Name: tracking mouse bone marrow monocytes in vivo
Uploaded: 2015-02-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo at JoVE.com

המחברים מבקשים להודות אן Daron ופייר לואי Loyher עבור עריכה סיוע, Plateforme Imagerie Pitié-סלפטרייר (PICPS) לקבלת סיוע במיקרוסקופ שני הפוטונים ומתקן בעלי החיים &quot;NAC&quot; וקמיל Baudesson לעכברי רביית סיוע. המחקר שיוביל לתוצאות אלה קיבל מימון מתכנית המסגרת השביעית של הקהילה האירופית (FP7 / 2007-2013) תחת הסכם מענק n ° 304,810 - פשיטות, וn ° 241,440-Endostem, מINSERM, מהאוניברסיטה לפירית et מארי קירי &quot;צמיחה &quot;, מla&quot; ליגת העל contre le סרטן &quot;, מתוך&quot; אגודת pour la משוכלל ונדיר sur le סרטן &quot;ומ-&quot; סוכנות הידיעות הלאומית דה לה משוכלל ונדיר &quot;צמיחת תכנית 2012 (ANR-אמה-050). PH נתמכה על ידי la &quot;ליגת העל contre le סרטן&quot;.

הערה: כל פרוטוקולי הניסוי אושרו על ידי הוועדה לניסויים בבע&quot;ח והאתיקה הצרפתית ומאומתים על ידי &quot;הגנת שירות et סנטה Animales, Environnement&quot; עם מספר-75-2065. גודל מדגם נבחרים כדי להבטיח שחזור של הניסויים, ובהתאם ל3R של רגולציה אתיקה של בעלי החיים. 1. הכנת העכבר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אלחוש <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתקופה קצרה של הדמיה (שעות פחות מ 1), לטשטש את העכבר עם זריקת intraperitoneal של 200 μl של תמיסת מלח המכילה קטמין (100 מ&quot;ג / קילוגרם) וXylazine (10 מ&quot;ג / קילוגרם). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלופין, לתקופה ארוכה יותר של הדמיה (עד 4 שעות), לטשטש את העכבר עם שאיפה של 2.5% isoflurane מתאדה בתערובת 70/30 של O 2 / N 2 O, דרך מסכה מותאמת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערה: בדרך זו מספקת לחוסר הכרה יציבה יותר ותמנע זריקת intraperitoneal סדרתי של תרופות. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר העכבר הוא הרדים, לבדוק חוסר הכרה באמצעות גירוי של כרית כף הרגל עם מצבטים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צביעת כלי דם / כתמים נוספים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור מכתים כלי דם: להזריק לוריד בוריד הזנב, 200 μl של Rhodamin-Dextran (2 מד&quot;א, 10 מ&quot;ג / מיליליטר במאגר מלוח). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור מכתים נויטרופילים: להזריק 2 מיקרוגרם של Ly6G-PE (שיבוט 1A8) בתמיסת מלח לוריד בוריד הזנב 100 μl. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קיבוע <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקיבוע, השתמש בעל stereotactic מותאמת אישית המותאם למיקרוסקופ ולמכשיר אינהלציה גז ההרדמה. הערה: בעל sterotactic היא תמיכת מתכת עם שני סוגריים לוחית מתכת, אחד להיות קבוע ונשלפים וישימה אחרים, להדק את ראשו של בעל החיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התקן את הראש של העכבר בין לוחות התמך כדי להבטיח בידוד מתנועות נשימה. הדק את האוזניים בין צלחות וראש למתוח את sk שמירהב. בדקו יציבות ורווחה נשימה של בעלי החיים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הקרקפת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשתמש בזהירות אתנול 70% להרטיב את השיער של הקרקפת עם המוליך סטרילי, הימנעות ממגע עם העיניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את העור עם מספריים ומלקחיים סטריליים כדי להסיר באופן מלא את הקרקפת מאחורה של העצם הקודקודית לעצם הקדמי. הרחק עד 3 מ&quot;מ מעיניים ואוזניים למניעת דימום נרחב. הסר את רקמת חיבור הרופפת המכסה את הגולגולת (קרום עצם). לשטוף את השיער שנשאר עם מגבת נייר ספוג-PBS חם. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערכת טבילה להגדיר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדבק טבעת גומי בקוטר 18 מ&quot;מ עם דבק כירורגים ישירות על הגולגולת באמצעות מחט מד קטנה לשלוט הפצה. מדביק את כל הפריפריה של טבעת הגומי כדי למנוע דליפה (30 μl צריך להיות מספיק). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את הגולגולת מתחת לזירה בפעם האחרונה עם מגבת נייר ספוג-PBS ולאחר מכן להוסיף 37 ° C PBS לטבילה של שלמהגולגולת. הוסף ירידה של 0.9% NaCl פתרון או משחת עיניים ספציפי בכל עין של העכבר, כדי למנוע יובש בעיניים. גרור את בעל stereotactic תחת המטרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כ למקם את השדה באמצעות עינית המיקרוסקופ באמצעות העברת ישירה. </li></ol></li></ol> 2. רכישת הדמיה שני פוטונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במיקרוסקופ multiphoton יחד עם Ti: לייזר גביש ספיר, המספק פולסים 140fs של אור NIR, באופן סלקטיבי מתכונן מ -680, ל- 1,080 ננומטר, ומאפנן acousto אופטי לבקרת כוח הלייזר. השתמש בתצורה כולל 3 גלאים חיצוניים-descanned שאינו (NDD) (המאפשרים הקלטה בו זמנית של 3 ערוצי ניאון) עם שילוב של 2 מראות dichroic (565 ננומטר ו690 ננומטר), 565/610 500/550 ומסנני bandpass, ו 485 מסנן קצר לעבור, עם Apochromat תכנית × 20 (NA = 1) מטרת טבילה במים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את תא החימום כדי לאפשר homeothermy הטוב של anaesעכבר thetized., הערה: טמפרטורה עשויה להיות מוגדרת 1 שעה לפני פגישת ההדמיה ליציבות טובה יותר. במקרה שלנו, 32 ° C נבחר כדי לקבל את טמפרטורת גוף אופטימלית של העכבר המורדם (36-37 ° C) ומתוחזק עד 4 שעות. טמפרטורה זו עשויה להיות מותאמת למערכת בשימוש (בדיקה דיגיטלית יכולה לשמש כדי לבדוק נקודה זו). בנוסף, תא החימום משמש הוא כהה / שחור ומכסה חלק מהמערכת (היעדים וצלחת ממונעת), כדי למנוע זיהום אור חיצוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את המערכת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את טי: ספיר הלייזר, ולאחר מכן מערכת מיקרוסקופ כולה. הפעל את תוכנת הרכישה. הגדר את טווח אורך גל לייזר 870 ננומטר. בחר NDD המתאים להקלטה. הערה: במקרה שלנו, דור שני הרמוני (SHG) 19 וחלבון ציאן ניאון (ECFP) מזוהים על ידי NDD לאחר לעבור סינון קצר 485. ECFP גם זוהה על ידי NDD לאחר מסנן 500/550 bandpass וrhodamin-dextran הוא זוהה על ידי tהוא NDD לאחר מסנן 565/610 bandpass. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את הגדרות רכישה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בפקודת ההדמיה &quot;רכישה חי&quot; של התוכנה והשימוש בשליטה כיוונית מיקרוסקופ, לשנות את הפוקוס על אזור עם אות ECFP וRhodamine. הגדר את כוח הלייזר עד למינימום כדי להשיג יחס אות לרעש הטוב ביותר עם תמונה-נזק מינימאלי. הערה: הגדרת ההספק משמשת משתנה בהתאם לעומק של האזור של עניין. בדרך כלל הגדרות AOM מוגדרות כ -20%, המייצג את כוח לייזר מעבר למטרה כ -15 מילי-ואט. עדיף להגדיל את הכח הרווח על PMTs לכל NDD להפחית צילום הלבנה וצילום נזק. הגדרות רכישה אופייניות הן סריקה יחידה עם פיקסל להתעכב זמן של 1.58 מייקרו-שני, ורזולוציה של 512 x 512 פיקסלים עם הגדלה של 1.5. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אזורים נבחרים של ריבית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע פרמטרים הקלטה נקבעים, להשתמש בו שוב את פקודת הרכישה &quot;חי&quot;,ותסקור את הרקמה לבחור (x, y, z) שדה רצוי להיות במעקב בזמן אמת. הערה: בדרך כלל, בחרנו שדה כולל שני כלי דם ובאזורי parenchymal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרשם השדה עם פקודת התוכנה &quot;עמדה&quot;. הערה: פקודה זו משננת x, y, z קואורדינטות של שדות רחוקים שונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר ולהירשם תחומים נוספים של ריבית (עד 3) באותו האופן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגדיר Z- מחסנית 3D עם פקודת התוכנה &quot;Z- המחסנית&quot; על העמדה שיננה הראשונה בהתאם להיקף הנדרש עם הגדלה בחרה. לשנן עמדה עמוקה ראשונה, ולאחר מכן המיקום הגבוה ביותר. לנרמל כוח לייזר עם העומק. הערה: להדמית שדה הנלווה מרובה, אנו רוכשים 5 פרוסות מופרדות על ידי z-שלבי 3 מיקרומטר עבור כל שדה לרכישה בהיקף של 12 מיקרומטר עובי. הגדרות אלה עשויות להיות מותאמות לסוג של תא למד. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רכישת השקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר220; זמן סדרה &quot;פקודת התוכנה ולבחור את משך הזמן של מרווח זמן ומספר המחזורים. בגין הזמן לשגות הדמיה לפי הזמן לשגות ומשך הזמן הנדרש על ידי בחירת &quot;להתחיל ניסוי&quot; פקודת התוכנה. הערה: במקרה שלנו, אנו רוכשים כרך אחד כל שנייה 30 במהלך 60 מחזורים מייצגים בזמן אמת 30 דקות. זמן לשגות קטן יותר ניתן לבצע כדי לעקוב אחר גלגול תא מהיר בכלי הדם. במקרה זה-ערימת z דקה יותר ולא יותר מ -2 תחומים שונים ניתן להקליט באותו הזמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעקב שוטף אחר להגדיר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמיד לפקח על בעלי החיים כדי לוודא שהוא מחוסר הכרה. הערה: טלטול של שפם או רגליו של בעל החיים הן אינדיקטורים של תחייה. במקרה הנשימה של בעלי החיים היא קופצנית, כמות isoflurane יכולה להיות מופחתת במקצת. להיסחף רקמה חזקה במהלך הרכישה הוא אינדיקטור של תחיית עכבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא המטרה הוא שקוע כראוי. לחדש 37 ° C betwee PBSn שתי רכישות (30 דקות). הערה: היעלמות מתקדמת של אות במהלך הרכישה היא אינדיקטור של דליפת PBS. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סיומו של הליך <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שקטעי הווידאו הנדרש נרשמים, להרדימו על ידי נקע בצוואר הרחם במהירות לפני ההחייאה. הערה: ריפוי פצעים מוביל להיווצרות של גלד ב -24 עד 48 שעות המגבילה את האפשרות לבצע הדמיה אורך. </li></ol></li></ol> ניתוח 3. נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תיקון דריפט <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתוכנת Imaris Bitplane למעקב אוטומטי 3D. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את התמונה ברצף 3D על Imaris. בחר &quot;נקודה&quot; הפקודה, וליצור מעקב ידני (לחיצת עכבר + shift) לכל נקודות הזמן למינימום של 4 נקודות עיגון שונות, במידת האפשר מופץ בצורה הומוגנית בתחום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל התיקון להיסחף באמצעות הפקודה &quot;להיסחף נכון&quot; בכרטיסייה &quot;מסלול עריכה&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק עבור tהוא האיכות של התיקון בx, y ובמיוחד בz כדי למנוע התלבטויות artefactual. הערה: אם התיקון אינו משביע רצון, לנסות נקודות עיגון אחרות או להוציא וידאו מהניתוח. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעקב סלולארי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש &quot;להוסיף כתמים חדשים&quot; הפקודה ובחר &quot;כתמי מסלול לאורך הזמן&quot; הגדרת אלגוריתם. עבור לצעד הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל הליך מעקב תא אוטומטי או על כל הערוץ של עניין באמצעות פקודת &quot;ערוץ המקור&quot;. קוטר אובייקטי סט (כלומר, תאים) עד 10 מיקרומטר. עבור לצעד הבא. הערה: הבחירה תהיה תלויה בהבחנה בין אובייקטים וספציפיות של האות הנמדדת. בקיצור, מעקב אוטומטי על כל הערוץ אפשרי רק אם האות זוהתה היא ספציפית לאובייקט של עניין. מכיוון שגם SHG וECFP מזוהים על ידי NDD לאחר מסנן 485 לעבור קצר, מעקב יהיה יותר ספציפי ויעיל באמצעות אות ECFP נרשמה על ידי NDD לאחר 500/550 מסנני bandpass. אשכול או אובייקטים צפופים, ידרשו בחירה ידנית של אובייקטים בודדים דומים לצעד 3.1.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את סוג מסנן &quot;איכות&quot;, לקבוע את הסף להוציא מעקב של אובייקטים נוקבים. עבור לצעד הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר &quot;בראונית האלגוריתם Motion&quot; עם פרמטרים מדויקים של &quot;מרחק מקס&quot; ו- &quot;גודל פער&quot; בין שתי נקודות. לאמת דור מסלול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שמסלולים מחושבים באופן אוטומטי, בחר סוג המסנן &quot;משך מסלול&quot;, לקבוע את הסף לחסל מסלולים קצרים יותר מ -120 שניות (המייצגות את 4 נקודות זמן). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חובה: אחרי מעקב אוטומטי, לבדוק את האיכות של השירים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפרוש על סרגל הזמן כדי לבדוק שחפצי מעקב נתיבי המסלול. אם לא, השתמש באפשרויות של תיקון נקודת מסלול הזמינות בכרטיסייה &quot;ערוך&quot;: מחיקת שירים כוזבים או לא תקינים עם &quot;למחוק&quot; הפקודה (למחוק את כל p מסלולoint בנפרד באמצעות פקודת &quot;ניתוק&quot;). אם נתיב מסלול הוא רציף, להוסיף נקודות חסרות זמן (לחיצת עכבר + shift), לבחור את כל הנקודות במסלול מסוים, ולהשתמש &quot;להתחבר&quot; הפקודה בכרטיסייה &quot;מסלול עריכה&quot;. </li></ol></li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרמטרים כימות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר בכרטיסייה &quot;הסטטיסטיקה&quot; בפקודה &quot;העדפות&quot;, לבחור את הפרמטרים הדינמיים של עניין ברשימה. בחר &quot;לייצא את כל הנתונים הסטטיסטיים לקובץ&quot; הפקודה ולשמור את קובץ Excel שנוצר. הערה: פרמטרים דינמיים כמה ישירות מתקבלים מהתוכנה כגון אורכי מסלול, מהירות רגעית, מהירות ממוצעת, ולעקוב אחר יושר. מקדם תנועתיות 6, 20 ניתן לקבוע אך אינו מסופקים ישירות על ידי התוכנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל תא, לחשב את הממוצע של ההתקות לכל תקופת זמן (אורך יממה) (לסרט הזמן לשגות 30 שניות, אורך היממה תהיה 30, 60, 90 שניות, וכו &#39;).עלילה המרושעת של העקירה רבועה כפונקציה של מרווח הזמן. להשיג מקדם תנועתיות ידי חישוב השיפוע של חלק הליניארי של העקומה. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Ovchinnikov, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+Gal4-dependent+transgenes+in+cells+of+the+mononuclear+phagocyte+system+labeled+with+enhanced+cyan+fluorescent+protein+using+Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP+double-transgenic+mice.">Expression of Gal4-dependent transgenes in cells of the mononuclear phagocyte system labeled with enhanced cyan fluorescent protein using Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP double-transgenic mice.</a> J Leukoc Biol. 83, 430-433 (2008).</li><li>Parihar, A., Eubank, T. D., Doseff, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocytes+and+macrophages+regulate+immunity+through+dynamic+networks+of+survival+and+cell+death.">Monocytes and macrophages regulate immunity through dynamic networks of survival and cell death.</a> J Innate Immun. 2, 204-215 (2010).</li><li>Geissmann, F., Jung, S., Littman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+monocytes+consist+of+two+principal+subsets+with+distinct+migratory+properties.">Blood monocytes consist of two principal subsets with distinct migratory properties.</a> Immunity. 19, 71-82 (2003).</li><li>Robbins, C. S., Swirski, F. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+multiple+roles+of+monocyte+subsets+in+steady+state+and+inflammation.">The multiple roles of monocyte subsets in steady state and inflammation.</a> Cell Mol Life Sci. 67, 2685-2693 (2010).</li><li>Shi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow+mesenchymal+stem+and+progenitor+cells+induce+monocyte+emigration+in+response+to+circulating+toll-like+receptor+ligands.">Bone marrow mesenchymal stem and progenitor cells induce monocyte emigration in response to circulating toll-like receptor ligands.</a> Immunity. 34, 590-601 (2011).</li><li>Jacquelin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CX3CR1+reduces+Ly6Chigh-monocyte+motility+within+and+release+from+the+bone+marrow+after+chemotherapy+in+mice.">CX3CR1 reduces Ly6Chigh-monocyte motility within and release from the bone marrow after chemotherapy in mice.</a> Blood. 122, 674-683 (2013).</li><li>Swirski, F. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+splenic+reservoir+monocytes+and+their+deployment+to+inflammatory+sites.">Identification of splenic reservoir monocytes and their deployment to inflammatory sites.</a> Science. 325, 612-616 (2009).</li><li>Germain, R. N., Miller, M. J., Dustin, M. L., Nussenzweig, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+imaging+of+the+immune+system:+progress,+pitfalls+and+promise.">Dynamic imaging of the immune system: progress, pitfalls and promise.</a> Nat Rev Immunol. 6, 497-507 (2006).</li><li>Charo, I. F., Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+many+roles+of+chemokines+and+chemokine+receptors+in+inflammation.">The many roles of chemokines and chemokine receptors in inflammation.</a> N Engl J Med. 354, 610-621 (2006).</li><li>Milo, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+imaging+reveals+promiscuous+crosspresentation+of+blood-borne+antigens+to+naive+CD8++T+cells+in+the+bone+marrow.">Dynamic imaging reveals promiscuous crosspresentation of blood-borne antigens to naive CD8+ T cells in the bone marrow.</a> 122, 193-208 (2013).</li><li>Cavanagh, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+bone+marrow-resident+memory+T+cells+by+circulating,+antigen-bearing+dendritic+cells.">Activation of bone marrow-resident memory T cells by circulating, antigen-bearing dendritic cells.</a> Nat Immunol. 6, 1029-1037 (2005).</li><li>Mazo, I. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow+is+a+major+reservoir+and+site+of+recruitment+for+central+memory+CD8++T+cells.">Bone marrow is a major reservoir and site of recruitment for central memory CD8+ T cells.</a> Immunity. 22, 259-270 (2005).</li><li>Travlos, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+structure,+function,+and+histology+of+the+bone+marrow.">Normal structure, function, and histology of the bone marrow.</a> Toxicol Pathol. 34, 548-565 (2006).</li><li>Mazo, I. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+progenitor+cell+rolling+in+bone+marrow+microvessels:+parallel+contributions+by+endothelial+selectins+and+vascular+cell+adhesion+molecule+1.">Hematopoietic progenitor cell rolling in bone marrow microvessels: parallel contributions by endothelial selectins and vascular cell adhesion molecule 1.</a> J Exp Med. 188, 465-474 (1998).</li><li>Rashidi, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+time-lapse+imaging+of+mouse+bone+marrow+reveals+differential+niche+engagement+by+quiescent+and+naturally+activated+hematopoietic+stem+cells.">In vivo time-lapse imaging of mouse bone marrow reveals differential niche engagement by quiescent and naturally activated hematopoietic stem cells.</a> Blood. , (2014).</li><li>Sipkins, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+specialized+bone+marrow+endothelial+microdomains+for+tumour+engraftment.">In vivo imaging of specialized bone marrow endothelial microdomains for tumour engraftment.</a> Nature. 435, 969-973 (2005).</li><li>Cariappa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perisinusoidal+B+cells+in+the+bone+marrow+participate+in+T-independent+responses+to+blood-borne+microbes.">Perisinusoidal B cells in the bone marrow participate in T-independent responses to blood-borne microbes.</a> Immunity. 23, 397-407 (2005).</li><li>Junt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+visualization+of+thrombopoiesis+within+bone+marrow.">Dynamic visualization of thrombopoiesis within bone marrow.</a> Science. 317, 1767-1770 (2007).</li><li>Zoumi, A., Yeh, A., Tromberg, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+cells+and+extracellular+matrix+in+vivo+by+using+second-harmonic+generation+and+two-photon+excited+fluorescence.">Imaging cells and extracellular matrix in vivo by using second-harmonic generation and two-photon excited fluorescence.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 11014-11019 (2002).</li><li>Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+lymphocyte+motility+and+antigen+response+in+intact+lymph+node.">Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node.</a> Science. 296, 1869-1873 (2002).</li><li>Cahalan, M. D., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Choreography+of+cell+motility+and+interaction+dynamics+imaged+by+two-photon+microscopy+in+lymphoid+organs.">Choreography of cell motility and interaction dynamics imaged by two-photon microscopy in lymphoid organs.</a> Annu Rev Immunol. 26, 585-626 (2008).</li><li>Yost, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+neutrophil+extracellular+trap+(NET)+formation:+a+novel+innate+immune+deficiency+of+human+neonates.">Impaired neutrophil extracellular trap (NET) formation: a novel innate immune deficiency of human neonates.</a> Blood. 113, 6419-6427 (2009).</li><li>Devi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+imaging+reveals+a+new+leukocyte+recruitment+paradigm+in+the+glomerulus.">Multiphoton imaging reveals a new leukocyte recruitment paradigm in the glomerulus.</a> Nat Med. 19, 107-112 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

נקודות הקריטיות של in vivo מתודולוגיה ההדמיה הן להבטיח את היציבות של המיקוד במטרה למקסם את משך הזמן של הדמיה וכדי למזער את סיכון לזיהום חיידקים ודלקות, אשר עשוי להשפיע על הדינמיקה של תאי הדלקת. הדמיה של מוח עצם גולגולת כדלקמן מטרות אלה כניתוח שבוצע כדי לקבל גישה למח העצם הוא מינימאלי. השימוש בחומר החיטוי וסטרילי הוא חיוני כדי להגביל את הסיכון לזיהום שעלול לגרום להפרעות בהומאוסטזיס תא. פיתוחו של בעל stereotactic עשוי להיות מאתגר ודורש התאמה אישית ספציפית לכל מערכת (מרחק בין במה אובייקטיבית וממונעת של המיקרוסקופ, שימוש במכשיר אינהלציה גז להרדמה). חשוב לקבל את הראש של העכבר כאופקי ככל האפשר לגישת משטח הדמיה רחבה יותר. ברגע שבעלי החיים נמצאים בעמדה, סביר להניח שכמה דקות יכולות להיות required להשיג יציבות טובה של מטוס המוקד. לכן, מומלץ לבדוק להיסחף רקמה לפני השקת הקלטת הרכישה. בגלל תהליך זה ביחד עם מבחר של אזורים של עניין יכול להימשך זמן מה, זה מומלץ גם לבדוק באופן קבוע כי בעלי החיים הוא לא מודע אם Ketamin / Xylazin היה בשימוש, וכדי לבדוק אם טבילה נכונה של המטרה כדליפה ואידוי יכול להתרחש. מיקום הטוב של טבעת הגומי בגולגולת מייצג עוד צעד קריטי בתהליך. דבק cyanoacrylate מספק תוצאות טובות במונחים של יציבות ואיטום, אבל צריך למנוע העמסת יתר של דבק, שיכול לכסות את גישת הגולגולת ובלוק לאזור של עניין של הרקמה. היתרון של טבילה ישירה של הגולגולת ללא coverslip זכוכית הוא להשיג גישה לאזורים עמוקים יותר של העצם. בנוסף, מאז הגולגולת היא לא משטח רגיל, זה לא יגביל את אזור ההדמיה לconמשטח טקט בין הגולגולת וcoverslip, המאפשר תחום הדמיה רחב, כפי שמוצג באיור 1. לכל טכנולוגיות ההדמיה, הבחירה בין מהירות רכישה ואיכות רזולוציה היא פשרה. לכן, המספר והאיכות של תמונות ליחידת זמן מוגבל, והבחירה תלויה בשאלה המדעית התייחסה. בדרך כלל, מונוציטים כלי דמם מהר מתגלגלים תאים, ואילו מונוציטים parenchymal הם ניע או נייחים איטיים. מעקב מדויק של תאים מתגלגלים דורש רזולוציה גבוהה יותר עת רכישה, כפי שמוצג באיור 2. שיעור הדמיה גבוהה לתאים נייחים הוא x חסר תועלת וגבוה, y, z רזולוציה יכולה להיות מועדפת לניתוח פעילות מִזדַקֵר של דנדריטים למשל. תאים מהיר ידרשו נפח עבה כדי לקבל מעקב ארוך יותר של עקירתם בz. העקירה מרובעת הממוצעת כפונקציה של הזמן אינה מסופקת על ידי Imaris התוכנה. פרינציפle של ייצוג זה מבוסס על העובדה ש, לאובייקט שנסע בליסטי ללא כל מפגש או התכווצות מבנית, המרחק זה נסע יהיה פרופורציונאלי למרווח הזמן (איור 2 ד). כך הליניאריות של המדרון מציינת הליכה אקראית בסביבה שאינה מוגבלת. בניגוד לכך, צורה אסימפטוטית של העקומה תשקף עקירה מוגבלת לאורך הזמן של אוכלוסיית התא. היתרון השני של חישוב זה הוא שמהירות לעתים בהערכת על ידי עקירת artefactual של מרכז המסה. הדבר חשוב במיוחד לתא ניעתי איטי עם פעילות מִזדַקֵר. לפיכך, חישוב של מקדם תנועתיות על ידי שיפוע העקום מחושב על ידי רגרסיה ליניארית מצביע על תזוזה אמיתית של זמן cellover 21. צביעת Ly6G in vivo ממחישה את האפשרות להוסיף פרמטר חדש של ניתוח במהלך תהליך ההדמיה (איור 3 </strong&gt;). יש לנו להשתמש בטכניקה זו כדי להכתים חדירת נויטרופילים כלי דם לפצע בעור, ולא הבחנו בפגם בניידות שלהם מצביע על שום שינוי תפקודי (אל Rodero et in press). למרות שיותר מ 98% של נויטרופילים כלי דם מסומנים כראוי, ההכתמה של נויטרופילים מח עצם היא פחות יעילה, ואת עוצמת הקרינה הממוצעת בחום מופחתת, המצביעה על גישה מופחתת של הנוגדנים כלפי parenchyma מח עצם (מידע לא מוצג). dextran Rhodamin, נקודות קוונטיות, או צבעים ספציפיים אחרים של תאים אפופטוטיים או נימקי כגון DAPI, יודיד Propidium, Sytox 22, או כתב ניאון עבור פונקציות תא כגון ייצור של מיני חמצן מגיבים 23, ניתן להוסיף לוריד דרך וריד הזנב במהלך הדמיה תהליך ומציע הזדמנות טובה לכמת תכונות פונקציונליות כגון מוות של תאים, phagocytosis ומלכודת תאית נויטרופילים. Mazo et al 12 יפה השתמש בשני צבעים שונים של כלי דםעם משקל מולקולרי נמוך וגבוה לparenchyma ניגוד טוב יותר וכלי דם. הבחירה של צבע הניאון היא קריטית כדי לאפשר רכישה קשורה של כתבי ניאון השונים. ואכן, גל העירור ייבחר בהתאם כדי לקבל את הפשרה הטובה ביותר בין כל צבעי הניאון משמשים. הפרוטוקול המשמש במסמך זה מאפשר לנתח in vivo הפעילות הביולוגית של תא תא, מחקר שבם היה כל כך קשה בהרבה. ניתוח היסטולוגית של רקמת מוח עצם בדרך כלל דורש הכנת decalcification העצם ארוכה כדי לאפשר דק סעיף, וזה רק מספק תצוגה סטטית של הרקמה. התצוגה דינאמית מדגישה את שער חליפין בין תא parenchyma וsinusoids מח עצם. תהליך מהיר זה הוא צעד חיוני כדי לפענח כדי לקבל הבנה טובה יותר של מנגנון גיוס תא על אות דלקתית 5 או נפשית מראש כימותרפיה myeloaplasiveמשטר 6. יש לנו דיווח אירוע של תא intravasation 6 אך תהליך זה הוא בקושי לזיהוי בשל התדירות הנמוכה במצב יציב. עם זאת, סביר להניח שיהיה משופר על איתות דלקתית. קולטנים chemokine כגון CCR2, CX3CR1 או CXCR4 הם מעורבים מאוד בתהליך של intravasation, ומכאן השימוש בפסילה גנטית של קולטנים אלה אמורים לספק תובנות יסוד רומן במסלולים של נדידת תאים

The bone marrow plays a central role in hematopoiesis and represents the main reservoir of monocytes that constitutively recirculate between the blood and the medullar parenchyma, renew the pool of circulating monocytes with a short life span 2,3 and participate in the reconstitution of the steady state tissue-macrophages and dendritic cells 4. During inflammation or after transient aplasia, monocytes are actively mobilized from either the bone marrow or the spleen 5, 6, 7 and colonize inflamed organs. Several chemoattractant axis have been involved in the process of myeloid cell mobilization from the bone marrow 8, 5, 6,9. Beyond the myeloid compartment the bone marrow is also an important site of T lymphocyte priming 10 and a niche of immunological memory 11,12. Thus, this tissue is central for numerous investigations in the field of hematology and immunology. Our knowledge on the structural organization of medullar myeloid cells mainly arises from the analysis of histological section of fixed tissues 13. This static view does not allow for a study of the cellular exchange dynamic between the different compartments of the bone marrow, which is the basis of its functional activity.
Intravital imaging constitutes an important biological input in the study of cell mobility, cell adherence and cell-to-cell interactions, which were previously described only from in vitro systems. Technical challenges for proper intravital imaging include the ability to reach the tissue of interest in an optical point of view, and to maximize its isolation from physiological (breath, muscle or peristaltic contractions) or mechanical drifts (tissue disruption and extension following surgery, and exposure to microscope objective as well as temperature and vascular/oxygenation perturbations). Microscopic drifts may limit the ability to keep the focus a long time and could introduce artifacts in the quantification of cell motility. One alternative, validated for several tissues to reduce these technical difficulties, is to work on explanted tissue incubated in a thermostated and oxygenated medium; however, complete disruption of the lymphatic and vascular circulation may be problematic. Intravital imaging of skull bone marrow has several advantages concerning these issues. Firstly, it requires minimal surgical action. Secondly, thickness of the bone in this region allows direct visualization of bone marrow niches without abrasion, thus reducing physiological perturbations. The medullar network can be imaged in the parasagittal region of the bone; however the sinusoids are more visible in the fronto-parietal area where the bone matrix is thinner12,14. 
Intravital imaging relies on the availability of the most accurate fluorescent reporter tagging the population of interest. In vitro labelling of purified cell population before adoptive transfer led to important characterization of hematopoietic stem cell niches 15 or bone marrow endothelial microdomains favouring tumor engraftment 16, and provided several fundamental inputs on key concepts in immunology 17 . However, this approach usually requires hundreds of thousands of cells to get a chance to detect them afterwards in vivo. This could be explained by the high mortality rate following staining, the dilution in the whole body and the change in the activation state, which might lead to biased homing. Endogenous tagging from transgenic mouse system greatly overcomes these limitations and has allowed to image the behaviour of endogenous osteoblast 8, megakaryocytes 18 or myeloid-lineage subsets 6 . Nevertheless, one has to be cautious when considering the specificity of the fluorescent reporter among the studied subset. 
The Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP, called MacBlue mouse 1, is a valuable transgenic system to study medullar monocytes with real time imaging 6. Intravenous injection of high molecular weight rhodamin-dextran distinguishes the medullar parenchyma from the vascular sinusoid network of the bone marrow. Using this approach, it is possible to track the monocyte behaviour in the different medullar compartments in a specific physiopathological context of interest. Furthermore, we propose an additional strategy to compare monocyte dynamics with that of neutrophils through in vivo labelling using a specific antibody.

<table><tbody><tr><td>Ketamin</td><td>Merial</td><td></td><td>100 mg/ml, anesthetic</td></tr><tr><td>Xylazin</td><td>Bayer HealthCare</td><td></td><td>10 mg/ml, anesthetic</td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Baxter</td><td></td><td>2.5%, anesthetic</td></tr><tr><td>O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;/NO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td>70/30 mixture, anesthetic</td></tr><tr><td>Rhodamin-Dextran</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>2 MDa, 10 mg/ml, Vascular staining</td></tr><tr><td>Ly6G-PE</td><td>Becton-Dickinson</td><td></td><td>clone 1A8, neutrophils staining</td></tr><tr><td>Stereotactic holder</td><td>Home made</td><td></td><td>surgery</td></tr><tr><td>Ethanol 70%</td><td></td><td></td><td>surgery</td></tr><tr><td>Sterile scissors and nippers</td><td></td><td></td><td>surgery</td></tr><tr><td>Rubber ring</td><td></td><td></td><td>18 mm diameter, surgery</td></tr><tr><td>Glubran 2</td><td>Queryo Medical</td><td></td><td>Surgical Glue, rubber ring fixation</td></tr><tr><td>Small gauge needles</td><td>Terumo</td><td></td><td>surgery</td></tr><tr><td>Zeiss LSM 710 NLO multiphoton microscope&amp;nbsp;</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Microscope</td></tr><tr><td>Ti:Sapphire crystal laser&amp;nbsp;</td><td>Coherent Chameleon Ultra</td><td></td><td>140 fsec pulses of NIR light</td></tr><tr><td>Zen 2010</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Acquistion Software</td></tr><tr><td>Imaris Bitplane&amp;nbsp;</td><td>Bitplane</td><td></td><td>Analysis Software, 3D automatic tracking</td></tr><tr><td>PBS 1X</td><td>D. Dutscher</td><td></td><td>surgery</td></tr><tr><td>Thermostated chamber</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>intravital imaging</td></tr></tbody></table>

tracking mouse bone marrow monocytes in vivo

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal environment. Biological activities of immune cells mainly rely on their motility capacities. Blood monocytes have short half-life in the bloodstream; they originate in the bone marrow and are constitutively released from it. In inflammatory condition, this process is enhanced, leading to blood monocytosis and subsequent infiltration of the peripheral inflammatory tissues. Identifying the biomechanical events controlling monocyte trafficking from the bone marrow towards the vascular network is an important step to understand monocyte physiopathological relevance. We performed in vivo time-lapse imaging by two-photon microscopy of the skull bone marrow of the Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP (MacBlue) mouse. The MacBlue mouse expresses the fluorescent reporters enhanced cyan fluorescent protein (ECFP) under the control of a myeloid specific promoter 1, in combination with vascular network labelling. We describe how this approach enables the tracking of individual medullar monocytes in real time to further quantify the migratory behaviour within the bone marrow parenchyma and the vasculature, as well as cell-to-cell interactions. This approach provides novel insights into the biology of the bone marrow monocyte subsets and allows to further address how these cells can be influenced in specific pathological conditions.

מבנה גולגולת עכבר מציע הזדמנות טובה ללמוד את הפיסיולוגיה מח עצם על ידי ההדמיה intravital. להיות רזה באזור הקדמי הקודקודית העצם, ניתן לקבל גישה לנישות medullar ללא שחיקה של העצם. איור 1 מייצג שדה 2D רחב של הגולגולת של עכבר מהונדס MacBlue. מטריצת העצם מורכבת בעיקר של קולגן אני בקלות לזיהוי על ידי SHG 19. הזרקה של rhodamin-dextran מכתימה את רשת כלי הדם של מח העצם ומאפשרת לזיהוי נישות מח עצם parenchymal בין מטריצת העצם וכלי 14. תאי ECFP מופצים בשני התאים של מח העצם, אך נעדרים ממטריצת העצם. מונוציטים מסווגים באופן ידני בהתאם למיקומם בתוך הרקמה. מונוציטים כלי דם מוגדר כאשר כל התא הוא בתוך כלי הדם, תוך התעלמות מהגודל של כלי השיט. רק venules איסוף הגדולה אינן נכללתnalysis. מונוציטים parenchymal מוגדר כאשר התא נמצא בין כלי הדם ומטריצת העצם. זמן לשגות הדמיה של אזור מסוים של עניין (וידאו משלים 1 ו -2) מאפשרת לחישוב מסלול תא הבודד לאורך זמן לאו כלי דם (איור 2 א) או parenchymal מונוציטים (איור 2). אורך המסלול מראה כי תצוגת מונוציטים parenchymal מופחתת עקירה לעומת מונוציטים כלי דם. ניתוח של העקירה לאורך הזמן משווה את המהירות הממוצעת של מונוציטים בשני התאים (איור 2 ג). העקירה מרובעת הממוצעת כפונקציה של הזמן היא מדד של המידה המרחבי של תנועה אקראית. מקדם תנועתיות נקבע על ידי השיפוע של חלק הליניארי של העקומה ומספק מושג טוב יותר של עקירת התא (ראה סעיף דיון). מקדם תנועתיות של מונוציטים כלי דם (MC = 71μm² / s) הוא גבוה יותר מאשר coefficie תנועתיותNT של מונוציטים parenchymal (MC = 4.4μm² / s). הרזולוציה של רכישת הזמן צריכה להיות מותאמת למהירות הממוצעת של התאים. מונוציטים כלי דם רולינג יכולים לעשות עקירה חשובה בתוך עיכוב זמן קצר. למעקב תא מדויק יותר, הפחתת המרווח של רכישת הזמן עדיף. איור 3 מציג איור של מעקב מונוציטים עם שני בזמן רזולוציות שונות. זמן מרווח של 30 שניות מפחית את הדיוק, כמו גם את אורכו של המסלולים (בקו מקווקו ירוק) בהשוואה לזמן מרווח 10 שניות. לבסוף, תרשים 4 מתאר את האפשרות לנתח משנה תא אחר במקביל למונוציטים. Ly6G הוא סמן ספציפי של נויטרופילים עכבר הבוגרים. ההזרקה של אנטי-Ly6G בשילוב עם fluorochrome (במקרה Phyco-erythrin זה) 5 דקות לפני נויטרופילים כתם רצף הדמיה ישירות in vivo. גישה זו מספקת עמומה נוספת<html> ension של ניתוח ואת האפשרות להשוות את ההתנהגות של תת תא השונים. גישה כזו יכולה לשמש להגדרה תת בתאי מונוציטים. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52476/52476fig1highres.jpg" /> איור 1. שדה רחב של ארגון מח עצם גולגולת. בתמונת vivo שני פוטונים סריקת לייזר מיקרוסקופי של מוח עצם מצב יציב גולגולת מעכבר MacBlue. כלי דם (באדום) מוכתמים על ידי הזרקה לשווא זנב של דקות 2MDa Rhodamin-Dextran 5 לפני פגישת הדמיה. העצם דמיין ידי דור השני הרמוני (כחולה). ECFP + מונוציטים (ציאן) ממוקמים בתוך נישות parenchymal (אזורים כהים בין כלי דם ועצם) ובתוך כלי הדם. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52476/52476fig1large.jpg" target="_blank">לוחצים כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> together.within-page = &quot;תמיד&quot;&gt; <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52476/52476fig2highres.jpg" /> מעקב בזמן אמת איור 2. תא. שבילי מסלול נציג לאורך הזמן של מונוציטים בתוך () בכלי הדם ו( B) parenchyma. מסלולים (קו ירוק) עבור כל תא נוצרים באופן אוטומטי על ידי התוכנה. כתמים אדומים מייצגים את מרכז מסה של תאי מעקב. (C) Mean השוואת מהירות בין מונוציטים כלי דם וparenchymal. ניתוח סטטיסטי מאן-ויטני בוצע, *** מייצג p &lt;0001. (ד) Mean עקירה בריבוע (MSD) כפונקציה של הזמן מיוצג על מונוציטים כלי דם וparenchymal. עקומת Asymptotic מציינת את העקירה המאולצת של התאים לאורך זמן, ואילו עקומה ליניארית מצביעה על הליכה אקראית בסביבה שאינה מוגבלת. מקדם תנועתיות מצביעה על מידת תזוזת תא והוא נקבע על ידי השיפוע של ג<html> urve מחושב על ידי רגרסיה ליניארית. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52476/52476fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52476/52476fig3highres.jpg" /> איור 3. ברזולוציה זמן מרווח במחקר של מונוציטים מתגלגלים. רצפי תמונת נציג מראה כי רזולוציה זמן מוגברת משפרת את הדיוק של מסלול התא מתגלגל. (עד) רצף תמונות במרווחי זמן של 10 שניות. (Down) רצף תמונות במרווחי זמן של 30 שניות. האיכות של נתיב המסלול משופר ואת הסיכון לשוקל שני תאים שונים לאותו או ההפך מצטמצם. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52476/52476fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <html> s &quot;&gt; <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/52476/52476fig4highres.jpg" /> איור 4. בשיתוף לוקליזציה vivo של נויטרופילים ומונוציטים medullar. נתון זה ממחיש את האפשרות לזיהוי תת תא אחר בגוף חי במקביל עם מונוציטים, על ידי הזרקת נוגדנים חד שבטיים מסוימים בשילוב עם fluorochrome. 2 מיקרוגרם של נוגדן Ly6G-PE כבר הזריק לוריד 5 דקות לפני ההדמיה מח עצם הגולגולת של עכבר MacBlue. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52476/52476fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> וידאו משלים 1. התנהגות נדידה של מונוציטים parenchymal. בvivo 3D הדמיה של פעילות נדידת המצב היציב של מונוציטים בparenchyma מח עצם גולגולת של עכבר MacBlue. אות ECFP + היא בצבע תכלת. נתיבי נדידה עבור כל תא (נקודה אדומה) מופיעים בירוק. = &quot;Jove_content&quot;&gt; התנהגות נדידת וידאו 2. משלימה של מונוציטים כלי דם. בvivo 3D הדמיה של פעילות נדידת המצב היציב של מונוציטים בכלי הדם במח עצם גולגולת של עכבר MacBlue. אות ECFP + היא בצבע תכלת. (2M &#160; Da) rhodamine-dextran הוזרק לפני פגישת ההדמיה להבחין בכלי הדם במח העצם (אדום). נתיבי נדידה עבור כל תא (נקודה אדומה) מופיעים בירוק.

Watch this Scientific Journal Video about Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo at JoVE.com

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Monocytes are key regulators of innate immunity and play a critical role in the renewal of the peripheral mononuclear phagocytic system and in case of inflammation. This manuscript describes the procedure of real time imaging of the mouse calvaria bone marrow to study the monocyte mobilisation mechanism.

מעקב עכבר מח עצם המונוציטים<em&gt; In vivo</em

Real time multiphoton imaging provides a great opportunity to study cell trafficking and cell-to-cell interactions in their physiological 3-dimensionnal ...

tracking-mouse-bone-marrow-monocytes-in-vivo

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

9.5K Views.  Sorbonne Universités, UPMC Univ Paris 06, CR7. Monocytes are key regulators of innate immunity and play a critical role in the renewal of the peripheral mononuclear phagocytic system and in case of inflammation. This manuscript describes the procedure of real time imaging of the mouse calvaria bone marrow to study the monocyte mobilisation mechanism. 

Video: Tracking Mouse Bone Marrow Monocytes In Vivo

Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or pathogenic effects depending on the inflammatory milieu. Nonetheless, despite the indispensable role of neutrophils in immunity, detailed understanding of the molecular factors that mediate neutrophils' effector and immunopathogenic effects in different infectious diseases and inflammatory conditions is still lacking, partly because of their short half life, the difficulties with handling of these cells and the lack of reliable experimental protocols for obtaining sufficient numbers of neutrophils for downstream functional studies and adoptive transfer experiments. Therefore, simple, fast, economical and reliable methods are highly desirable for harvesting sufficient numbers of mouse neutrophils for assessing functions such as phagocytosis, killing, cytokine production, degranulation and trafficking. To that end, we present a reproducible density gradient centrifugation-based protocol, which can be adapted in any laboratory to isolate large numbers of neutrophils from the bone marrow of mice with high purity and viability. Moreover, we present a simple protocol that uses CellTracker dyes to label the isolated neutrophils, which can then be adoptively transferred into recipient mice and tracked in several tissues for at least 4 hr post-transfer using flow cytometry. Using this approach, differential labeling of neutrophils from wild-type and gene-deficient mice with different CellTracker dyes can be successfully employed to perform competitive repopulation studies for evaluating the direct role of specific genes in trafficking of neutrophils from the blood into target tissues in vivo.

We describe a protocol for isolation and purification of neutrophils from mouse bone marrow by density gradient centrifugation and for neutrophil labeling using CellTracker dyes. This represents a simple, fast, reproducible and economical method for obtaining large numbers of neutrophils for downstream functional studies or adoptive transfer and tracking experiments.

בידוד, טיהור וסימון של נויטרופילים מח עצם עכבר ללימודים פונקציונליים וניסויי העברת מאמצת

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of various fields in biomedical science. The method described below is a simple and effective way to isolate murine monocytes from heterogeneous bone marrow.
Bone marrow from the femur and tibia of Balb/c mice is harvested by flushing with phosphate buffered saline (PBS). Cell suspension is supplemented with macrophage-colony stimulating factor (M-CSF) and cultured on ultra-low attachment surfaces to avoid adhesion-triggered differentiation of monocytes. The properties and differentiation of monocytes are characterized at various intervals. Fluorescence activated cell sorting (FACS), with markers like CD11b, CD115, and F4/80, is used for phenotyping. At the end of cultivation, the suspension consists of 45%&#177; 12% monocytes. By removing adhesive macrophages, the purity can be raised up to 86%&#177; 6%. After the isolation, monocytes can be utilized in various ways, and one of the most effective and common methods for in vivo delivery is intravenous tail vein injection. 
This technique of isolation and application is important for mouse model studies, especially in the fields of inflammation or immunology. Monocytes can also be used therapeutically in mouse disease models.

Here we present a protocol that generates large amounts of murine monocytes from heterogeneous bone marrow for translational applications. In comparison to others, this new method helps reduce the number of sacrificed animals and lowers costs by avoiding expensive methods such as high gradient magnetic cell separation (MACS).

המונוציטים בידוד והזרקה תוך ורידית של Murine מח העצם נגזר

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Femoral Bone Marrow Aspiration in Live Mice

Serial sampling of the cellular composition of bone marrow (BM) is a routine procedure critical to clinical hematology. This protocol describes a detailed step-by-step technical procedure for an analogous procedure in live mice which allows for serial characterization of cells present in the BM. This procedure facilitates studies aimed to detect the presence of exogenously administered cells within the BM of mice as would be done in xenograft studies for instance. Moreover, this procedure allows for the retrieval and characterization of cells enriched in the BM such as hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) without sacrifice of mice. Given that the cellular composition of peripheral blood is not necessarily reflective of proportions and types of stem and progenitor cells present in the marrow, procedures which provide access to this compartment without requiring termination of the mice are very helpful. The use of femoral bone marrow aspiration is illustrated here for cytological analysis of marrow cells, flow cytometric characterization of the hematopoietic stem/progenitor compartment, and culture of sorted HSPCs obtained by femoral BM aspiration compared with conventional marrow harvest.

This protocol describes a procedure for serial sampling of femoral bone marrow (BM) without requiring the sacrifice of mice. This procedure facilitates longitudinal studies of the BM composition of mice over time and provides serial access to cells within the BM for ex vivo and transplantation studies.

הירך מח עצם שאיפה בעכברים חיים

Serial sampling of the cellular composition of bone marrow (BM) is a routine procedure critical to clinical hematology. This protocol describes a detailed ...

Medicine

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in vivo is crucial for understanding the molecular basis of leukocyte transendothelial migration and interaction with vascular endothelium. One powerful approach involves intravital microscopy on transgenic mice expressing fluorescent proteins in cells of interest.
Here we present a protocol for imaging monocytes and neutrophils in the CX3CR1gfp/wt mouse i.v. injected with orange dye-labeled neutrophils with an inverted confocal microscope. Time-lapse movies gathered from 30 min&#160;to several hours of imaging allow the analysis of leukocyte behavior in mesenteric veins under both steady state and inflammatory conditions. We also describe the steps to locally induce blood vessel inflammation with TLR2/TLR1 agonist Pam3SK4 and monitor the subsequent recruitment of neutrophils and monocytes.
The presented technique can also be used to monitor other populations of leukocytes and investigate molecules implicated in leukocyte recruitment or trafficking using other stimuli or transgenic mice.

We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

הדמיה נויטרופילים ומונוציטים בmesenteric ורידים על ידי מיקרוסקופית Intravital על עכברים מורדמים בזמן אמת

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, including hematopoiesis, immune regulation and tumor regulation. Commonly used methods for understanding cellular actions in the bone marrow, such as histology and blood counts, provide static information rather than capturing the dynamic action of multiple cellular components in vivo. To complement the standard methods, a window chamber (WC)-based model was developed to enable serial in vivo imaging of cells and structures in the murine bone marrow. This protocol describes a surgical procedure for installing the WC in the femur, in order to facilitate long-term optical access to the femoral bone marrow. In particular, to demonstrate its experimental utility, this WC approach was used to image and track neutrophils within the vascular network of the femur, thereby providing a novel method to visualize and quantify immune cell trafficking and regulation in the bone marrow. This method can be applied to study various biological processes in the murine bone marrow, such as hematopoiesis, stem cell transplantation, and immune responses in pathological conditions, including cancer.

Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

The protocol describes a novel murine femur window chamber model that can be used to track movement of cells in the femoral bone marrow in vivo. Intravital multiphoton fluorescence microscopy is used to image three components of the femoral bone marrow (vasculature, collagen matrix, and neutrophils) over time.

חלון ירך דגם קאמרי<em&gt; In vivo</em&gt; מעקב תא Murine מח עצם

Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, ...

An In Vivo Mouse Model to Measure Na&#239;ve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells

Quantification of na&#239;ve CD4 T cell activation, proliferation, and differentiation to T helper 1 (Th1) cells is a useful way to assess the role played by T cells in an immune response. This protocol describes the in vitro differentiation of bone marrow (BM) progenitors to obtain granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) derived-dendritic cells (DCs). The protocol also describes the adoptive transfer of ovalbumin peptide (OVAp)-loaded GM-CSF-derived DCs and na&#239;ve CD4 T cells from OTII transgenic mice in order to analyze the in vivo activation, proliferation, and Th1 differentiation of the transferred CD4 T cells. This protocol circumvents the limitation of purely in vivo methods imposed by the inability to specifically manipulate or select the studied cell population. Moreover, this protocol allows studies in an in vivo environment, thus avoiding alterations to functional factors that may occur in vitro and including the influence of cell types and other factors only found in intact organs. The protocol is a useful tool for generating changes in DCs and T cells that modify adaptive immune responses, potentially providing important results to understand the origin or development of numerous immune associated diseases.

Here, we present a protocol for the in vivo determination of na&#239;ve CD4 T cell (T cell) activation, proliferation, and Th1 differentiation induced by GM-CSF bone marrow (BM)-derived dendritic cells (DCs). In addition, this protocol describes BM and T-cell isolation, DC generation, and DC and T-cell adoptive transfer.

מודל העכבר In Vivo הפעלת תא T CD4 תמים מידה, התפשטות של בידול Th1 הנגרם על ידי תאים דנדריטים הנגזרות מח עצם

Quantification of na&#239;ve CD4 T cell activation, proliferation, and differentiation to T helper 1 (Th1) cells is a useful way to assess the role played ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a myeloid-biased 39-antibody CyTOF panel to evaluate the hematopoietic system with a focus on the neutrophil-lineage cells by using this protocol. The CyTOF result was analyzed with an open-resource dimensional reduction algorithm, viSNE, and the data was presented to demonstrate the outcome of this protocol. We have discovered new neutrophil-lineage cell populations based on this protocol. This protocol of fresh whole BM preparation may be used for 1), CyTOF analysis to discover unidentified cell populations from whole BM, 2), investigating whole BM defects for patients with blood disorders such as leukemia, 3), assisting optimization of fluorescence-activated flow cytometry protocols that utilize fresh whole BM.

Here, we present a protocol to process fresh bone marrow (BM) isolated from mouse or human for high-dimensional mass cytometry (Cytometry by Time-Of-Flight, CyTOF) analysis of neutrophil-lineage cells.

הכנת מח עצם שלם לניתוח המוני Cy, לטיפול בניופיל-תאי השושלת

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

במעקב 4 ממדי Vivo של תאי גזע ואבות היווצרות דם במבוגרי עכבר calvarial מח עצם

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Biology

<meta charset="utf8"></head><body>הזרקה תוך עצם הירך לחקר מח עצם בעכברים חיים

Simplified Intrafemoral Injections Using Live Mice Allow for Continuous Bone Marrow Analysis

Despite the complexity of hematopoietic cell transplantation in humans, researchers commonly perform intravenous or intrafemoral (IF) injections in mice. In murine models, this technique has been adapted to enhance the seeding efficiency of transplanted hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs). This paper describes a detailed step-by-step technical procedure of IF injection and the following bone marrow (BM) aspiration in mice that allows for serial characterization of cells present in the BM. This method enables the transplantation of valuable samples with low cell numbers that are particularly difficult to engraft by intravenous injection. This procedure facilitates the creation of xenografts that are critical for pathological analysis. While it is easier to access peripheral blood (PB), the cellular composition of PB does not reflect the BM, which is the niche for HSPCs. Therefore, procedures providing access to the BM compartment are essential for studying hematopoiesis. IF injection and serial BM aspiration, as described here, allow for the prospective retrieval and characterization of cells enriched in the BM, such as HSPCs, without sacrificing the mice.

<meta charset="utf8"></head><body>הזרקות תוך עצם הירך הפשוטות באמצעות עכברים חיים מאפשרות ניתוח רציף של מח עצם

This protocol describes the intrafemoral injection of a few hematopoietic or leukemic stem cells, including gene-edited cells, in murine xenograft models, which will not only enable the quick and safe transplantation of cells but also serial analyses of the bone marrow.

הזרקות תוך עצם הירך הפשוטות באמצעות עכברים חיים מאפשרות ניתוח רציף של מח עצם

Despite the complexity of hematopoietic cell transplantation in humans, researchers commonly perform intravenous or intrafemoral (IF) injections in mice. ...

מעקב עכבר מח עצם המונוציטים

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

בידוד, טיהור וסימון של נויטרופילים מח עצם עכבר ללימודים פונקציונליים וניסויי העברת מאמצת

המונוציטים בידוד והזרקה תוך ורידית של Murine מח העצם נגזר

הירך מח עצם שאיפה בעכברים חיים

הדמיה נויטרופילים ומונוציטים בmesenteric ורידים על ידי מיקרוסקופית Intravital על עכברים מורדמים בזמן אמת

חלון ירך דגם קאמרי

מודל העכבר In Vivo הפעלת תא T CD4 תמים מידה, התפשטות של בידול Th1 הנגרם על ידי תאים דנדריטים הנגזרות מח עצם

הכנת מח עצם שלם לניתוח המוני Cy, לטיפול בניופיל-תאי השושלת

במעקב 4 ממדי Vivo של תאי גזע ואבות היווצרות דם במבוגרי עכבר calvarial מח עצם

הזרקות תוך עצם הירך הפשוטות באמצעות עכברים חיים מאפשרות ניתוח רציף של מח עצם

הזרקות תוך עצם הירך הפשוטות באמצעות עכברים חיים מאפשרות ניתוח רציף של מח עצם