according to the number of monosaccharide units comprising them, with a resolution of a single monosaccharide. Using this method we were able to study high mannose N-linked oligosaccharide profiles of total cell glycoproteins after pulse-chase in normal conditions and under proteasome inhibition. These profiles were compared to those obtained from an immunoprecipitated ER-associated degradation (ERAD) substrate. Our results suggest that most NIH 3T3 cellular glycoproteins are relatively stable and that most of their oligosaccharides are trimmed to Man9-8GlcNAc2. In contrast, unstable ERAD substrates are trimmed to Man6-5GlcNAc2 and glycoproteins bearing these species accumulate upon inhibition of proteasomal degradation.

We describe a method for analysis of the alteration of N-linked glycans through the early life of glycoproteins after their biosynthesis in mammalian cells. This is achieved by pulse-chase analysis of metabolically labeled glycans, enzymatic release from glycoproteins and examination by HPLC.

نبض مطاردة تحليل سلاسل السكر N - الموصولة من جليكوبروتينات في خلايا الثدييات

Attachment of the Glc3Man9GlcNAc2 precursor oligosaccharide to nascent polypeptides in the ER is a common modification for secretory proteins. Although ...

Biology

Nonspecific Proteolysis-Based Glycomics Strategy for Bacterial Glycoproteins

Protein glycosylation is one of the most common and complex post-translational modifications. Many techniques have been developed to characterize the specific roles of glycans, the relationship between their structures and their impact on the functions of proteins. A common method for glycan analysis is to employ exoglycosidase cleavage to release N-linked glycans from glycoproteins or glycopeptides using Peptide-N-Glycosidase F (PNGase F). However, the glycan-protein linkages in bacteria are different and there is no enzyme available to release glycans from bacterial glycoproteins. In addition, free glycans have also been described in mammalian cells, bacteria, yeast, plants, and fish. In this article, we present a method that can characterize the N-linked glycosylation system in Campylobacter jejuni by detecting asparagine (Asn)-linked and free glycans that are not attached to their target proteins. In this method, total proteins from C. jejuni were digested by Pronase E with a higher enzyme to protein ratio (2:1&#8722;3:1) and a longer incubation time (48&#8722;72 h). The resulted Asn-glycans and free glycans were then purified using porous graphitic carbon cartridges, permethylated, and analyzed by mass spectrometry.

This study presents a method for glycomics analysis of glycoproteins by a combination of pronase E digestion, permethylation, and mass spectrometry analysis. This method is capable of analyzing all types of N-linked glycans, including bacterial N-glycans.

Protein glycosylation is one of the most common and complex post-translational modifications. Many techniques have been developed to characterize the ...

<meta charset="utf8"></head><body>تنميط أنسجة سرطان القولون والمستقيم باستخدام Glycoproteomics الموجه بالغليكوميكس

Glycomics-Guided Glycoproteomics Facilitates Comprehensive Profiling of the Glycoproteome in Complex Tumor Microenvironments

Glycosylation is a common and structurally diverse protein modification that impacts a wide range of tumorigenic processes. Mass spectrometry-driven glycomics and glycoproteomics have emerged as powerful approaches to analyze liberated glycans and intact glycopeptides, respectively, offering a deeper understanding of the heterogeneous glycoproteome in the tumor microenvironment (TME). This protocol details the glycomics-guided glycoproteomics method, an integrated omics technology, which firstly employs porous graphitized carbon-LC-MS/MS-based glycomics to elucidate the glycan structures and their quantitative distribution in the glycome of tumor tissues, cell populations, or bodily fluids being investigated. This allows for a comparative glycomics analysis to identify altered glycosylation across patient groups, disease stages, or conditions, and, importantly, serves to enhance the downstream glycoproteomics analysis of the same sample(s) by creating a library of known glycan structures, thus reducing the data search time and the glycoprotein misidentification rate. Focusing on N-glycoproteome profiling, the sample preparation steps for the glycomics-guided glycoproteomics method are detailed in this protocol, and key aspects of the data collection and analysis are discussed. The glycomics-guided glycoproteomics method provides quantitative information on the glycoproteins present in the TME and their glycosylation sites, site occupancy, and site-specific glycan structures. Representative results are presented from formalin-fixed paraffin-embedded tumor tissues from colorectal cancer patients, demonstrating that the method is sensitive and compatible with tissue sections commonly found in biobanks. Glycomics-guided glycoproteomics, therefore, offers a comprehensive view into the heterogeneity and dynamics of the glycoproteome in complex TMEs, generating robust biochemical data required to better understand the glycobiology of cancers.

<meta charset="utf8"></head><body>يسهل Glycoproteomics الموجه ب Glycomics التنميط الشامل للجليكوبروتيوم في البيئات الدقيقة المعقدة للورم

This protocol details the glycomics-guided glycoproteomics method, an integrated omics technology that offers comprehensive insights into the heterogeneous glycoproteome in complex tumor microenvironments required to better understand the glycobiology of cancers.

يسهل Glycoproteomics الموجه ب Glycomics التنميط الشامل للجليكوبروتيوم في البيئات الدقيقة المعقدة للورم 

Glycosylation is a common and structurally diverse protein modification that impacts a wide range of tumorigenic processes. Mass spectrometry-driven ...

Cancer Research

Identification and Characterization of Protein Glycosylation using Specific Endo- and Exoglycosidases

Glycosylation, the addition of covalently linked sugars, is a major post-translational modification of proteins that can significantly affect processes such as cell adhesion, molecular trafficking, clearance, and signal transduction1-4. In eukaryotes, the most common glycosylation modifications in the secretory pathway are additions at consensus asparagine residues (N-linked); or at serine or threonine residues (O-linked) (Figure 1). Initiation of N-glycan synthesis is highly conserved in eukaryotes, while the end products can vary greatly among different species, tissues, or proteins. Some glycans remain unmodified ("high mannose N-glycans") or are further processed in the Golgi ("complex N-glycans"). Greater diversity is found for O-glycans, which start with a common N-Acetylgalactosamine (GalNAc) residue in animal cells but differ in lower organisms1.
The detailed analysis of the glycosylation of proteins is a field unto itself and requires extensive resources and expertise to execute properly. However a variety of available enzymes that remove sugars (glycosidases) makes possible to have a general idea of the glycosylation status of a protein in a standard laboratory setting. Here we illustrate the use of glycosidases for the analysis of a model glycoprotein: recombinant human chorionic gonadotropin beta (hCG&beta;), which carries two N-glycans and four O-glycans 5. The technique requires only simple instrumentation and typical consumables, and it can be readily adapted to the analysis of multiple glycoprotein samples.
Several enzymes can be used in parallel to study a glycoprotein. PNGase F is able to remove almost all types of N-linked glycans6,7. For O-glycans, there is no available enzyme that can cleave an intact oligosaccharide from the protein backbone. Instead, O-glycans are trimmed by exoglycosidases to a short core, which is then easily removed by O-Glycosidase. The Protein Deglycosylation Mix contains PNGase F, O-Glycosidase, Neuraminidase (sialidase), &beta;1-4 Galactosidase, and &beta;-N-Acetylglucosaminidase. It is used to simultaneously remove N-glycans and some O-glycans8 . Finally, the Deglycosylation Mix was supplemented with a mixture of other exoglycosidases (&alpha;-N-Acetylgalactosaminidase, &alpha;1-2 Fucosidase, &alpha;1-3,6 Galactosidase, and &beta;1-3 Galactosidase ), which help remove otherwise resistant monosaccharides that could be present in certain O-glycans.
SDS-PAGE/Coomasie blue is used to visualize differences in protein migration before and after glycosidase treatment. In addition, a sugar-specific staining method, ProQ Emerald-300, shows diminished signal as glycans are successively removed. This protocol is designed for the analysis of small amounts of glycoprotein (0.5 to 2 &mu;g), although enzymatic deglycosylation can be scaled up to accommodate larger quantities of protein as needed.

Using specific glycosidases to remove sugars from glycoproteins followed by SDS-PAGE is a valuable method to detect glycan modifications on protein samples and is a good choice for initial glycobiology studies. Changes following deglycosylation can be detected as shifts in gel mobility or by staining with glycan sensitive reagents.

تحديد وتوصيف ارتباط بالغليكوزيل باستخدام بروتين معين إندو وexoglycosidases

Glycosylation, the addition of covalently linked sugars, is a major post-translational modification of proteins that can significantly affect processes ...

تحليل N-جليكانس من الزعفران فجل أصناف بنغازي استخدام ح⁺

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

توصيف الهيكلية من السكريات جدار الخلية المنان في النباتات باستخدام خطي

والكمي Glycomics والبروتيوميات المشتركة الاستراتيجية تنقية

توليف الكيماوي الانزيمية من N-جليكانس للتنمية الصفيف وأضداد الفيروس التنميط

N-glycan Profiling of Glycoproteins by Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography with Fluorescence and Mass Spectrometric Detection

نبض مطاردة تحليل سلاسل السكر N - الموصولة من جليكوبروتينات في خلايا الثدييات

Nonspecific Proteolysis-Based Glycomics Strategy for Bacterial Glycoproteins

يسهل Glycoproteomics الموجه ب Glycomics التنميط الشامل للجليكوبروتيوم في البيئات الدقيقة المعقدة للورم

يسهل Glycoproteomics الموجه ب Glycomics التنميط الشامل للجليكوبروتيوم في البيئات الدقيقة المعقدة للورم

يسهل Glycoproteomics الموجه ب Glycomics التنميط الشامل للجليكوبروتيوم في البيئات الدقيقة المعقدة للورم

تحديد وتوصيف ارتباط بالغليكوزيل باستخدام بروتين معين إندو وexoglycosidases