Name: in vivo photolabeling of cells in the colon to assess migratory potential of hematopoietic cells in neonatal mice
Uploaded: 2018-08-10T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
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ニーチャ ジャイナ教は、NIH/NIAID キャリア遷移賞 1K22AI116661-01 によって支えられました。

動物のすべてのプロシージャの承認機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) マサチューセッツ総合病院に準拠して行った。
注意: このプロトコルは、クラス 3 b レーザー (LG3) の使用を含みます。このレーザーを動作しているとき、LG3 レーザー安全ゴーグルを使用常にする必要があります。怪我のリスクを避けるために適切な訓練と安全のガイドラインに従わなければなりません。
1. デザインとレーザーのアセンブリ
<ol><li>光発光ダイオード (LED) を接続 (405 nm、19.3 mW、ファイバー結合型 1400 mA)、LED ドライバー経由で来る 4 ピン M8 コネクタ ケーブルに接続されている LED。慎重に接続を固定するネジを締めます。</li>
	<li>オプトジェネティクス パッチ ケーブルを LED に接続する前に、コネクタを保持に LED の開放ができるように光目に見える障害物がないです。必要に応じて任意の障害物を排除し、オプトジェネティクス パッチ ケーブルを開口部に挿入する穴に吹く。</li>
	<li>オプトジェネティクス パッチ ケーブル コネクタ スリーブの両端にカニューレを挿入することによってファイバー光カニューレに接続します。パッチ ケーブルにコネクタ スリーブの他の端を接続します。 接続をセキュリティ保護がない曲げたりカニューレで光ファイバーを破るように注意する十分な圧力を適用します。 注: 壊れやすい繊維ファイバー カニューレは、レーザーが使用されていないときに保護キャップで覆われて。</li>
	<li>LED ドライバーを 0 と電流 1.2 a. に設定で連続調整ノブと連続波 (CW) モードに設定します。</li>
</ol>2. 大腸内のセルの光電
注: 雌雄マウスは出生後 1-2 日 intracolonic 405 nm の光にさらされたが 1 週齢の前に犠牲になった。
<ol><li>コンセントへのアクセスと暗い場所を確保します。LED ドライバーをコンセントに差し込みます。 注: この手順を実行最小の白色光で周囲の光にマウスの長時間露出がセルの不要な光変換を引き起こす可能性があります。赤い光は、代替として使用されます。 注意: 次の手順は、麻酔動物の使用を含みます。麻酔薬の管理では、クラス II フードまたは別の適切な清掃システムを使用して行われます。麻酔薬の吸入は、めまい、眠気、またはも無意識のうちにあります。</li>
	<li>100 %o2 [誘導] ボックスで 4-5% イソフルラン暴露によるマウスを麻酔します。(応答なし) 後肢をしっかりとつまんで適切な麻酔深度を確認します。約 2% イソフルランに鼻の円錐形によって麻酔を維持します。適切なフードや麻酔の清掃装置の使用によってハンドラー イソフルラン暴露を防ぐ。</li>
	<li>首筋に 1 を使用して intracolonic 露出のため麻酔下マウスの位置手の人差し指と親指で軽くマウスの背面。マウスを裏返し、腹部を公開します。マウスは、そのピンクの色を失うことを開始した場合またはその呼吸速度が遅いを開始した場合は、グリップを緩めます。マウスの尾をリングと小さな指の間を固定します。</li>
	<li>もう片方の手には、カニューレから保護キャップを取り外します。維持しながらマウスの正中線に平行のカニューレの長軸そっと挿入肛門からファイバー光カニューレ コロン、光ファイバーのすべて 5 mm が、マウスの内部。 注: この手順を実行ゆっくりと大腸の壁に穴を開けるように注意。分揺らすとカニューレのねじれは、コロン進出を支援します。</li>
	<li>安全ゴーグルをドンし、最大値 (すべての方法時計回り) に現在のレーザーを増やします。マウスの半透明の腹部を見ることによって紫外線の存在を確認します。 注: LG3 レーザー安全メガネは、視認性を大幅に減少します。ゴーグルを着用し、レーザーをオンに同僚 (身に着けている保護具) の支援を持っています。</li>
	<li>公開 2 分約 1 mm のカニューレの撤回の合計のためのレーザ光にコロンすべての 30 s、光にさらされる内腔領域を最大化します。2 分の最後に、レーザーをオフにします。</li>
	<li>ゆっくりとマウスからカニューレを削除します。空暖かいケージ内麻酔から回復した後、マウスを家のケージに戻ります。</li>
</ol>3. 腸管リンパ球の分離
<ol><li>ハンクの平衡塩類ソリューション/子牛血清 (HBSS/CS) バッファーの 1 L、上皮ストリップ バッファーの 200 mL、500 mL 洗浄メディアのエチレンジアミン四酢酸 (EDTA) の 200 mL を準備-無料洗浄メディア。 注: 試薬ボリュームの 9 のサンプル サイズが計算されます。<ol>
<li>CS の 50 mL を HBSS の 950 mL に追加して HBSS/CS のバッファー (HBSS; 5 %cs) をします。氷の上保管してください。</li>
		<li>185 mL に CS、1 M DTT、0.5 M の EDTA の 2 mL、3 mL の 1 M HEPES バッファーの 200 μ L の 10 mL を追加して [HBSS; 5 %cs; 1 mM ジチオトレイトール (DTT); 5 mM EDTA; 15 mM 4-(2-Hydroxyethyl) ピペラジン-1-ethanesulfonic 酸 (HEPES) (pH 7.2 7.5)] 上皮ストリップ バッファーを準備します。HBSS。37 ° C の水浴中上皮ストリップ バッファーを配置します。</li>
		<li>HBSS 494 mL に CS の 5 mL と 0.5 M の EDTA の 1 mL を追加することによって洗浄メディア (HBSS; 1% CS 1 mM EDTA) を作る。室温で保管してください。</li>
		<li>HBSS 195 mL に 2 mL CS と 1 M HEPES 3 mL を追加して EDTA 無料洗浄メディア (HBSS; 1 %cs; 15 mM HEPES) を準備します。室温で保管してください。</li>
		<li>FACS バッファーを作る [リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) x 1 (pH = 7.2); 2 %cs] 490 mL の PBS に CS の 10 mL を追加しています。氷の上保管してください。</li>
	</ol></li>
	<li>70 μ m セル ストレーナー 60 × 10 mm 培養皿の中に配置することによって組織のコレクション料理を準備します。皿に HBSS/CS バッファー (HBSS; 5 %cs バッファー 3.1.1 の手順で作った、氷に格納) の 10 mL を追加し、氷の上に置きます。</li>
	<li>安楽死、マウスを介して吸入イソフルラン麻酔薬の適切な清掃を使用しての過剰摂取 (約 3 分の露出に > 4% イソフルラン部屋の空気または 100% O2)。呼吸の明白な停止後および動きを反射、後肢の足をしっかりとつまんで深い痛みの有無を確認します (推奨鉗子を使用して)。外科はさみのペアまたは新しいストレートかみそりを使用して斬首による安楽死を確認します。 注: 頚部転位はこのステップ サイズと動物の年齢のための推奨されません。これらのメソッドは、安楽死の 2013 AVMA のガイドラインと一致しているし、MGH IACUC によって承認されました。</li>
	<li>きれいな鉗子、はさみを使用して、腹部を開くコロンを収穫します。コロンを公開するマウスの腹部の 1 側に腸を反映してください。最初 transecting (肛門) に向けてのすぐ遠位のそれによって全体のコロンを削除盲腸に到達します。その後、しっかりと把握しながら鉗子、大腸は直腸に尿道を通って削減するはさみを使用します。できるだけ肛門に近くとしてコロンをカットします。コロンを削除した後、脾臓を収穫 (4.1 4.2 下記手順を参照)。 注: 光電プロトコルのみ新生児のコロン (繊維ファイバー カニューレの 5 mm) の ~ 25% をターゲットに中、全体のコロンは細胞単独で支援するために収穫されます。</li>
	<li>大腸のうち、乾燥したペーパー タオルの上に内容をプッシュする鉗子を使用して、コロンをきれい。培養皿のカバーの貼り付けにみじん切りにコロン、ペトリ皿にセル ストレーナーにこのペーストを転送するかみそりの刃を使用して組織をホモジナイズしてください。</li>
	<li>こし器にきれいな 8 mm 長い電磁攪拌棒を追加し、9 位置磁気スターラー プレートに皿を置きます。電磁攪拌バー速度を 800 rpm にセット、室温で 5 分間細胞を孵化させなさい。バッファーを破棄し、HBSS/CS (、HBSS; 5 %cs バッファー 3.1.1 の手順で作った、氷に格納) の 10 mL を使用して洗浄を繰り返します。洗浄の最後にバッファーを破棄します。</li>
	<li>セル ストレーナーを 10 mL の prewarmed 上皮ストリップ バッファー (、HBSS; 5 %cs; 1 mM DTT; 5 mM EDTA; 3.1.2 のステップで行われた、37 ° C の水浴中に格納された 15 mM HEPES [pH 7.2 7.5] バッファー) を追加することによって上皮細胞を解離して、3 で 30 分間 800 rpm で攪拌7 ° C の定温器。孵化の最後に、きれいな 15 mL チューブにある上皮部分で濃縮バッファーを転送します。 注: 上皮と関連付けられている細胞 (小腸上皮細胞や腸管上皮リンパ球) に放出されるバッファー、そのまま粘膜の細胞がこのステップ11セル ストレーナーのまま。<ol>
<li>遠心分離機の部屋の温度で 5 分間 700 x g で豊かな腸上皮分数 (Iel)。上澄みを廃棄し、1 mL の FACS バッファーで細胞ペレットを再懸濁します。3.15 の手順で使用するため氷の上保管してください。</li>
	</ol></li>
	<li>セル ストレーナー 2 内粘膜の一部を洗って HBSS/CS と x。セル ストレーナーに HBSS/CS ソリューション (HBSS; 氷の上に格納されているステップ 3.1.1 で作られた 5 %cs バッファー) の 10 mL を追加し、37 ° C の定温器で 5 分間 800 rpm で攪拌します。各洗浄した後、バッファーを破棄します。</li>
	<li>サンプル 2 を洗う洗浄メディアで x。セル ストレーナーを洗浄メディア (HBSS; 1% CS 3.1.3 の手順で、室温で格納された 1 mM EDTA バッファー) の 10 mL を追加し、37 ° C の定温器で 15 分間 800 rpm で攪拌します。各洗浄した後、バッファーを破棄します。<ol>
<li>洗浄メディアを使用した後 3.14 の手順で使用するため氷の上保管してください。</li>
	</ol></li>
	<li>サンプル 2 を洗う HBSS x/CS. セル ストレーナーに HBSS/CS バッファー (HBSS; 氷の上に格納されている、手順 3.1.1 5% の CS のバッファー) の 10 mL を追加し、37 ° C の定温器で 5 分間 800 rpm で攪拌します。各洗浄した後、バッファーを破棄します。</li>
	<li>洗浄バッファーの EDTA 無料のティッシュを孵化させなさい。セル ストレーナーに 10 mL の洗浄バッファーの EDTA 無料 (HBSS; 1% CS 3.1.4 の手順で、室温で格納された 15 mM HEPES バッファー) を追加し、プレート攪拌しなくても室温で 10 分間インキュベートします。このステップの終わりにバッファーを破棄します。</li>
	<li>サンプル 2 を洗う HBSS/CS と x と酵素液を準備します。HBSS/CS (HBSS; 5 %cs バッファー、氷の上に格納されている手順 3.1.1) 10 mL を追加セル ストレーナーをバッファーに格納し、37 ° C の定温器で 10 分間 800 rpm で攪拌します。各洗浄した後、バッファーを破棄します。<ol>
<li>酵素液を準備 (EDTA 無料洗浄バッファー; 0.1 mg/mL DNase I; 167 mg/mL コラゲナーゼ) 2 番目の洗浄期間中: 9 mg を追加 DNase の私と 15 mg EDTA 無料 90 mL に凍結乾燥のコラゲナーゼの洗浄バッファー。室温でソリューションを保存します。</li>
	</ol></li>
	<li>粘膜固有層リンパ球 (Lpl) を取得するセル ストレーナー内粘膜画分を消化します。酵素溶液 10 mL を追加 (EDTA 無料洗浄バッファー; 0.1 mg/mL DNase I; 167 mg/mL コラゲナーゼ バッファー 3.12.1 の手順で行い、常温保存) セル ストレーナーを 37 ° C の定温器で 45 分間 800 rpm で攪拌し、。 注: Lpl 酵素消化後にソリューションにリリースされます。<ol>
<li>セルを含む酵素液を収集し、50 mL の円錐管に新しいセル ストレーナー フィルターを適用します。</li>
	</ol></li>
	<li>酵素液でコラゲナーゼの活性をブロックするフィルターが適用されたセルに 20 mL (1 mM EDTA; 1 %cs、HBSS バッファー 3.1.3 の手順で作られ、ストアド手順 3.9.1 で氷の上) 冷たい洗浄メディアを追加します。室温で 6 分間 700 x g でチューブを遠心します。上澄みを廃棄し、1 mL の FACS バッファーで Lpl を含むペレットを再懸濁します。</li>
	<li>(ステップ 3.7.1) から IEL と LPL (ステップ 3.14) から分数を組み合わせるし、フローサイトメトリーによる解析のための抗体の蛍光標識と、それらを染色 (手順 5. を参照)。 注: IEL と LPL の分数は、区画情報が必要な場合別途染色する場合があります。</li>
</ol>4. 脾臓リンパ球の分離
<ol><li>微量遠心チューブに FACS バッファーの 500 μ L を追加することによって、コレクションの管を準備します。氷の上保管してください。</li>
	<li>コロン (ステップ 3.4) を取り出したら、全体の脾臓を収穫し、コレクションの管にそれを置きます。氷の上のティッシュを格納します。</li>
	<li>電気組織ホモジナイザーを使用して、300 x g [超小型遠心分離機] 部屋の温度や培養上清を吸引で 5 分間のサンプル約 1 分遠心遠心チューブに脾臓を均質化します。</li>
	<li>赤血球細胞の換散を実行するには、浸透圧の溶解によって細胞死を開始するアンモニウム塩化カリウム (ACK) 換散バッファーの 500 μ L のサンプルを再します。サンプルは室温で 1-2 分間インキュベートし、FACS バッファーの 725 μ L で再停止しなさいそれを許可します。</li>
	<li>300 × g [超小型遠心分離機] 部屋の温度や培養上清を吸引で 5 分間のサンプルを遠心します。500 μ L の FACS バッファーでペレットを再懸濁し、新しい微量遠心チューブに 40 μ m 携帯こし器を通ってそれをフィルターします。新しい微量遠心チューブにサンプル全体を転送し、フローサイトメトリー解析用蛍光色素標識された抗体で染色 (手順 5. を参照)。</li>
</ol>5. Dendra r+細胞を用いたフローサイトメトリーの同定
<ol><li>300 x g [超小型遠心分離機] 部屋の温度や培養上清を吸引で 5 分間で、IEL/LPL と脾臓のサンプルを遠心します。</li>
	<li>ミックスを汚す抗体の 100 μ L にペレットを再懸濁します。FACS バッファー サンプルごとの 100 μ L に蛍光標識抗 CD45 抗体の 1 μ L を追加してミックスを汚す抗体を準備します。 メモ: 彩度をバインドが発生する最適な濃度を決定するのに実験に先立ちフローサイトメトリー用使用抗体を滴定することが重要です。</li>
	<li>35 分 (暗い場所) の氷のサンプルをインキュベートします。</li>
	<li>FACS バッファーの 300 μ L のサンプルを再懸濁します、室温で 5 分間 300 x g [超小型遠心分離機] でそれらを遠心分離機します。上清を吸引し、FACS バッファーの 325 μ L のサンプルを再懸濁します。流れの cytometer でサンプルを分析します。</li>
</ol>

<ol>
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著者が明らかに何もありません。

同定と対話し、大腸の微生物叢によって影響を受ける細胞の解析は重要であり、体の残りの部分に粘膜の微小環境からの情報を中継する方法を理解していただく必要があります。腸関連細胞遊走を勉強するための 1 つのメソッドには、その組織ホーミング パターンを決定し、12,13を機能する受信者のマウスに養子の転送が続いて腸関連細胞の分離が必要です。このアプローチは、転送された特定の細胞型のみを追跡すること、限られました。さらに、組織および浄化プロセス、細胞の分離の結果の成果物は生体内で移住性プロセスを妨げる可能性があります。最近では、楓のマウスを用いた消化管細胞をラベルする内視鏡光電プロトコルは報告された14だったこの研究では、成体マウスの白血球、腸からの広範な売買をわかりました。
当社の報告書は新生仔マウスの大腸内のラベル セルに方法について説明し、脾臓などの余分な腸への移行を追跡します。ファム摘出マウスは遍在が不可逆的紫外線によってその活性化時に赤い蛍光性に切り替えられる蛍光グリーン蛍光 Dendra2 蛋白質を表現します。新生仔マウスのコロンの 405 nm の光への暴露のラベル両方 CD45+造血と CD45ネガティブ非造血細胞。CD45+Dendra2 赤+細胞、脾臓で造血細胞の余分な腸の移行を示す光変換後 3 〜 5 日が検出されました。
この試金の率制限ステップは、405 nm の光にさらされている大腸の領域の割合です。新生児のコロンの脆弱性と、便の存在とはいえこの初期の時代に最低限は挿入することができます繊維ファイバー カニューレの長さを制限します。前の実験で長いカニューレ挿入できませんでした正常に 5 mm 以上。 潤滑剤は、レーザ光の可変光の屈折の危険があるため避けた。カニューレの外側の動きすべての 30 s を助けたレーザー光にさらされる大腸領域を最大化します。重要なは、NA 値が大きいカニューレ (NA = 0.5) コロンの広い円錐状の光を生成に使用されました。
このプロトコルは、新生児 (日 0 - 2) 標準化されていますファム摘出した子犬。コンテンツとマウスの年齢とともに大腸の長さの変化を考えると、技術は古い子犬を使用する場合、それに応じて最適化する必要があります。主に、光変換および繊維光学のカニューレの挿入の長さの総計の持続時間の変更が必要になります。
コロンの細胞の回遊行動を理解することへのこのアプローチは、フローサイトメトリーによる解析によって促進されます。マルチパラ メーター フローサイトメトリーを識別するためにさらに使用可能性があります、内、CD45 表現型出稼ぎ免疫細胞型+セルのサブセット。Dendra2 r+細胞が遺伝子発現プロファイルやプロテオミクス解析などの下流の FACS でも並べ替えられます。本研究ではコロンの造血細胞サブセットの理解に向け、一方メソッドは、脳、皮膚など他の組織サイトから携帯電話の移行を検討する適応可能性があります。

哺乳類の消化管では、ホスト1との共生関係にある細菌の種の数百を隠し持っています。ローカルの環境で現在の免疫細胞は、これらの微生物との共存を適用し、病原体の侵入に対する保護バリアを確立します。したがって、免疫細胞と微生物相の双方向相互作用は免疫系を教育し、病原体に免疫反応性のしきい値を設定します共生コミュニティを確立する重要です。免疫恒常性を乱す、1 型糖尿病、IBD の2,3などの免疫介在性疾患につながる消化管の炎症を抑制する規制の回路を混乱する微生物の組成、または dysbiosis、することができます変更.
期間中に腸内微生物群集は同時に免疫システムを確立し始めるユニークな発達ウィンドウ出産後すぐには、4を成熟します。生後の微生物叢は自然群集組成とよく5の変化と、安定しません。明確な解剖学的の場所に - 腸粘膜および腸の上皮6微生物叢と相互作用する免疫細胞が存在します。(これは樹状細胞、単球、マクロファージを含める) 骨髄細胞、リンパ球 (T 細胞、B 細胞、自然免疫リンパ球様細胞など) を含む腸の免疫細胞の様々 なタイプがあります。これらの細胞、造血細胞とも呼ばれる腸粘膜バリアーを維持し、恒常性を維持する機能の多数を実行します。
腸のサイトで彼らの規制機能に加え粘膜の免疫細胞はまた全身性免疫7,8,9を規制する超腸サイト宛ての微生物を運ぶかもしれない。成長の研究関心のある分野で、その機能を調査するために腸管組織から移行免疫細胞を特定する方法の必要性を強調します。ここで報告されるプロトコルは、ラベル セルの光変換蛍光蛋白質を利用市販マウス モデルを利用しています。ファム摘出マウスは遍在が不可逆的紫外線 (UV) 光10赤蛍光活性化に切り替えられる緑の蛍光 Dendra2 蛋白質を表現します。新生仔マウスの大腸に 405 nm の光を提供する繊維光学カニューレを用いて、脾臓の生まれか、コロンを通過 photoconverted 造血細胞を見つけることができますを示す.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Laser&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Light Emitting Diode (LED)</td><td>THORLABS</td><td>M405FP1</td><td>CAUTION: this is a Class 3b laser. Safety goggles must be worn when using the laser. It emits a 405 nm wavelength with a current of 1400 mA. It is fiber-coupled. It accepts SMA connector. https://www.thorlabs.com/thorproduct.cfm?partnumber=M405FP1</td></tr><tr><td>LED driver</td><td>THORLABS</td><td>LEDD1B</td><td>Drives a constant current of 1200 mA through the laser. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=2616</td></tr><tr><td>Optogenetics patch cable</td><td>THORLABS</td><td>M87L01</td><td>1 m long cable with an SMA connector. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=11405&amp;amp;pn=M87L01#11454</td></tr><tr><td>Fiber optic cannula</td><td>Doric lenses&amp;nbsp;</td><td>MFC_480/500-0.5_5mm_ZF1.25_C45</td><td>5 mm long cannula with an outer diameter of 500 &amp;micro;m and an inner diameter of 480 &amp;micro;m. The NA value is 0.5. The ferrule is zirconia, 1.25 mm OD. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=6036</td></tr><tr><td>Power supply</td><td>THORLABS</td><td>KPS101</td><td>Supplies 15 V with a current of 2.4 A https://www.thorlabs.com/search/thorsearch.cfm?search=KPS101</td></tr><tr><td>LG3 laser safety goggles&amp;nbsp;</td><td>THORLABS</td><td>LG3</td><td>Orange lenses with 47% visible light transmission https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=762&amp;amp;pn=LG3#2523</td></tr><tr><td>Red light&amp;nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>74327-10</td><td>15 W lamp https://us.vwr.com/store/product/12360027/paterson-safelight-electron-microscopy-sciences</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Intestinal cell isolation&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-893-1389</td><td>CAUTION: inhalation of this anesthetic may cause dizziness, drowsiness, or even unconsciousness. This anesthetic should be used in a Class II hood.&amp;nbsp; https://www.pattersonvet.com/Supplies/ProductFamilyDetails/PIF_762328?carouselPageNumber=3</td></tr><tr><td>1X HBSS</td><td>Gibco</td><td>14025076</td><td>Ca/Mg free https://www.fishersci.com/shop/products/gibco-hbss-calcium-magnesium-no-phenol-red-4/14025076?searchHijack=true&amp;amp;searchTerm=14025076&amp;amp;searchType=RAPID&amp;amp;matchedCatNo=14025076</td></tr><tr><td>Calf Serum</td><td>Hyclone AZM</td><td>197696</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575020</td><td>0.5 M concentration https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15575020?SID=srch-srp-15575020</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>10197777001</td><td>CAUTION: harmful if swallowed and causes skin irritation. 1 M concentration https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/dttro?lang=en&amp;amp;region=US</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td>1 M concentration https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15630080?SID=srch-hj-15630080</td></tr><tr><td>Petri dish</td><td>Corning</td><td>353004</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-easy-grip-tissue-culture-dishes-2/08772f?searchHijack=true&amp;amp;searchTerm=08772F&amp;amp;searchType=RAPID&amp;amp;matchedCatNo=08772F</td></tr><tr><td>70 micron cell strainer</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087712</td></tr><tr><td>Micro magnetic stir bar</td><td>Fisherbrand</td><td>1451364</td><td>Rinse in 70% ethanol after each use. Rinse several times in distilled water prior to each use. The bar is 8 mm long with an octagonal shape. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-octagonal-magnetic-stir-bars-12/1451364#?keyword=1451364</td></tr><tr><td>Magnetic stir plate</td><td>Corning Laboratory Stirrers</td><td>440826</td><td>https://www.coleparmer.com/i/corning-440826-nine-position-stirrer-120-vac-60-hz/8430420?PubID=UX&amp;amp;persist=true&amp;amp;ip=no&amp;amp;gclid=CjwKCAiAqbvTBRAPEiwANEkyCLPLrWABXmOUI0QE53NLV0Owxlcs2V1K6rWbRPOwlcVVDq000FBiQxoCqQAQAvD_BwE</td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>Roche</td><td>5401020001</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/05401020001?lang=en&amp;amp;region=US&amp;amp;gclid=CjwKCAiAjuPRBRBxEiwAeQ2QPhE44qlvxjmo1PYu3zCas3w-_d6P9gKjXW82-c1EOm6NjPHCc5WuixoC_0IQAvD_BwE</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma</td><td>10104159001</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/10104159001?lang=en&amp;amp;region=US</td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Gibco</td><td>20012-027</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/20012027?SID=srch-hj-20012-027</td></tr><tr><td>Pipet aid</td><td>Thermo Scientific</td><td>14387165</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/s1-pipette-fillers/14387165#?keyword=14387165</td></tr><tr><td>10 mL serological pipet</td><td>Falcon</td><td>357530</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659</td></tr><tr><td>25 mL serological pipet</td><td>Falcon</td><td>357515</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659</td></tr><tr><td>15 mL conical centrifuge tube</td><td>Thermo Scientific</td><td>339651</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650</td></tr><tr><td>50 mL conical centrifuge tube</td><td>Thermo Scientific</td><td>339653</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Single cell suspension&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf tubes</td><td>Seal-Rite</td><td>1615-5500</td><td>Holds 1.5 mL. https://www.usascientific.com/Seal-Rite-1.5-ml-tube.aspx</td></tr><tr><td>Tissue homogenizer&amp;nbsp;</td><td>Kimble</td><td>K7495400000</td><td>Requires 2 AA batteries. https://www.fishersci.com/shop/products/kontes-pellet-pestle-cordless-motor-cordless-motor/k7495400000</td></tr><tr><td>Homogenizer tips&amp;nbsp;</td><td>Kimble</td><td>7495210590</td><td>Plastic, 0.5 mL tips https://www.fishersci.com/shop/products/kimble-chase-kontes-pellet-pestle-14/k7495210590#?keyword=7495210590</td></tr><tr><td>ACK lysing buffer</td><td>Gibco</td><td>A10492-01</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1049201?SID=srch-hj-A10492-01</td></tr><tr><td>40 micron cell strainer</td><td>Falcon</td><td>08-771-1</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087711</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Antibodies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BV786 anti-mouse CD45&amp;nbsp;</td><td>BD</td><td>564225</td><td>Clone 3O-F11 https://www.bdbiosciences.com/us/reagents/research/antibodies-buffers/immunology-reagents/anti-mouse-antibodies/cell-surface-antigens/bv786-rat-anti-mouse-cd45-30-f11/p/564225</td></tr><tr><td>Live/Dead</td><td>Invitrogen</td><td>L34962</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/L34962</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Other&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Razor blades</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td>Use for decapitation. https://us.vwr.com/store/product/4548306/vwr-razor-blades</td></tr></tbody></table>

in vivo photolabeling of cells in the colon to assess migratory potential of hematopoietic cells in neonatal mice

腸内細菌群集は、人生の早い段階で確立され、免疫細胞の発生と機能に影響を与えます。新生児の細菌は抗生物質の使用と自己免疫疾患および炎症性疾患への感受性に影響を与える食事を含む多数の外部の影響を受けやすいです。炎症性腸疾患 (IBD) などの疾患は、腸の免疫細胞の大量流入によって特徴付けられます。ただし、免疫細胞、細菌叢によって調節が超腸内サイトでの免疫反応に影響を与える腸から移住また。したがって、識別し、遠位のサイトに腸から微生物のメッセージを運ぶことができる細胞を分類する必要があります。ここでは、新生児マウス体内移行後余分な腸のサイトで彼らを識別するための大腸のラベル セルに手法について述べる。

光ファイバー ケーブルを使用して 2 日間の古いファム切除マウスのコロンに 405 nm の光を配信しました。前の実験で 30 秒露出は最小限の細胞毒性 (図 1A)、結腸細胞の最大光電を与えるに決定しました。したがって、コロンのさまざまなセグメントの連続 30 秒露出は、プロトコルに従って行われました。レーザ露光後マウスすぐに安楽死させ、セルの光電が決定されました。合計結腸組織の単一セル準備が蛍光標識抗 CD45 抗体で染色した、光電検出、フローサイトメトリーによる解析を行った。未変換の Dendra2 グリーン (Dendra g) 蛋白質 490 と 553 nm 励起と放射の最大値は、それぞれ、photoconverted Dendra2 赤 (Dendra-r) 蛋白質は、507 と 573 nm 励起と放射のマキシマに対し FITC チャンネルで検出できます。それぞれ流れの cytometer の PE チャンネルで検出することがあります。その赤フォームに切り替えられる不可逆的、Dendra2 は非常にあると長期追跡アプリケーションに役立ちます。
Unlasered マウス (図 1B 左) Dendra r+細胞は検出されませんでした。ただし、405 nm 露光結果 CD45negと CD45 の両方で異なる Dendra r+細胞集団+細胞コンパートメント (右図 1B )。新しく photoconverted マウスから脾臓を収穫できた大腸光電プロトコルは、超腸のサイトでセルの背景に起因した場合を決定する (T = 0)、フローサイトメトリーによる細胞 Dendra r+のための検定します。CD45negの CD45 Dendra r+細胞が検出されなかった+細胞コンパートメント (図 1C) 内大腸レーザー ビーム、photolabel 脾臓細胞に十分浸透していないことを示唆します。したがって、移行のための時間を可能にした後、脾臓で検出された Dendra r+セル (T = 3 d、5 d) コロンから由来している必要があります。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57929/57929fig1.jpg"> 図 1:生体内で結腸組織の光電。2 日間の古いファム摘出した子犬からコロンの細胞は 30 の内大腸の 405 nm の光にさらされた前述の s。光変換とセルのラベル付け処理の直後に決定した (T = 0)、大腸組織および脾臓の単一細胞製剤のフローサイトメトリーによる解析によって。この代表的なフローのフローサイトメトリーによるドット プロット (A) は、CD45 の式を示します (x-軸) と住んでいる死者染料の染色 (y-軸) コントロールと書込みマウスのコロンからの単一セルの準備で。BとCのパネルは、Dendra2 グリーン蛋白の発現を示す代表的なフロー フローサイトメトリーによるドット プロット オーバーレイ (Dendra2 g、水平軸) と Dendra2 赤タンパク質 (Dendra2-r、垂直軸) コントロール露出されていないのとCD45 を公開+ (造血) CD45ネガティブ(非造血) 細胞 (B) コロンと(C) 脾臓。<a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57929/57929fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
渡り鳥脾臓細胞を識別するために典型的な光電実験からのデータは、図 2のとおりです。図 1のように 2 日間の古いファム切除マウスのコロンのセルの光電を行った。マウス暴露後 3 〜 5 日を安楽死させ、脾臓で Dendra r+細胞の存在は、フローサイトメトリーによって決定されました。ビュー CD45neg細胞は主に上皮性と一貫性のある CD45neg細胞サブセットでない Dendra r+細胞と腸の他の構造細胞があった。いくつか CD45+造血細胞表現 Dendra r、彼らはコロンで photoconverted をされていた、脾臓に移行を示唆しています。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57929/57929fig2.jpg"> 図 2: CD45+造血細胞は脾臓にコロンから移行します。新生児 (日 0 - 2) ファム摘出マウスは、大腸内の露出によって photoconvert Dendra2 蛋白質に 405 nm の光にさらされました。代表的な流れの cytometry プロット表示 Dendra2 グリーン蛋白の発現 (Dendra2-g、水平軸) と Dendra2 赤タンパク質 (Dendra2-r、垂直軸) CD45ネガティブで CD45+非公開 5 日齢のマウスの脾細胞とマウスの 3 〜 5 日で分析を公開 (T = 3 d、5 d) 光変換後。<a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/57929/57929fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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In Vivo Photolabeling of Cells in the Colon to Assess Migratory Potential of Hematopoietic Cells in Neonatal Mice

ここで説明されているプロトコルは、超腸サイトにコロンから移住免疫細胞を特定する新生児マウスの photolabeling アプローチを採用しています。この戦略は、初期の生活におけるホスト マイクロバイ相互作用の研究に有用になります。

生体内で新生児マウスの造血細胞の移動の可能性を評価するためにコロンの細胞の Photolabeling

Enteric bacterial communities are established early in life and influence immune cell development and function. The neonatal microbiota is susceptible to ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Medicine

In Vivo Photolabeling of Cells in the Colon to Assess Migratory Potential of Hematopoietic Cells in Neonatal Mice

5.7K ビュー.  Massachusetts General Hospital. ここで説明されているプロトコルは、超腸サイトにコロンから移住免疫細胞を特定する新生児マウスの photolabeling アプローチを採用しています。この戦略は、初期の生活におけるホスト マイクロバイ相互作用の研究に有用になります。

ビデオ: In Vivo Photolabeling of Cells in the Colon to Assess Migratory Potential of Hematopoietic Cells in Neonatal Mice

A Method for Lineage Tracing of Corneal Cells Using Multi-color Fluorescent Reporter Mice

Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied for many decades, revealing seminal findings in developmental biology. More recently, it was adopted by stem cell biologists to identify and track different stem cell populations with minimal experimental intervention. The recent developments in mouse genetics, the availability of a large number of mouse strains, and the advancements in fluorescent microscopy allow the straightforward design of powerful lineage tracing systems for various tissues with basic expertise, using commercially available tools. We have recently taken advantage of this powerful methodology to explore the origin and fate of stem cells at the ocular surface using R26R-Confetti mouse. This model offers a multi-color genetic system, for the expression of 4 fluorescent genes in a random manner. Here we describe the principles of this methodology and provide an adaptable protocol for designing lineage tracing experiments; specifically for the corneal epithelium as well as for other tissues.

In this article we describe the principles for designing and performing a multi-color lineage tracing experiment using R26R-Confetti mice. We provide a specific protocol for tracking corneal epithelial cells which can be modified for other tissues of interest.

マルチカラー蛍光レポーターマウスを用いた角膜細胞の系譜トレースする方法

Lineage tracing experiments define the origin, fate and behavior of cells in a specific tissue or organism. This technique has been successfully applied ...

発生生物学

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.

分析<em&gt;インビボ</emゼブラフィッシュ胚における細胞移植とタイムラプスイメージングを使用して&gt;細胞移動

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo labeling of stem cells with a fluorescent dye, subsequent intravenous injection of the labeled cells and visualization of their accumulation in specific target organs or pathologies. The presented technique demonstrates how we label human mesenchymal stem cells (hMSC) by simple incubation with the lipophilic fluorescent dye DiD (C67H103CIN2O3S) and how we label human embryonic stem cells (hESC) with the FDA approved fluorescent dye Indocyanine Green (ICG). The uptake mechanism is via adherence and diffusion of the lypophilic dye across the phospholipid cell membrane bilayer. The labeling efficiency is usually improved if the cells are incubated with the dye in serum-free media as opposed to incubation in serum-containing media. Furthermore, the addition of the transfection agent Protamine Sulfate significantly improves contrast agent uptake.

This video shows techniques for labeling of human embryonic stem cells and mesenchymal stem cells with fluorescent dyes. This technique can be used for an in vivo tracking of transplanted stem cells with optical imaging and for histopathological correlations with fluorescence microscopy.

光イメージングによる非侵襲的検出のための蛍光色素で標識幹細胞

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

生物学

Use of In vivo Imaging to Monitor the Progression of Experimental Mouse Cytomegalovirus Infection in Neonates

Human Cytomegalovirus (HCMV or HHV-5) is a life-threatening pathogen in immune-compromised individuals. Upon congenital or neonatal infection, the virus can infect and replicate in the developing brain, which may induce severe neurological damage, including deafness and mental retardation. Despite the potential severity of the symptoms, the therapeutic options are limited by the unavailability of a vaccine and the absence of a specific antiviral therapy. Furthermore, a precise description of the molecular events occurring during infection of the central nervous system (CNS) is still lacking since observations mostly derive from the autopsy of infected children. Several animal models, such as rhesus macaque CMV, have been developed and provided important insights into CMV pathogenesis in the CNS. However, despite its evolutionary proximity with humans, this model was limited by the intracranial inoculation procedure used to infect the animals and consistently induce CNS infection. Furthermore, ethical considerations have promoted the development of alternative models, among which neonatal infection of newborn mice with mouse cytomegalovirus (MCMV) has recently led to significant advances. For instance, it was reported that intraperitoneal injection of MCMV to Balb/c neonates leads to infection of neurons and glial cells in specific areas of the brain. These findings suggested that experimental inoculation of mice might recapitulate the deficits induced by HCMV infection in children. Nevertheless, a dynamic analysis of MCMV infection of neonates is difficult to perform because classical methodology requires the sacrifice of a significant number of animals at different time points to analyze the viral burden and/or immune-related parameters. To circumvent this bottleneck and to enable future investigations of rare mutant animals, we applied in vivo imaging technology to perform a time-course analysis of the viral dissemination in the brain upon peripheral injection of a recombinant MCMV expressing luciferase to C57Bl/6 neonates.

Use of In vivo Imaging to Monitor the Progression of Experimental Mouse Cytomegalovirus Infection in Neonates

Human Cytomegalovirus (HCMV) infection of neonates represents an important cause of mental retardation, yet the molecular events leading to virus-induced pathogenesis are still poorly understood. To investigate the dynamics of brain infection, we adapted whole-animal in vivo imaging to perform time-course analysis of neonates infected with a luciferase-recombinant virus.

活用<em生体内で&gt;</em新生児の実験マウスサイトメガロウイルス感染の進行を監視する&gt;イメージング

Human Cytomegalovirus (HCMV or HHV-5) is a life-threatening  pathogen in immune-compromised individuals. Upon congenital or neonatal  infection, the virus ...

免疫・感染学

Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or pathogenic effects depending on the inflammatory milieu. Nonetheless, despite the indispensable role of neutrophils in immunity, detailed understanding of the molecular factors that mediate neutrophils' effector and immunopathogenic effects in different infectious diseases and inflammatory conditions is still lacking, partly because of their short half life, the difficulties with handling of these cells and the lack of reliable experimental protocols for obtaining sufficient numbers of neutrophils for downstream functional studies and adoptive transfer experiments. Therefore, simple, fast, economical and reliable methods are highly desirable for harvesting sufficient numbers of mouse neutrophils for assessing functions such as phagocytosis, killing, cytokine production, degranulation and trafficking. To that end, we present a reproducible density gradient centrifugation-based protocol, which can be adapted in any laboratory to isolate large numbers of neutrophils from the bone marrow of mice with high purity and viability. Moreover, we present a simple protocol that uses CellTracker dyes to label the isolated neutrophils, which can then be adoptively transferred into recipient mice and tracked in several tissues for at least 4 hr post-transfer using flow cytometry. Using this approach, differential labeling of neutrophils from wild-type and gene-deficient mice with different CellTracker dyes can be successfully employed to perform competitive repopulation studies for evaluating the direct role of specific genes in trafficking of neutrophils from the blood into target tissues in vivo.

We describe a protocol for isolation and purification of neutrophils from mouse bone marrow by density gradient centrifugation and for neutrophil labeling using CellTracker dyes. This represents a simple, fast, reproducible and economical method for obtaining large numbers of neutrophils for downstream functional studies or adoptive transfer and tracking experiments.

機能研究のためのマウス骨髄好中球と養子移入実験の分離、精製とラベリング

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or ...

A Label-Free Segmentation Approach for Intravital Imaging of Mammary Tumor Microenvironment

The ability to visualize complex and dynamic physiological interactions between numerous cell types and the extracellular matrix (ECM) within a live tumor microenvironment is an important step toward understanding mechanisms that regulate tumor progression. While this can be accomplished through current intravital imaging techniques, it remains challenging due to the heterogeneous nature of tissues and the need for spatial context within the experimental observation. To this end, we have developed an intravital imaging workflow that pairs collagen second harmonic generation imaging, endogenous fluorescence from the metabolic co-factor NAD(P)H, and fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) as a means to non-invasively compartmentalize the tumor microenvironment into basic domains of the tumor nest, the surrounding stroma or ECM, and the vasculature. This non-invasive protocol details the step-by-step process ranging from the acquisition of time-lapse images of mammary tumor models to post-processing analysis and image segmentation. The primary advantage of this workflow is that it exploits metabolic signatures to contextualize the dynamically changing live tumor microenvironment without the use of exogenous fluorescent labels, making it advantageous for human patient-derived xenograft (PDX) models and future clinical use where extrinsic fluorophores are not readily applicable.

The intravital imaging method described here utilizes collagen second harmonic generation and endogenous fluorescence from the metabolic co-factor NAD(P)H to non-invasively segment an unlabeled tumor microenvironment into tumor, stromal, and vascular compartments for in-depth analysis of 4D intravital images.

乳腺腫瘍微小環境の生体内イメージングのためのラベルフリーセグメンテーションアプローチ

The ability to visualize complex and dynamic physiological interactions between numerous cell types and the extracellular matrix (ECM) within a live tumor ...

がん研究

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal environment. Biological activities of immune cells mainly rely on their motility capacities. Blood monocytes have short half-life in the bloodstream; they originate in the bone marrow and are constitutively released from it. In inflammatory condition, this process is enhanced, leading to blood monocytosis and subsequent infiltration of the peripheral inflammatory tissues. Identifying the biomechanical events controlling monocyte trafficking from the bone marrow towards the vascular network is an important step to understand monocyte physiopathological relevance. We performed in vivo time-lapse imaging by two-photon microscopy of the skull bone marrow of the Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP (MacBlue) mouse. The MacBlue mouse expresses the fluorescent reporters enhanced cyan fluorescent protein (ECFP) under the control of a myeloid specific promoter 1, in combination with vascular network labelling. We describe how this approach enables the tracking of individual medullar monocytes in real time to further quantify the migratory behaviour within the bone marrow parenchyma and the vasculature, as well as cell-to-cell interactions. This approach provides novel insights into the biology of the bone marrow monocyte subsets and allows to further address how these cells can be influenced in specific pathological conditions.

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Monocytes are key regulators of innate immunity and play a critical role in the renewal of the peripheral mononuclear phagocytic system and in case of inflammation. This manuscript describes the procedure of real time imaging of the mouse calvaria bone marrow to study the monocyte mobilisation mechanism.

マウス骨髄単球の追跡<em&gt;インビボ</em

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal ...

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and temporal specificity2. Chemotaxis is a critical function of lymphocytes and other immune cells that can be quantitatively assessed in vitro. This manuscript describes methods that permit the evaluation of chemotaxis, both in vitro and in vivo, for diverse cell types including cell lines and native cells. The in vitro, plate-based format permits the comparison of several conditions simultaneously in real-time, and can be completed within 1-4 h. In vitro assay conditions can be manipulated to introduce agonists and antagonists, as well as differentiate chemotaxis from chemokinesis, which is random movement. For in vivo trafficking assessments, immune cells can be labeled with multiple fluorescent dyes and used for adoptive transfer. The differential labeling of cells allows for mixed cell populations to be introduced into the same animal, thereby decreasing variance and reducing the number of animals required for an adequately powered experiment. Migration into lymphoid tissue occurs in as little as 1 h, and multiple tissue compartments can be sampled. Flow cytometry following tissue harvest allows for a rapid and quantitative analysis of the migratory patterns of multiple cell types.

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Protocols for quantitative assessment of lymphocyte chemotaxis and migration are important tools for immunology research. Here, an in vitro protocol is described that permits real-time, multiplexed evaluation of cell migration, as well as a complementary in vivo technique enabling tracking of native cells to spleen.

ひと単球走化性の in VitroおよびIn Vivoマウス リンパ球の定量化

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and ...

Fluorescent Dye Labeling of Erythrocytes and Leukocytes for Studying the Flow Dynamics in Mouse Retinal Circulation

The retinal and choroidal blood flow dynamics may provide insight into the pathophysiology and sequelae of various ocular diseases, such as glaucoma, diabetic retinopathy, age-related macular degeneration (AMD) and other ocular inflammatory conditions. It may also help to monitor the therapeutic responses in the eye. The proper labeling of the blood cells, coupled with live-cell imaging of the labeled cells, allows for the investigation of the flow dynamics in the retinal and choroidal circulation. Here, we describe the standardized protocols of 1.5% indocyanine green (ICG) and 1% sodium fluorescein labeling of mice erythrocytes and leukocytes, respectively. Scanning laser ophthalmoscopy (SLO) was applied to visualize the labeled cells in the retinal circulation of C57BL/6J mice (wild type). Both methods demonstrated distinct fluorescently labeled cells in the mouse retinal circulation. These labeling methods can have wider applications in various ocular disease models.

Live-cell imaging of the labeled blood cells in ocular circulation can provide information about inflammation and ischemia in diabetic retinopathy and age-related macular degeneration. A protocol to label blood cells and image the labeled cells in the retinal circulation is described.

マウス網膜循環における血流動態を調べるための赤血球および白血球の蛍光色素標識

The retinal and choroidal blood flow dynamics may provide insight into the pathophysiology and sequelae of various ocular diseases, such as glaucoma, ...

医学

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and temporal resolution to study in vivo hematopoiesis using the murine bone marrow transplant experimental model. Genetic combinatorial marking using lentiviral vectors encoding fluorescent proteins (FPs) enabled cell fate mapping through advanced microscopy imaging. Vectors encoding five different FPs: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato, and mCherry were used to concurrently transduce HSPCs, creating a diverse palette of color marked cells. Imaging using confocal/two-photon hybrid microscopy enables simultaneous high resolution assessment of uniquely marked cells and their progeny in conjunction with structural components of the tissues. Volumetric analyses over large areas reveal that spectrally coded HSPC-derived cells can be detected non-invasively in various intact tissues, including the bone marrow (BM), for extensive periods of time following transplantation. Live studies combining video-rate multiphoton and confocal time-lapse imaging in 4D demonstrate the possibility of dynamic cellular and clonal tracking in a quantitative manner.

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Combinatorial 5 fluorescent proteins marking of hematopoietic stem and progenitor cells allows in vivo clonal tracking via confocal and two-photon microscopy, providing insights into bone marrow hematopoietic architecture during regeneration. This method allows non-invasive fate mapping of spectrally-coded HSPCs-derived cells in intact tissues for extensive periods of time following transplantation.

共焦点および多光子顕微鏡を用いて5蛍光タンパク質によってマーク造血幹細胞および前駆細胞の生体内でクローン追跡で

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

生体内で新生児マウスの造血細胞の移動の可能性を評価するためにコロンの細胞の Photolabeling

要約

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この動画の章

マルチカラー蛍光レポーターマウスを用いた角膜細胞の系譜トレースする方法

分析

光イメージングによる非侵襲的検出のための蛍光色素で標識幹細胞

活用

機能研究のためのマウス骨髄好中球と養子移入実験の分離、精製とラベリング

乳腺腫瘍微小環境の生体内イメージングのためのラベルフリーセグメンテーションアプローチ

マウス骨髄単球の追跡

ひと単球走化性の in VitroおよびIn Vivoマウスリンパ球の定量化

マウス網膜循環における血流動態を調べるための赤血球および白血球の蛍光色素標識

共焦点および多光子顕微鏡を用いて5蛍光タンパク質によってマーク造血幹細胞および前駆細胞の生体内でクローン追跡で

生体内で新生児マウスの造血細胞の移動の可能性を評価するためにコロンの細胞の Photolabeling

要約

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マルチカラー蛍光レポーターマウスを用いた角膜細胞の系譜トレースする方法

分析

光イメージングによる非侵襲的検出のための蛍光色素で標識幹細胞

活用

機能研究のためのマウス骨髄好中球と養子移入実験の分離、精製とラベリング

乳腺腫瘍微小環境の生体内イメージングのためのラベルフリーセグメンテーションアプローチ

マウス骨髄単球の追跡

ひと単球走化性の in VitroおよびIn Vivoマウス リンパ球の定量化

マウス網膜循環における血流動態を調べるための赤血球および白血球の蛍光色素標識

共焦点および多光子顕微鏡を用いて5蛍光タンパク質によってマーク造血幹細胞および前駆細胞の生体内でクローン追跡で

ひと単球走化性の in VitroおよびIn Vivoマウスリンパ球の定量化