Name: in vivo photolabeling of cells in the colon to assess migratory potential of hematopoietic cells in neonatal mice
Uploaded: 2018-08-10T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Photolabeling of Cells in the Colon to Assess Migratory Potential of Hematopoietic Cells in Neonatal Mice at JoVE.com

Nitya Jain נתמכה על ידי NIH/NIAID הקריירה המעבר פרס 1K22AI116661-01.

כל ההליכים בבעלי חיים בוצעו עם האישור של ובציות על טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) בבית החולים הכללי במסצ'וסטס.
התראה: פרוטוקול זה כרוכה בשימוש של class 3b לייזר (LG3). משקפי בטיחות לייזר LG3 תמיד חייב לשמש בעת הפעלת הלייזר הזה. חייב להיות במעקב הנחיות בטיחות והדרכה המתאימים כדי למנוע את הסיכון לפציעות.
1. עיצוב והרכבה של לייזר
<ol><li>לחבר את דיודות פולטות אור (LED) (405 ננומטר, 19.3 mW, אמא 1400, מצמידים סיבים) LED הנהג באמצעות הכבל המחבר של 4 פינים M8 המגיע מחובר ה-LED. בזהירות להדק את הבורג כדי להדק את הקשר.</li>
	<li>לפני חיבור כבל תיקון ה optogenetics ה-LED, להחזיק את המחבר פתיחה של ה-LED עד האור כדי להבטיח שם הביתור לא נראה לעין. תנשוף על החור כדי למנוע כל הפרעה במידת הצורך, הכנס את כבל תיקון optogenetics לתוך הפתח.</li>
	<li>לחבר את הצינורית סיבים אופטיים הכבל תיקון optogenetics על-ידי הוספת את הצינורית אחד מהקצוות של השרוול המחבר. לצרף את הקצה השני של השרוול מחבר כבל תיקון.  מספיק ללחוץ כדי לאבטח את הקשר אך הקפד לא לכופף או לפרוץ את סיב אופטי הצינורית. הערה: הצינורית סיב אופטי סיבים שביר הוא מכוסה את המכסה המגן בכל פעם הלייזר אינו בשימוש.</li>
	<li>הגדר את הנהג LED למצב (CW) רציף wave עם הידית התאמה רציפה-0 והגבול הנוכחי מוגדר כ- 1.2 א</li>
</ol>2. Photoconversion של תאים במעי הגס
הערה: זכר ונקבה עכברים נחשפו intracolonic 405 ננומטר אור 1-2 ימים לאחר הלידה שלהם, הוקרבו לפני שבוע 1 של גיל.
<ol><li>לאבטח ממיקום כהה עם גישה לשקע חשמל. הנהג LED מתחברים לשקע. הערה: הליך זה מבוצע באור לבן מינימלית כמו חשיפה ממושכת של העכברים תאורת עלול לגרום photoconversion לא רצויים של תאים. אור אדום משמש כחלופה. התראה: השלב הבא כרוכה בשימוש של חיה הרדמה. הממשל של ההרדמה מתבצעת בשכונה Class II או באמצעות מערכת הניקוי המתאים אחרת. שאיפת ההרדמה עלול לגרום סחרחורת, נמנום או אפילו חוסר הכרה.</li>
	<li>עזים ומתנגד העכבר על ידי חשיפה לאיזופלוריין 4-5% 100% O2 בתיבת אינדוקציה. לאמת עומק נאותה של הרדמה על ידי בחוזקה צובט כפה האחוריות (ללא תגובה). לשמור על הרדמה באמצעות קונוס האף כ 2% איזופלוריין. למנוע חשיפה המטפל איזופלוריין על ידי שימוש של המנוע המתאים או התקן הניקוי הרדמה.</li>
	<li>מיקום העכבר anesthetized לחשיפה intracolonic באמצעות 1 יד על עורפה האחורי של העכבר בעדינות עם האגודל והאצבע. . תהפוך את העכבר כדי לחשוף את הבטן שחרר את אחיזת אם העכבר מתחיל. לאבד את צבעו ורוד או אם קצב הנשימות שלה מתחיל להאט. אבטח את הזנב של העכבר בין כביש הטבעת של האצבעות.</li>
	<li>עם היד השנייה, להסיר את המכסה המגן הצינורית. תוך שמירה על ציר הארוך של הצינורית במקביל קו האמצע של העכבר, הכנס בעדינות את הצינורית סיבים אופטיים דרך פי הטבעת לתוך המעי הגס כך כל 5 מ מ של סיבים אופטיים הם בתוך העכבר. הערה: הליך זה מתבצע לאט ובזהירות, לא כדי לנקב את הקיר חוקן. דקה נענוע ומתפתל של הצינורית עזרי קידום לתוך המעי הגס.</li>
	<li>דון את משקפי בטיחות ולהגדיל את הלייזר הנוכחי לערך המרבי (כל הדרך עם כיוון השעון). לאשר הנוכחות של אור UV על ידי הסתכלות על הבטן שקוף של העכבר. הערה: משקפי בטיחות לייזר LG3 באופן דרמטי להפחית הניראות. יש לסייע עמית (ללבוש ציוד מגן) עוטה את משקפי המגן, הפעלת הלייזר.</li>
	<li>לחשוף את המעי הגס כדי אור לייזר עבור סכום כולל של 2 דק להחלפה הצינורית כ- 1 מ מ לכל 30 s כדי למקסם את האזור luminal חשוף לאור. בסוף 2 דקות, כבה את הלייזר.</li>
	<li>אט-אט להסיר את הצינורית של העכבר. לאחר התאוששות מהרדמה בכלוב חמים ריק, להחזיר את העכבר לכלוב הביתה.</li>
</ol>3. בידוד של לימפוציטים מעיים
<ol><li>להכנת 1 ליטר של ההאנק פתרון מאוזן מלח/עגל סרום (HBSS/CS) המאגר, 200 מ ל רצועת אפיתל המאגר, 500 מ"ל של שטיפת מדיה ו- 200 מ ל חומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA)-ללא שטיפת המדיה. הערה: אמצעי האחסון ריאגנט מחושבות עבור גודל דגימה של 9.<ol>
<li>להפוך את המאגר HBSS/מדעי המחשב (HBSS; 5% CS) על-ידי הוספת 50 מ של CS עד 950 מ"ל של HBSS. אחסן אותו בקרח.</li>
		<li>הכנת המאגר רצועת אפיתל [HBSS CS 5% 1 מ dithiothreitol (DTT); 5 מ מ EDTA; 15 מ מ- 4-(2-Hydroxyethyl)-piperazine-1-ethanesulfonic-חומצה (HEPES) (pH 7.2-7.5)] על-ידי הוספת 10 מ"ל של CS, 200 µL של 1 מ' DTT, 2 מ של EDTA 0.5 M ו- 3 מ של 1 מ' HEPES מאגר 185 מ של HBSS. מקום המאגר רצועת אפיתל באמבט מים 37 º C.</li>
		<li>להפוך את המדיה לשטוף (HBSS; 1% CS 1 מ"מ EDTA) על-ידי הוספת 5 מ ל CS 1 מ"ל של 0.5 M EDTA 494 מ של HBSS. אחסן אותו בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>להכין ללא EDTA שטיפת המדיה (15 מ מ HEPES; HBSS; 1% CS) על-ידי הוספת 2 מ"ל של CS ו- 3 מ"ל של 1 מ' HEPES 195 מ של HBSS. אחסן אותו בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>להפוך את מאגר FACS [1 x buffered פוספט תמיסת מלח (PBS) (ה-pH = 7.2); CS 2%] על-ידי הוספת 10 מ"ל של CS 490 מ של PBS. אחסן אותו בקרח.</li>
	</ol></li>
	<li>להכין את המאכל אוסף רקמה על-ידי הצבת מסננת תא מיקרומטר 70 בתוך לצלחת תרבות 60 x 10 מ מ. להוסיף 10 מ ל מאגר HBSS/מדעי המחשב (HBSS; מאגר CS 5% שבוצעו בשלב 3.1.1 ומאוחסנים על קרח) לצלחת ומניחים אותו על הקרח.</li>
	<li>המתת חסד את העכבר באמצעות מנת יתר של איזופלוריין בשאיפה באמצעות ניקוי המתאים של הרדמה (כ 3 דקות חשיפה > איזופלוריין 4% באוויר חדר או ב- 100% O2). לאחר הפסקת לכאורה של נשימה, רפלקס תנועה, לוודא העדר כאב עמוק על-ידי בחוזקה צובט כפה האחוריות (באמצעות מלקחיים מומלץ). ודא המתת החסד באמצעות עריפת ראש באמצעות זוג מספריים כירורגיים או תער חדש. הערה: נקע בצוואר הרחם לא מומלץ בשלב זה עקב גודל גיל של החיה. שיטות אלה תואמים ההנחיות AVMA 2013 על המתת חסד ואושרו על-ידי IACUC MGH.</li>
	<li>הקציר המעי הגס באמצעות מלקחיים נקי ומספריים כדי לפתוח את הבטן. משקפים את המעיים לצד 1 של הבטן של העכבר כדי לחשוף את המעי הגס. להסיר את כל המעי הגס על ידי הראשון transecting זה רק הדיסטלי (לכיוון פי הטבעת) כדי המעי. לאחר מכן, בזמן אוחז בחוזקה המעי הגס עם מלקחיים, להשתמש במספריים לחתוך דרך השופכה אל החלחולת. חותכים את המעי הגס כמו קרוב לפי הטבעת ככל האפשר. הקציר הטחול לאחר הסרת המעי הגס (ראה שלבים 4.1-4.2 להלן). הערה: בזמן פרוטוקול photoconversion רק מטרות ~ 25% של המעי הגס של היילוד (5 מ מ הצינורית סיבים אופטיים), המעי הגס כולו האיסוף כדי לסייע בבידוד התא.</li>
	<li>ניקוי המעי הגס באמצעות מלקחיים כדי לדחוף את תוכן המעי הגס, על גבי מגבת נייר יבש. Homogenize הרקמה באמצעות סכיני קוצצים המעי הגס לתוך עיסה על השער של צלחת תרבות ואז להעביר את הדבק הזה מסננת תאים בצלוחית הפטרי.</li>
	<li>להוסיף פס מגנטי זמן מערבבים נקי 8 מ"מ ל מסננת ולמקם את המנה על צלחת 9-מיקום פגים. להגדיר את מהירות בר מגנטי מערבבים עד 800 סל ד, דגירה את התאים עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר. לבטל את המאגר וחזור בכביסה באמצעות 10 מ"ל של HBSS/CS (את HBSS; מאגר CS 5% שבוצעו בשלב 3.1.1 ומאוחסנים על הקרח). לבטל את המאגר במשרד בסוף לשטוף.</li>
	<li>מביצועם בתאי אפיתל על-ידי הוספת 10 מ"ל של מאגר prewarmed רצועת אפיתל (HBSS את CS 5% 1 מ"מ DTT; 5 מ מ EDTA; 15 מ מ HEPES [pH 7.2-7.5] מאגר שבוצעו בשלב 3.1.2 ומאוחסנים באמבט מים 37 ° C) כדי מסננת התא ומערבבים במהירות של 800 סל ד למשך 30 דקות ב- 3 החממה 7 ° C. בסוף הדגירה, להעביר את המאגר המועשר השבר אפיתל אל צינור נקי 15 מ"ל. הערה: אפיתל ותאים המשויך (תאי אפיתל המעי ו לימפוציטים אפיתל המעי) משתחררים לתוך המאגר, בעוד התאים שלמה פרופריה. מוסקולריס להישאר על מסננת התא במהלך שלב זה11.<ol>
<li>Centrifuge מועשר מעיים אפיתל השבר (IELs)-700 g x עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר. למחוק את תגובת שיקוע, resuspend בגדר תא ב 1 מ"ל של מאגר FACS. לאחסן אותו על הקרח לשימוש בשלב 3.15.</li>
	</ol></li>
	<li>לשטוף את השבר פרופריה. מוסקולריס בתוך מסננת התא 2 x עם HBSS/מדעי המחשב. כדי לעשות זאת, להוסיף 10 מ של פתרון HBSS/מדעי המחשב (HBSS; 5% CS מאגר שבוצע בשלב 3.1.1 שאוחסן בקרח) מסננת תא ומערבבים אותו ב- 800 סל ד במשך 5 דקות בתוך חממה 37 ° C. לבטל את המאגר לשטוף אחרי זה.</li>
	<li>לשטוף את הדגימה 2 x בתקשורת לשטוף. להוסיף 10 מ של שטיפת המדיה (HBSS; 1% CS 1 מ"מ EDTA מאגר שבוצעו בשלב 3.1.3 ומאוחסנים בטמפרטורת החדר) מסננת תא ומערבבים אותו ב- 800 סל ד למשך 15 דקות חממה 37 ° C. לבטל את המאגר לשטוף אחרי זה.<ol>
<li>לאחר השימוש בתקשורת לשטוף, לאחסן אותו על הקרח לשימוש בשלב 3.14.</li>
	</ol></li>
	<li>לשטוף את הדגימה 2 x עם HBSS/מדעי המחשב להוסיף 10 מ ל מאגר HBSS/מדעי המחשב (HBSS; 5% CS מאגר שבוצעו בשלב 3.1.1 שאוחסן בקרח) מסננת תא ולבחוש אותו ב 800 סל"ד למשך 5 דקות בתוך חממה 37 ° C. לבטל את המאגר לשטוף אחרי זה.</li>
	<li>דגירה הרקמה במאגר שטיפה נטולי EDTA. להוסיף 10 מ ל מאגר שטיפה נטולי EDTA (HBSS; 1% CS; 15 מ מ HEPES מאגר שבוצעו בשלב 3.1.4 ומאוחסנים בטמפרטורת החדר) מסננת תא, דגירה את הצלחת. בשביל 10 דקות בטמפרטורת החדר, ללא ערבוב. לבטל את המאגר בסופו של שלב זה.</li>
	<li>לשטוף את הדגימה 2 x עם HBSS/מדעי המחשב ולהכין את הפתרון אנזים. להוסיף 10 מ של HBSS/CS (HBSS; 5% CS מאגר שבוצעו בשלב 3.1.1 שאוחסן בקרח) מאגר כדי מסננת התא ומערבבים אותו ב- 800 סל ד 10 דקות בתוך חממה 37 ° C. לבטל את המאגר לשטוף אחרי זה.<ol>
<li>להכין את הפתרון אנזים (ללא EDTA לשטוף מאגר; 0.1 מ"ג/מ"ל DNase אני; collagenase 167 מ"ג/מ"ל) בתקופת שטיפת שני: להוסיף 9 מ ג של DNase ו- 15 מ ג של collagenase lyophilized עד 90 מ"ל של EDTA ללא לשטוף את מאגר. אחסן את הפתרון בטמפרטורת החדר.</li>
	</ol></li>
	<li>לעכל את השבר פרופריה. מוסקולריס הכלול מסננת התא כדי להשיג פרופריה. מוסקולריס לימפוציטים (LPLs). להוסיף 10 מ של הפתרון אנזים (EDTA ללא שטיפת מאגר; 0.1 מ"ג/מ"ל DNase אני; 167 מ"ג/מ"ל collagenase מאגר שבוצעו בשלב 3.12.1, בטמפרטורת החדר) על מסננת התא ולבחוש אותו ב- 800 סל ד למשך 45 דקות בחממה 37 ° C. הערה: LPLs משתחררים אל הפתרון לאחר עיכול אנזימטי.<ol>
<li>לאסוף את הפתרון אנזים המכילות את התאים ולסנן אותו דרך מסננת תא חדש לתוך צינור חרוטי 50 מ.</li>
	</ol></li>
	<li>הוסף 20 מ של כביסה קרה מדיה (את HBSS; 1% CS 1 מ"מ EDTA מאגר תוצרת בשלב 3.1.3 ומאוחסן על הקרח בשלב 3.9.1) לתאים מסוננים כדי לחסום את פעילות collagenase בפתרון אנזים. Centrifuge את הצינור ב 700 g x עבור 6 דקות בטמפרטורת החדר. למחוק את תגובת שיקוע, resuspend את גלולה המכילה LPLs ב 1 מ"ל של מאגר FACS.</li>
	<li>לשלב את אישור IEL (מתוך שלב 3.7.1) ושברים LPL (מתוך שלב 3.14) ו תכתים אותם עם פלורסנט מצומדת נוגדנים לניתוח cytometric זרימה (ראה שלב 5). הערה: שברים אישור IEL ו- LPL ייתכן מוכתם בנפרד אם מידע תא רצוי.</li>
</ol>4. בידוד של לימפוציטים מן הטחול
<ol><li>הכינו את הצינור איסוף על-ידי הוספת µL 500 FACS מאגר לתוך צינור microcentrifuge. לאחסן אותו על הקרח.</li>
	<li>לאחר הסרת המעי הגס (שלב 3.4), למסוק את הטחול כולו ולמקם אותו בצינור אוסף. אחסן את הרקמה על קרח.</li>
	<li>באמצעות מהמגן של רקמות חשמלי, homogenize הטחול צינור microcentrifuge עבור 1 מינימלית צנטריפוגה המדגם-g x 300 [צנטריפוגה מיקרו] עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר, לשאוב את תגובת שיקוע.</li>
	<li>לבצע את פירוק תאי הדם האדומים על ידי resuspending לדוגמה ב- 500 µL אמוניום כלוריד-אשלגן (ACK) פירוק מאגר ליזום מוות של תאים על-ידי פירוק osmotic. לאפשר את הדגימה דגירה 1-2 דקות בטמפרטורת החדר, ואז resuspend אותו ב- µL 725 FACS המאגר.</li>
	<li>Centrifuge המדגם-g x 300 [צנטריפוגה מיקרו] עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר, לשאוב את תגובת שיקוע. Resuspend בגדר ב 500 µL מאגר FACS ולסנן אותו דרך מסננת תא 40 µm לתוך צינור microcentrifuge. להעביר את הדגימה כל צינור microcentrifuge, את הכתם עם פלורסנט מצומדת נוגדנים לניתוח cytometric זרימה (ראה שלב 5).</li>
</ol>5. זיהוי של Dendra-r+ תאים באמצעות Flow Cytometry
<ol><li>Centrifuge הדגימות LPL/אישור IEL וה טחול ב g 300 x [צנטריפוגה מיקרו] למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, לשאוב את תגובת שיקוע.</li>
	<li>Resuspend כדורי ב- 100 µL של נוגדן מכתים מיקס. להכין נוגדן מכתים לערבב על-ידי הוספת 1 µL של נוגדן anti-CD45 מצומדת fluorescently µL 100 FACS מאגר עבור דגימה. הערה: חשוב titrate נוגדנים המשמש את cytometry זרימה לפני הניסוי כדי לקבוע ריכוז אופטימלי בו מחייב רוויה מתרחשת.</li>
	<li>דגירה בדגימות במשך 35 דקות על קרח (במיקום כהה).</li>
	<li>Resuspend את הדגימות ב- 300 µL מאגר FACS, centrifuge אותם ב g 300 x [צנטריפוגה מיקרו] למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. וארוקן את תגובת שיקוע, resuspend את הדגימות בשנת 325 µL מאגר FACS. לנתח את הדוגמאות על cytometer זרימה.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Maynard, C. L., Elson, C. O., Hatton, R. D., Weaver, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+interactions+of+the+intestinal+microbiota+and+immune+system.">Reciprocal interactions of the intestinal microbiota and immune system.</a> Nature. 489, 231-241 (2012).</li><li>Paun, A., Yau, C., Danska, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Influence+of+the+Microbiome+on+Type+1+Diabetes.">The Influence of the Microbiome on Type 1 Diabetes.</a> Journal of Immunology. 198, 590-595 (2017).</li><li>Mathis, D., Benoist, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbiota+and+autoimmune+disease:+the+hosted+self.">Microbiota and autoimmune disease: the hosted self.</a> Cell Host Microbe. 10, 297-301 (2011).</li><li>Kollmann, T. R., Kampmann, B., Mazmanian, S. K., Marchant, A., Levy, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protecting+the+Newborn+and+Young+Infant+from+Infectious+Diseases:+Lessons+from+Immune+Ontogeny.">Protecting the Newborn and Young Infant from Infectious Diseases: Lessons from Immune Ontogeny.</a> Immunity. 46, 350-363 (2017).</li><li>Jain, N., Walker, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diet+and+host-microbial+crosstalk+in+postnatal+intestinal+immune+homeostasis.">Diet and host-microbial crosstalk in postnatal intestinal immune homeostasis.</a> Nature Reviews in Gastroenterology and Hepatology. 12, 14-25 (2015).</li><li>Mowat, A. M., Agace, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regional+specialization+within+the+intestinal+immune+system.">Regional specialization within the intestinal immune system.</a> Nature Reviews in Immunology. 14, 667-685 (2014).</li><li>Macpherson, A. J., Uhr, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+protective+IgA+by+intestinal+dendritic+cells+carrying+commensal+bacteria.">Induction of protective IgA by intestinal dendritic cells carrying commensal bacteria.</a> Science. 303, 1662-1665 (2004).</li><li>Mowat, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomical+basis+of+tolerance+and+immunity+to+intestinal+antigens.">Anatomical basis of tolerance and immunity to intestinal antigens.</a> Nature Reviews in Immunology. 3, 331-341 (2003).</li><li>Diehl, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbiota+restricts+trafficking+of+bacteria+to+mesenteric+lymph+nodes+by+CX(3)CR1(hi)+cells.">Microbiota restricts trafficking of bacteria to mesenteric lymph nodes by CX(3)CR1(hi) cells.</a> Nature. 494 (3), 116-120 (2013).</li><li>Pham, A. H., McCaffery, J. M., Chan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+lines+with+photo-activatable+mitochondria+to+study+mitochondrial+dynamics.">Mouse lines with photo-activatable mitochondria to study mitochondrial dynamics.</a> Genesis. 50, 833-843 (2012).</li><li>Conway, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATG5+regulates+plasma+cell+differentiation.">ATG5 regulates plasma cell differentiation.</a> Autophagy. 9, 528-537 (2013).</li><li>Buzoni-Gatel, D., Lepage, A. C., Dimier-Poisson, I. H., Bout, D. T., Kasper, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adoptive+transfer+of+gut+intraepithelial+lymphocytes+protects+against+murine+infection+with+Toxoplasma+gondii.">Adoptive transfer of gut intraepithelial lymphocytes protects against murine infection with Toxoplasma gondii.</a> Journal of Immunology. 158, 5883-5889 (1997).</li><li>Guo, X., Muite, K., Wroblewska, J., Fu, Y. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+Adoptive+Transfer+of+Group+3+Gut+Innate+Lymphoid+Cells.">Purification and Adoptive Transfer of Group 3 Gut Innate Lymphoid Cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1422, 189-196 (2016).</li><li>Morton, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoscopic+photoconversion+reveals+unexpectedly+broad+leukocyte+trafficking+to+and+from+the+gut.">Endoscopic photoconversion reveals unexpectedly broad leukocyte trafficking to and from the gut.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 6696-6701 (2014).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

זיהוי ואפיון של תאים אינטראקציה עם והם מושפעים את microbiota במעי הגס הם חשובים, צריך להקל על ההבנה של איך מועבר מידע microenvironment הרירית לשאר חלקי הגוף. שיטה אחת ללמוד נדידת תאים הקשורים הבטן דורש את הבידוד של תאים הקשורים בטן ואחריו העברה המאמצת לתוך עכברים הנמען כדי לקבוע דפוסי רקמה-יונת שלהן לתפקד12,13. גישה זו היא מוגבלת, שכן רק סוגי תאים מסוים הועברו מהמינה. יתר על כן, חפצים הנובע בידודו של תאים מן הרקמות ואת תהליך טיהור שעלולות להפריע ויוו תהליך הנדידה. לאחרונה, פרוטוקול photoconversion אנדוסקופי לסמן תאים מעיים באמצעות עכברים קאךה היה דווח על14. במחקר זה נמצא רחבה בבני אדם וחריגה מן המעי של עכברים בוגרים.
הדו ח שלנו מתאר שיטה תווית תאים במעי הגס של עכברים היילוד ולעקוב להגירתם מעיים במיוחד לאתרים כמו הטחול. העכברטוחנות PhAM מבטא ubiquitously photoconvertible ירוק ניאון Dendra2 חלבון זה בלתי הפיך נכנס למצב פלואורסצנטי אדום על ההפעלה שלה על ידי אור UV. חשיפת נקודתיים של עכברים היילוד 405 ננומטר אור המסומנות בשני CD45+ hematopoietic CD45neg תאים שאינם hematopoietic. CD45+Dendra2-אדום+ תאים אותרו הטחול 3 עד 5 ימים לאחר photoconversion, המציין את ההעברה במיוחד מעיים של תאים hematopoietic.
השלב הגבלת קצב עבור assay הזה הוא השבר של אזור המעי הגס נחשף לאור 405 ננומטר. את השבריריות של המעי הגס היילוד ואת נוכחותם של שרפרף, אמנם מינימלית בגיל הזה, להגביל את משך הצינורית סיב אופטי סיבים שניתן להוסיף. בניסויים הקודמים, בצינורית יותר לא היתה אפשרות בהצלחה להוסיפה יותר מ 5 מ מ.  חומרי סיכה היית נמנע בשל הסכנה של השבירה האור משתנה של קרן הלייזר. תנועת הצינורית החוצה כל 30 s עזר להגדיל את אזור המעי הגס נחשפים אור הלייזר. חשוב, בצינורית עם ערך נה גדול (NA = 0.5) שימש ליצירת קונוס רחב של אור במעי הגס.
פרוטוקול זה יש כבר סטנדרטית עבור היילוד (יום 0 - 2) PhAMטוחנות הגורים. לאור השינויים תוכן ואורך של המעי הגס עם הגיל של העכברים, הטכניקה יצטרך להיות ממוטבים בהתאם בעת שימוש גורים בוגרים. בעיקר, שינויים משך הפעילות הכולל את photoconversion ואת האורך של החדרת הצינורית סיבים אופטיים יהיה צורך.
גישה זו להבנת ההתנהגות הנדידה של תאים במעי הגס בהנחייתם של ניתוח תזרים cytometric. Cytometry זרימה מרובה פרמטר עשוי לשמש עוד יותר כדי לזהות וסוגי פנוטיפ התא מהגרות עבודה המועסקות חיסוניים בתוך CD45+ תא משנה. תאים Dendra2-r+ אולי גם ניתן למיין על ידי FACS ליישומים במורד הזרם כגון ניתוחים פרופיל או פרוטאומיקס של ביטוי גנים. בעוד ביים להבנה של קבוצות משנה תא hematopoietic במעי הגס במחקר זה, השיטה שעשוי להיות מותאם ללמוד ההעברה הסלולר מאתרים נוספים רקמת המוח כולל את העור.

מערכת העיכול יונקים בנמלים מאות מינים של חיידקים הקיימים במערכת יחסים סימביוטיים עם מארח1. תאים חיסוניים נוכח הסביבה המקומית שבה התרחשה לאכוף שוחר שלום עם החיידקים האלה ולהקים מחסום הגנה מפני פלישות הפתוגן. לפיכך, דו-כיוונית אינטראקציות בין תאים חיסוניים את microbiota הם קריטיים להקים קהילה commensal אשר מחנך את מערכת החיסון של הפונדקאי ומגדיר את סף תגובתיות מערכת החיסון פתוגנים. שינויים בשירותים מיקרוביאלי, או dysbiosis, להפריע את המערכת החיסונית הומאוסטזיס ואת perturb מעגלים רגולטוריות לרסן דלקות מעיים המוביל בתיווך החיסון למחלות כמו סוכרת מסוג 1, מחלת המעי הדלקתי2,3 .
תקופת מיד לאחר הלידה הוא חלון התפתחותי ייחודי שבמהלכו הקהילות מיקרוביאלית מעיים להתחיל להקים בו זמנית את מערכת החיסון מבשילה4. Microbiota לאחר הלידה אינה יציבה, עם משמרות הרכב הקהילה המתרחשים באופן טבעי, לעתים קרובות5. תאים חיסוניים המקיימים אינטראקציה עם microbiota שוכנים שני אנטומי מקומות נפרדים במעי - את פרופריה. מוסקולריס ו אפיתל המעי6. סוגים רבים של תאים חיסוניים נמצאים המעי, כולל לימפוציטים (כגון תאי T, תאים B ומולדת בתאי הלימפה) כמו גם התאים מיאלואידית (הכוללות תאים דנדריטים, ומונוציטים ו מקרופאגים). תאים אלה, ידוע גם בתאי hematopoietic, לבצע מספר רב של פונקציות לשמר את מחסום המעי ולשמור הומאוסטזיס.
בנוסף פונקציות התקינה שלהם באתרים מעיים, תאי המערכת החיסונית של רירית עשוי גם להעביר מסרים מיקרוביאלי לאתרים מעיים במיוחד כדי לווסת את החסינות מערכתית-7,-8,-9. זהו אזור גידול מחקר מעניין והוא מדגיש את הצורך שיטות לזהות תאים חיסוניים נודדים מתוך הרקמות מעיים על מנת לחקור את תפקידם. פרוטוקול דיווח כאן מנצל דגם העכבר זמינים מסחרית שבה החלבון הניאון photoconvertible הוא מנוצל לתאים תווית. פאםטוחנות עכברים מביעים ubiquitously של חלבון פלואורסצנטי ירוק Dendra2 זה בלתי הפיך נכנס למצב פלואורסצנטי אדום על הפעלה על ידי אולטרה סגול (UV) אור10. באמצעות הצינורית אופטיים סיבים כדי לספק אור 405 ננומטר לתוך המעי הגס של עכברים היילוד, נדגים כי ניתן למצוא תאים hematopoietic photoconverted, אשר מקורו או transited דרך המעי הגס הטחול.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Laser&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Light Emitting Diode (LED)</td><td>THORLABS</td><td>M405FP1</td><td>CAUTION: this is a Class 3b laser. Safety goggles must be worn when using the laser. It emits a 405 nm wavelength with a current of 1400 mA. It is fiber-coupled. It accepts SMA connector. https://www.thorlabs.com/thorproduct.cfm?partnumber=M405FP1</td></tr><tr><td>LED driver</td><td>THORLABS</td><td>LEDD1B</td><td>Drives a constant current of 1200 mA through the laser. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=2616</td></tr><tr><td>Optogenetics patch cable</td><td>THORLABS</td><td>M87L01</td><td>1 m long cable with an SMA connector. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=11405&amp;amp;pn=M87L01#11454</td></tr><tr><td>Fiber optic cannula</td><td>Doric lenses&amp;nbsp;</td><td>MFC_480/500-0.5_5mm_ZF1.25_C45</td><td>5 mm long cannula with an outer diameter of 500 &amp;micro;m and an inner diameter of 480 &amp;micro;m. The NA value is 0.5. The ferrule is zirconia, 1.25 mm OD. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=6036</td></tr><tr><td>Power supply</td><td>THORLABS</td><td>KPS101</td><td>Supplies 15 V with a current of 2.4 A https://www.thorlabs.com/search/thorsearch.cfm?search=KPS101</td></tr><tr><td>LG3 laser safety goggles&amp;nbsp;</td><td>THORLABS</td><td>LG3</td><td>Orange lenses with 47% visible light transmission https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=762&amp;amp;pn=LG3#2523</td></tr><tr><td>Red light&amp;nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>74327-10</td><td>15 W lamp https://us.vwr.com/store/product/12360027/paterson-safelight-electron-microscopy-sciences</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Intestinal cell isolation&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-893-1389</td><td>CAUTION: inhalation of this anesthetic may cause dizziness, drowsiness, or even unconsciousness. This anesthetic should be used in a Class II hood.&amp;nbsp; https://www.pattersonvet.com/Supplies/ProductFamilyDetails/PIF_762328?carouselPageNumber=3</td></tr><tr><td>1X HBSS</td><td>Gibco</td><td>14025076</td><td>Ca/Mg free https://www.fishersci.com/shop/products/gibco-hbss-calcium-magnesium-no-phenol-red-4/14025076?searchHijack=true&amp;amp;searchTerm=14025076&amp;amp;searchType=RAPID&amp;amp;matchedCatNo=14025076</td></tr><tr><td>Calf Serum</td><td>Hyclone AZM</td><td>197696</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575020</td><td>0.5 M concentration https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15575020?SID=srch-srp-15575020</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>10197777001</td><td>CAUTION: harmful if swallowed and causes skin irritation. 1 M concentration https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/dttro?lang=en&amp;amp;region=US</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td>1 M concentration https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15630080?SID=srch-hj-15630080</td></tr><tr><td>Petri dish</td><td>Corning</td><td>353004</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-easy-grip-tissue-culture-dishes-2/08772f?searchHijack=true&amp;amp;searchTerm=08772F&amp;amp;searchType=RAPID&amp;amp;matchedCatNo=08772F</td></tr><tr><td>70 micron cell strainer</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087712</td></tr><tr><td>Micro magnetic stir bar</td><td>Fisherbrand</td><td>1451364</td><td>Rinse in 70% ethanol after each use. Rinse several times in distilled water prior to each use. The bar is 8 mm long with an octagonal shape. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-octagonal-magnetic-stir-bars-12/1451364#?keyword=1451364</td></tr><tr><td>Magnetic stir plate</td><td>Corning Laboratory Stirrers</td><td>440826</td><td>https://www.coleparmer.com/i/corning-440826-nine-position-stirrer-120-vac-60-hz/8430420?PubID=UX&amp;amp;persist=true&amp;amp;ip=no&amp;amp;gclid=CjwKCAiAqbvTBRAPEiwANEkyCLPLrWABXmOUI0QE53NLV0Owxlcs2V1K6rWbRPOwlcVVDq000FBiQxoCqQAQAvD_BwE</td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>Roche</td><td>5401020001</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/05401020001?lang=en&amp;amp;region=US&amp;amp;gclid=CjwKCAiAjuPRBRBxEiwAeQ2QPhE44qlvxjmo1PYu3zCas3w-_d6P9gKjXW82-c1EOm6NjPHCc5WuixoC_0IQAvD_BwE</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma</td><td>10104159001</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/10104159001?lang=en&amp;amp;region=US</td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Gibco</td><td>20012-027</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/20012027?SID=srch-hj-20012-027</td></tr><tr><td>Pipet aid</td><td>Thermo Scientific</td><td>14387165</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/s1-pipette-fillers/14387165#?keyword=14387165</td></tr><tr><td>10 mL serological pipet</td><td>Falcon</td><td>357530</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659</td></tr><tr><td>25 mL serological pipet</td><td>Falcon</td><td>357515</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659</td></tr><tr><td>15 mL conical centrifuge tube</td><td>Thermo Scientific</td><td>339651</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650</td></tr><tr><td>50 mL conical centrifuge tube</td><td>Thermo Scientific</td><td>339653</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Single cell suspension&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf tubes</td><td>Seal-Rite</td><td>1615-5500</td><td>Holds 1.5 mL. https://www.usascientific.com/Seal-Rite-1.5-ml-tube.aspx</td></tr><tr><td>Tissue homogenizer&amp;nbsp;</td><td>Kimble</td><td>K7495400000</td><td>Requires 2 AA batteries. https://www.fishersci.com/shop/products/kontes-pellet-pestle-cordless-motor-cordless-motor/k7495400000</td></tr><tr><td>Homogenizer tips&amp;nbsp;</td><td>Kimble</td><td>7495210590</td><td>Plastic, 0.5 mL tips https://www.fishersci.com/shop/products/kimble-chase-kontes-pellet-pestle-14/k7495210590#?keyword=7495210590</td></tr><tr><td>ACK lysing buffer</td><td>Gibco</td><td>A10492-01</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1049201?SID=srch-hj-A10492-01</td></tr><tr><td>40 micron cell strainer</td><td>Falcon</td><td>08-771-1</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087711</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Antibodies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BV786 anti-mouse CD45&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>564225</td><td>Clone 3O-F11 https://www.bdbiosciences.com/us/reagents/research/antibodies-buffers/immunology-reagents/anti-mouse-antibodies/cell-surface-antigens/bv786-rat-anti-mouse-cd45-30-f11/p/564225</td></tr><tr><td>Live/Dead</td><td>Invitrogen</td><td>L34962</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/L34962</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Other&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Razor blades</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td>Use for decapitation. https://us.vwr.com/store/product/4548306/vwr-razor-blades</td></tr></tbody></table>

in vivo photolabeling of cells in the colon to assess migratory potential of hematopoietic cells in neonatal mice

קהילות חיידקי המעית נקבעו בשלב מוקדם בחיים ולהשפיע על התפתחות תאי המערכת החיסונית ותפקוד. Microbiota neonatal חשופה להשפעות חיצוניות רבות, כולל שימוש אנטיביוטיקה, דיאטה, אשר משפיעה על הרגישות אוטואימוניות ומחלות דלקתיות. הפרעות כגון דלקת המעי המחלה (מחלת המעי הדלקתי) מאופיינים על ידי המאסיבית של תאים חיסוניים למעיים. עם זאת, תאים חיסוניים מותנה microbiota אולי בנוסף להגר מחוץ למעיים. להשפיע על תגובות חיסוניות באתרי אקסטרה מעיים. לפיכך, יש צורך לזהות ולאפיין תאים עשויים להעביר מסרים חיידקים מהמעיים לאתרים דיסטלי. כאן, אנו מתארים שיטה תווית תאים במעי הגס של עכברים היילוד ויוו המאפשרת את הזיהוי שלהם באתרי אקסטרה מעיים לאחר ההעברה.

כבל סיבים אופטיים שימש כדי לספק אור 405 ננומטר לתוך נקודתיים של עכבריםטוחנות PhAM 2 - בן יום. בניסויים הקודמים, חשיפה של 30 נקבע לתת photoconversion מקסימלי של המעי הגס תאים עם cytotoxicity מינימלי (איור 1א'). לכן, רציפים-30 s חשיפות של חלקים שונים של המעי הגס בוצעו כמפורט בפרוטוקול. בעקבות החשיפה לייזר, העכברים היו מורדמים מיד, photoconversion של התאים נקבע. תא בודד ההכנות של רקמת מעי סה כ היו מוכתמים נוגדן anti-CD45 מצומדת פלורסנט ובוצע ניתוח cytometric זרימה לאתר photoconversion. חלבון ירוק-Dendra2 (Dendra-g) אשר יש עירור, פליטה maxima ב nm 490 ו 553 בהתאמה, ניתן להבחין בערוץ FITC, ואילו photoconverted Dendra2-אדום (Dendra-r) חלבון יש עירור, פליטה maxima nm 507, 573 בהתאמה, עשוי להתגלות בערוץ PE של cytometer זרימה. ברגע בלתי הפיך החליף לצורתו אדום, Dendra2 הוא מאוד photostable שימושי עבור יישומי מעקב לטווח ארוך.
תאים Dendra-r+ לא אותרו בעכברים unlasered (איור 1B שמאלה). עם זאת, 405 ננומטר לאור החשיפה הביא ברורים אוכלוסיות תא Dendra-r+ CD45neg והן CD45+ תא תאים (איור 1B נכון). כדי לקבוע אם פרוטוקול photoconversion שטיפת המעי הגס גרמו תיוג הרקע של תאים באתרי אקסטרה מעיים, קצרנו טחולים מ לאחרונה photoconverted עכברים (T = 0), לבדיקה עבור Dendra-r+ תאים על-ידי cytometry זרימה. אף תא Dendra-r+ התגלו CD45שלילי או CD45+ תא תאים (איור 1C), רומז כי קרן הלייזר אינטרה-חוקן שלא חדרו מספיק כדי photolabel תאי הטחול. לפיכך, תאים Dendra-r+ זוהה הטחול לאחר המאפשר זמן ההעברה (T = 3d, 5d) צריך להיות שמקורם מן המעי הגס.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57929/57929fig1.jpg"> איור 1 : אין ויוו photoconversion של רקמת מעי. תאים של המעי הגס של הגוריםטוחנות PhAM 2 - בן יום נחשפו לאור אינטרה-חוקן 405 ננומטר ל 30 s כמתואר. את photoconversion ואת תיוג של התאים היו נחושים מיד לאחר הניתוח (T = 0) על ידי ניתוח cytometric זרימה של תא בודד ההכנות של רקמת מעי, הטחול. (א) מגרש נקודה זו הזרימה נציג cytometric מציגה את הביטוי של CD45 (x-ציר), צביעה של לצבוע חי-מת (y-ציר) בתוך תא בודד גלמי נקודתיים של שליטה ועכברים lasered. פאנלים B ו- C הם זרימת נציג cytometric נקודה מגרש שכבות המציגות את הביטוי של החלבון Dendra2-ירוק (Dendra2-g, ציר אופקי), חלבון Dendra2-אדום (Dendra2-r, אנכי ציר) בשליטה-סמויה, חשופים CD45+ (hematopoietic) CD45מינוס (שאינם hematopoietic) תאי (B) המעי הגס ופי (C) הטחול. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57929/57929fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
נתונים ניסוי טיפוסי photoconversion לזהות תאים נודדים הטחול מוצגים באיור2. Photoconversion של התאים נקודתיים של עכבריםטוחנות PhAM 2 - בן יום בוצעה כמו באיור 1. עכברים היו מורדמים 3 ו- 5 ימים לאחר החשיפה, הנוכחות של תאים Dendra-r+ הטחול נקבע על ידי cytometry זרימה. היו שם אין תאים Dendra-r+ CD45neg תא המשנה, עקבי עם הנוף כי התאיםneg CD45 הם בעיקר אפיתל והתאים מבנית של המעי. כמה CD45+ hematopoietic תאי ביטא Dendra-r, רומז כי הם היו כבר photoconverted במעי הגס, הועברו הטחול.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57929/57929fig2.jpg"> איור 2 : CD45+ תאים hematopoietic להגר מן המעי הגס הטחול. היילוד (יום 0 - 2) PhAMטוחנות עכברים נחשפו לאור 405 ננומטר לחלבון photoconvert Dendra2 על ידי חשיפה אינטרה-חוקן. Cytometry זרימה נציג מראים את הביטוי של החלבון Dendra2-ירוק (Dendra2-g, הציר האופקי) וחלבון Dendra2-אדום (Dendra2-r, אנכי ציר) CD45שלילי , CD45+ תאי הטחול של עכברים בת 5 ימים שלא נחשפו ו חשוף עכברים נותחו 3 ו- 5 ימים (T = 3d, 5d) לאחר photoconversion. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57929/57929fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Photolabeling of Cells in the Colon to Assess Migratory Potential of Hematopoietic Cells in Neonatal Mice at JoVE.com

In Vivo Photolabeling of Cells in the Colon to Assess Migratory Potential of Hematopoietic Cells in Neonatal Mice

הפרוטוקול המתואר כאן משתמשת בגישה photolabeling בעכברים היילוד במיוחד לזהות תאים חיסוניים להגר מן המעי הגס לאתרים במיוחד מעיים. אסטרטגיה זו יהיה מועיל ללמוד אינטראקציות מארח-microbiome בחיים מוקדם.

אין ויוו Photolabeling של תאים במעי הגס כדי להעריך את פוטנציאל הנדידה של תאים Hematopoietic בעכברים Neonatal

Enteric bacterial communities are established early in life and influence immune cell development and function. The neonatal microbiota is susceptible to ...

in-vivo-photolabeling-cells-colon-to-assess-migratory-potential

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Medicine

In Vivo Photolabeling of Cells in the Colon to Assess Migratory Potential of Hematopoietic Cells in Neonatal Mice

5.7K Views.  Massachusetts General Hospital. הפרוטוקול המתואר כאן משתמשת בגישה photolabeling בעכברים היילוד במיוחד לזהות תאים חיסוניים להגר מן המעי הגס לאתרים במיוחד מעיים. אסטרטגיה זו יהיה מועיל ללמוד אינטראקציות מארח-microbiome בחיים מוקדם.

Video: In Vivo Photolabeling of Cells in the Colon to Assess Migratory Potential of Hematopoietic Cells in Neonatal Mice

A Method for Lineage Tracing of Corneal Cells Using Multi-color Fluorescent Reporter Mice

Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied for many decades, revealing seminal findings in developmental biology. More recently, it was adopted by stem cell biologists to identify and track different stem cell populations with minimal experimental intervention. The recent developments in mouse genetics, the availability of a large number of mouse strains, and the advancements in fluorescent microscopy allow the straightforward design of powerful lineage tracing systems for various tissues with basic expertise, using commercially available tools. We have recently taken advantage of this powerful methodology to explore the origin and fate of stem cells at the ocular surface using R26R-Confetti mouse. This model offers a multi-color genetic system, for the expression of 4 fluorescent genes in a random manner. Here we describe the principles of this methodology and provide an adaptable protocol for designing lineage tracing experiments; specifically for the corneal epithelium as well as for other tissues.

In this article we describe the principles for designing and performing a multi-color lineage tracing experiment using R26R-Confetti mice. We provide a specific protocol for tracking corneal epithelial cells which can be modified for other tissues of interest.

שיטה לאיתור שושלת של תאי קרנית באמצעות עכברים כתב ניאון רב-צבע

Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied ...

Developmental Biology

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.

ניתוח<em&gt; In vivo</em&gt; נדידת תאים באמצעות השתלות תא והדמיה זמן לשגות עוברי דג הזברה

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo labeling of stem cells with a fluorescent dye, subsequent intravenous injection of the labeled cells and visualization of their accumulation in specific target organs or pathologies. The presented technique demonstrates how we label human mesenchymal stem cells (hMSC) by simple incubation with the lipophilic fluorescent dye DiD (C67H103CIN2O3S) and how we label human embryonic stem cells (hESC) with the FDA approved fluorescent dye Indocyanine Green (ICG). The uptake mechanism is via adherence and diffusion of the lypophilic dye across the phospholipid cell membrane bilayer. The labeling efficiency is usually improved if the cells are incubated with the dye in serum-free media as opposed to incubation in serum-containing media. Furthermore, the addition of the transfection agent Protamine Sulfate significantly improves contrast agent uptake.

This video shows techniques for labeling of human embryonic stem cells and mesenchymal stem cells with fluorescent dyes. This technique can be used for an in vivo tracking of transplanted stem cells with optical imaging and for histopathological correlations with fluorescence microscopy.

תיוג בתאי גזע עם צבעי ניאון על איתור פולשני עם דימות אופטי

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Biology

Use of In vivo Imaging to Monitor the Progression of Experimental Mouse Cytomegalovirus Infection in Neonates

Human Cytomegalovirus (HCMV or HHV-5) is a life-threatening pathogen in immune-compromised individuals. Upon congenital or neonatal infection, the virus can infect and replicate in the developing brain, which may induce severe neurological damage, including deafness and mental retardation. Despite the potential severity of the symptoms, the therapeutic options are limited by the unavailability of a vaccine and the absence of a specific antiviral therapy. Furthermore, a precise description of the molecular events occurring during infection of the central nervous system (CNS) is still lacking since observations mostly derive from the autopsy of infected children. Several animal models, such as rhesus macaque CMV, have been developed and provided important insights into CMV pathogenesis in the CNS. However, despite its evolutionary proximity with humans, this model was limited by the intracranial inoculation procedure used to infect the animals and consistently induce CNS infection. Furthermore, ethical considerations have promoted the development of alternative models, among which neonatal infection of newborn mice with mouse cytomegalovirus (MCMV) has recently led to significant advances. For instance, it was reported that intraperitoneal injection of MCMV to Balb/c neonates leads to infection of neurons and glial cells in specific areas of the brain. These findings suggested that experimental inoculation of mice might recapitulate the deficits induced by HCMV infection in children. Nevertheless, a dynamic analysis of MCMV infection of neonates is difficult to perform because classical methodology requires the sacrifice of a significant number of animals at different time points to analyze the viral burden and/or immune-related parameters. To circumvent this bottleneck and to enable future investigations of rare mutant animals, we applied in vivo imaging technology to perform a time-course analysis of the viral dissemination in the brain upon peripheral injection of a recombinant MCMV expressing luciferase to C57Bl/6 neonates.

Use of In vivo Imaging to Monitor the Progression of Experimental Mouse Cytomegalovirus Infection in Neonates

Human Cytomegalovirus (HCMV) infection of neonates represents an important cause of mental retardation, yet the molecular events leading to virus-induced pathogenesis are still poorly understood. To investigate the dynamics of brain infection, we adapted whole-animal in vivo imaging to perform time-course analysis of neonates infected with a luciferase-recombinant virus.

שימוש<em&gt; בvivo</em&gt; הדמיה למעקב אחר ההתקדמות של זיהום ציטומגלווירוס עכבר ניסיוני בילודים

Human Cytomegalovirus (HCMV or HHV-5) is a life-threatening  pathogen in immune-compromised individuals. Upon congenital or neonatal  infection, the virus ...

Immunology and Infection

Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or pathogenic effects depending on the inflammatory milieu. Nonetheless, despite the indispensable role of neutrophils in immunity, detailed understanding of the molecular factors that mediate neutrophils' effector and immunopathogenic effects in different infectious diseases and inflammatory conditions is still lacking, partly because of their short half life, the difficulties with handling of these cells and the lack of reliable experimental protocols for obtaining sufficient numbers of neutrophils for downstream functional studies and adoptive transfer experiments. Therefore, simple, fast, economical and reliable methods are highly desirable for harvesting sufficient numbers of mouse neutrophils for assessing functions such as phagocytosis, killing, cytokine production, degranulation and trafficking. To that end, we present a reproducible density gradient centrifugation-based protocol, which can be adapted in any laboratory to isolate large numbers of neutrophils from the bone marrow of mice with high purity and viability. Moreover, we present a simple protocol that uses CellTracker dyes to label the isolated neutrophils, which can then be adoptively transferred into recipient mice and tracked in several tissues for at least 4 hr post-transfer using flow cytometry. Using this approach, differential labeling of neutrophils from wild-type and gene-deficient mice with different CellTracker dyes can be successfully employed to perform competitive repopulation studies for evaluating the direct role of specific genes in trafficking of neutrophils from the blood into target tissues in vivo.

We describe a protocol for isolation and purification of neutrophils from mouse bone marrow by density gradient centrifugation and for neutrophil labeling using CellTracker dyes. This represents a simple, fast, reproducible and economical method for obtaining large numbers of neutrophils for downstream functional studies or adoptive transfer and tracking experiments.

בידוד, טיהור וסימון של נויטרופילים מח עצם עכבר ללימודים פונקציונליים וניסויי העברת מאמצת

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or ...

A Label-Free Segmentation Approach for Intravital Imaging of Mammary Tumor Microenvironment

The ability to visualize complex and dynamic physiological interactions between numerous cell types and the extracellular matrix (ECM) within a live tumor microenvironment is an important step toward understanding mechanisms that regulate tumor progression. While this can be accomplished through current intravital imaging techniques, it remains challenging due to the heterogeneous nature of tissues and the need for spatial context within the experimental observation. To this end, we have developed an intravital imaging workflow that pairs collagen second harmonic generation imaging, endogenous fluorescence from the metabolic co-factor NAD(P)H, and fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) as a means to non-invasively compartmentalize the tumor microenvironment into basic domains of the tumor nest, the surrounding stroma or ECM, and the vasculature. This non-invasive protocol details the step-by-step process ranging from the acquisition of time-lapse images of mammary tumor models to post-processing analysis and image segmentation. The primary advantage of this workflow is that it exploits metabolic signatures to contextualize the dynamically changing live tumor microenvironment without the use of exogenous fluorescent labels, making it advantageous for human patient-derived xenograft (PDX) models and future clinical use where extrinsic fluorophores are not readily applicable.

The intravital imaging method described here utilizes collagen second harmonic generation and endogenous fluorescence from the metabolic co-factor NAD(P)H to non-invasively segment an unlabeled tumor microenvironment into tumor, stromal, and vascular compartments for in-depth analysis of 4D intravital images.

גישת סגמנטציה ללא תווית להדמיה תוך-ורידית של מיקרו-סביבה של גידולי יונקים

The ability to visualize complex and dynamic physiological interactions between numerous cell types and the extracellular matrix (ECM) within a live tumor ...

Cancer Research

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal environment. Biological activities of immune cells mainly rely on their motility capacities. Blood monocytes have short half-life in the bloodstream; they originate in the bone marrow and are constitutively released from it. In inflammatory condition, this process is enhanced, leading to blood monocytosis and subsequent infiltration of the peripheral inflammatory tissues. Identifying the biomechanical events controlling monocyte trafficking from the bone marrow towards the vascular network is an important step to understand monocyte physiopathological relevance. We performed in vivo time-lapse imaging by two-photon microscopy of the skull bone marrow of the Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP (MacBlue) mouse. The MacBlue mouse expresses the fluorescent reporters enhanced cyan fluorescent protein (ECFP) under the control of a myeloid specific promoter 1, in combination with vascular network labelling. We describe how this approach enables the tracking of individual medullar monocytes in real time to further quantify the migratory behaviour within the bone marrow parenchyma and the vasculature, as well as cell-to-cell interactions. This approach provides novel insights into the biology of the bone marrow monocyte subsets and allows to further address how these cells can be influenced in specific pathological conditions.

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Monocytes are key regulators of innate immunity and play a critical role in the renewal of the peripheral mononuclear phagocytic system and in case of inflammation. This manuscript describes the procedure of real time imaging of the mouse calvaria bone marrow to study the monocyte mobilisation mechanism.

מעקב עכבר מח עצם המונוציטים<em&gt; In vivo</em

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal ...

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and temporal specificity2. Chemotaxis is a critical function of lymphocytes and other immune cells that can be quantitatively assessed in vitro. This manuscript describes methods that permit the evaluation of chemotaxis, both in vitro and in vivo, for diverse cell types including cell lines and native cells. The in vitro, plate-based format permits the comparison of several conditions simultaneously in real-time, and can be completed within 1-4 h. In vitro assay conditions can be manipulated to introduce agonists and antagonists, as well as differentiate chemotaxis from chemokinesis, which is random movement. For in vivo trafficking assessments, immune cells can be labeled with multiple fluorescent dyes and used for adoptive transfer. The differential labeling of cells allows for mixed cell populations to be introduced into the same animal, thereby decreasing variance and reducing the number of animals required for an adequately powered experiment. Migration into lymphoid tissue occurs in as little as 1 h, and multiple tissue compartments can be sampled. Flow cytometry following tissue harvest allows for a rapid and quantitative analysis of the migratory patterns of multiple cell types.

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Protocols for quantitative assessment of lymphocyte chemotaxis and migration are important tools for immunology research. Here, an in vitro protocol is described that permits real-time, multiplexed evaluation of cell migration, as well as a complementary in vivo technique enabling tracking of native cells to spleen.

לכימות מונוציט האנושי כימוטקסיס במבחנה , לימפוציט מאתר סחר In Vivo

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and ...

Fluorescent Dye Labeling of Erythrocytes and Leukocytes for Studying the Flow Dynamics in Mouse Retinal Circulation

The retinal and choroidal blood flow dynamics may provide insight into the pathophysiology and sequelae of various ocular diseases, such as glaucoma, diabetic retinopathy, age-related macular degeneration (AMD) and other ocular inflammatory conditions. It may also help to monitor the therapeutic responses in the eye. The proper labeling of the blood cells, coupled with live-cell imaging of the labeled cells, allows for the investigation of the flow dynamics in the retinal and choroidal circulation. Here, we describe the standardized protocols of 1.5% indocyanine green (ICG) and 1% sodium fluorescein labeling of mice erythrocytes and leukocytes, respectively. Scanning laser ophthalmoscopy (SLO) was applied to visualize the labeled cells in the retinal circulation of C57BL/6J mice (wild type). Both methods demonstrated distinct fluorescently labeled cells in the mouse retinal circulation. These labeling methods can have wider applications in various ocular disease models.

Live-cell imaging of the labeled blood cells in ocular circulation can provide information about inflammation and ischemia in diabetic retinopathy and age-related macular degeneration. A protocol to label blood cells and image the labeled cells in the retinal circulation is described.

פלואורסצנטי Dye תיוג של Erythrocytes ו leukocytes ללימוד דינמיקה זרימה של זרימת עכבר הרשתית

The retinal and choroidal blood flow dynamics may provide insight into the pathophysiology and sequelae of various ocular diseases, such as glaucoma, ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and temporal resolution to study in vivo hematopoiesis using the murine bone marrow transplant experimental model. Genetic combinatorial marking using lentiviral vectors encoding fluorescent proteins (FPs) enabled cell fate mapping through advanced microscopy imaging. Vectors encoding five different FPs: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato, and mCherry were used to concurrently transduce HSPCs, creating a diverse palette of color marked cells. Imaging using confocal/two-photon hybrid microscopy enables simultaneous high resolution assessment of uniquely marked cells and their progeny in conjunction with structural components of the tissues. Volumetric analyses over large areas reveal that spectrally coded HSPC-derived cells can be detected non-invasively in various intact tissues, including the bone marrow (BM), for extensive periods of time following transplantation. Live studies combining video-rate multiphoton and confocal time-lapse imaging in 4D demonstrate the possibility of dynamic cellular and clonal tracking in a quantitative manner.

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Combinatorial 5 fluorescent proteins marking of hematopoietic stem and progenitor cells allows in vivo clonal tracking via confocal and two-photon microscopy, providing insights into bone marrow hematopoietic architecture during regeneration. This method allows non-invasive fate mapping of spectrally-coded HSPCs-derived cells in intact tissues for extensive periods of time following transplantation.

במשובט מעקב vivo של גזע hematopoietic ובתאים המסומנים על ידי חמישה חלבונים ניאון באמצעות Confocal וmultiphoton מיקרוסקופית

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

אין ויוו Photolabeling של תאים במעי הגס כדי להעריך את פוטנציאל הנדידה של תאים Hematopoietic בעכברים Neonatal

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video